عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية مع نمط ظاهري مناعي المحفوظة وظيفة من الفئران حديثي الولادة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من حديثي الولادة من الفئران. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق التشريح المجهري لأنسجة الدماغ القشرية من حديثي الولادة من الفئران. تتمثل الخطوة الثانية في زراعة مستنبتات خلوية دبقية مختلطة لمدة تتراوح من 17 إلى 21 يوماً في المختبر (in vitro).

بعد ذلك، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من هذه المزارع الدبقية المختلطة. والخطوة النهائية هي استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة في أطباق زراعة الخلايا لإجراء المزيد من التجارب. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفلوري المناعي واختبار Eliza لإثبات أن بروتوكول العزل هذا يحافظ على النمط الظاهري المناعي والوظيفة الخاصة بالخلايا الدبقية الصغيرة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تنفيذ خطوات (SEP) المتضمنة في التشريح الدقيق. ويتطلب التنفيذ الناجح لهذا الإجراء السرعة والدقة معاً؛ حيث إن البطء في التنفيذ سيؤدي إلى تقليل حصيلة الخلايا المستخلصة، بينما سيؤدي عدم الإزالة الكاملة للسحايا إلى تلوث المزرعة الدبقية وإعاقة نمو الخلايا الدبقية.

ابدأ بتحضير الوسط الغذائي الكامل للخلايا الدبقية الصغيرة، والذي سيشار إليه فيما يلي باسم MCM. قم بتحضير دورق واحد لكل جرو واحتضنها لمدة ساعة واحدة على الأقل. تعتبر خطوة التوازن هذه ضرورية لضمان النجاح.

بعد ذلك، قم بتحضير العينات الموزعة وتبريدها على الثلج. بالنسبة لجميع الأوساط المطلوبة، قم بتوزيع 6 mL من وسط MCM لكل جرو وتدفئتها في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C قبل البدء في عملية التشريح. قم بتطهير محطة العمل ذات التدفق الهوائي الأفقي ومجهر التشريح باستخدام ethanol بتركيز 70%.

ضع بعد ذلك الأدوات الجراحية المعقمة اللازمة للإجراء في منطقة العمل. جهز طبقاً معقماً يحتوي على وسط تشريحي لالتقاط الرأس وطبقاً آخر للتشريح. صب وسط الفرم في طبق خاص لفرم أنسجة الدماغ.

بعد عملية قطع الرأس واستخراج الدماغ، ضع الدماغ المعزول حديثاً تحت مجهر تشريحي لمعاينة البنى التشريحية، مع الحرص على إبقاء الجانب الظهري للأعلى وجافاً. قم بتثبيت الدماغ عن طريق إدخال طرفي ملقط في نقطة التقاء الدماغ المتوسط والقشرة المخية. وبمجرد تثبيته، قم بإزالة السحايا القشرية الظهرية بالكامل.

بعد ذلك، قم بإزالة السحايا البطنية لزيادة نقاء وحصيلة الخلايا الدبقية الصغيرة إلى أقصى حد. من الضروري إزالة جميع أنسجة السحايا تماماً. افصل القشرتين عن بقية الدماغ.

تأكد من إزالة أي بقايا للسحايا القشرية التي قد تكون موجودة على الجانب البطني أو الإنسي للقشور. بعد إزالة الأنسجة السحائية، ضع القشور في وعاء الفرم الذي تم تجهيزه مسبقاً. وباستخدام مقص، قم بفرم أنسجة الدماغ أثناء العمل داخل خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية.

انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوبة مخروطية سعة 15 مليمتر. اشطف كلًا من المقص وصحن الفرم بـ 1 ملليمتر من وسط الفرم لتعظيم العائد. اجمع هذه الشطفات وأضفها إلى الأنبوبة المخروطية سعة 15 مليمتر التي تحتوي على الأنسجة المفرومة.

اترك معلق الأنسجة دون تحريك لمدة دقيقة إلى دقيقتين، للسماح للأنسجة المفرومة بالترسب في قاع الأنبوب. بعد هذه المدة، قم بإزالة والتخلص من 2 mL من السائل الطافي بعناية، مع الحرص على عدم تعكير الأنسجة المفرومة المترسبة. أضف 3 mL من وسط MCM الذي تم تدفئته مسبقاً إلى الأنسجة المفرومة، ثم قم بتفتيت الأنسجة بقوة.

يجب ألا يتبقى أي نسيج صلب ملحوظ عند اكتمال عملية التقطيع بواسطة المخرقة. أضف ثلاثة مللي لترات أخرى من MCM باستخدام طرف الماصة نفسه لجمع عينة النسيج المفروم المتبقية من الطرف. وبمجرد جمعها، قم بطرد النسيج المفروم مركزياً لترسيب الخلايا.

عند الانتهاء، أعد الخلايا المترسبة إلى كابينة السلامة البيولوجية. قم بإزالة السائل الطافي بعناية والتخلص منه. أعد تعليق الخلايا بلطف.

علّق كتلة الخلايا باستخدام 2 mL من وسط MCM الدافئ، ثم أضف معلق إعادة تعليق الخلايا إلى الدورق الذي تم تحضيره مسبقاً. حضّن الخلايا لمدة 24 ساعة. وبعد مرور 24 ساعة، انقر برفق على الدورق براحة اليد لتفكيك حطام الأنسجة.

افحص الخلايا قبل وبعد النقر للتأكد من إزالة الحطام تماماً. بعد ذلك، استبدل الوسط بوسط MCM طازج وأعد القارورة إلى الحاضنة. افحص الخلايا يومياً لمراقبة النمو والتلوث.

بعد مرور 17 إلى 21 يوماً تقريباً، ستكون الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للحصاد. ولتحديد ما إذا كانت الخلايا جاهزة، افحصها باستخدام مجهر تباين الطور المقلوب. تكون الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للحصاد عندما تصل نسبة التلاقي (confluency) إلى 40% تقريباً، حيث تظهر كخلايا كروية صغيرة ولامعة تنمو كطبقة واحدة فوق بعضها البعض.

لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة، يُنقر بقوة على الدورق مقابل طاولة المختبر. يساعد هذا التحريك على فصل الخلايا الدبقية الصغيرة عن الخلايا الدبقية الأخرى نظرًا لخصائص الالتصاق المنخفضة التي تتميز بها الخلايا الدبقية الصغيرة. تُغلق أغطية الدوارق باستخدام البارافورم، وتُدوّر مستنبتات الخلايا الدبقية المختلطة باستخدام هزاز دوراني غير مرطب يتم التحكم في درجة حرارته لمدة خمس ساعات.

بعد مرور هذا الوقت، افحص بصرياً ما إذا كانت الخلايا الدبقية الصغيرة قد انفصلت عن سطح الفلاسک. عند استخدام مجهر تباين الطور المقلوب، تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة كخلايا كروية ساطعة وسابحة بحرية. ستكون هناك طبقة متبقية من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن ملتصقة بقاع الفلاسک.

بعد ذلك، يتم جمع السائل الطافي الذي يحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم وترسيبه. يتم إعادة تعليق كتلة الخلايا الدبقية الصغيرة في وسط نمو دافئ خاص بالخلايا الدبقية الصغيرة وتحديد تركيز الخلايا باستخدام شريحة عد الخلايا (hemo cytometer). يتم توزيع الخلايا على طبق بـ 24 بئرًا بتنسيق بلاستيكي أو على شرائح زجاجية غطائية معقمة، ثم تُترك لمدة 24 ساعة.

استبدل الوسط بمستنبت MGM دافئ وطازج لإزالة الخلايا العائمة والحطام. هذه الخطوة حاسمة لبقاء الخلايا وللحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة السكون، وتكون الخلايا الدبقية الصغيرة جاهزة للتجريب مباشرة بعد خطوة إعادة التغذية هذه لتقييم نقاء الخلايا الدبقية الصغيرة. تم صبغ المزارع الخلوية المشتقة من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تعبر داخلياً عن GFP باستخدام مستضد البلاعم IBA one مع صبغ مضاد بـ dapi.

من أجل تصور نواة الخلية، أظهرت أكثر من 95% من الخلايا تموضعاً مشتركاً لـ GFP IBA one و dpi. وبعد تحفيز الخلايا باستخدام LPS، اتخذت الخلايا الدبقية الصغيرة تغييراً شكلياً واضحاً من النمط الظاهري ثنائي القطب الصغير إلى شكل يشبه الأميبا. وأثبت الصبغ الكيميائي النسيجي المناعي لـ P 65 أن P 65 يتوزع بشكل منتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم في الظروف الطبيعية.

وبينما أدى التعرض لـ Pam P 65 لمدة ساعتين إلى انتقال التفاعلية المناعية بشكل كبير نحو نواة الخلية، وذلك لتأكيد احتفاظ الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة بوظائفها الكيميائية الحيوية المناعية. كما تم تحديد إفراز السيتوكين المسبب للالتهاب TNF alpha بعد التعرض لـ PAM أو LPS. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الخلايا الدبقية الصغيرة القشرية من مواليد الفئران حديثة الولادة للحصول على أفضل النتائج.

من المهم الحفاظ على التقنية المعقمة وإزالة الأنسجة السحائية تماماً من المنطقة القشرية التي تم تشريحها.