رصد التغيرات في غشاء التقاطب، غشاء النزاهة، وبين الخلايا ايون التركيزات في العقدية الرئوية استخدام الأصباغ نيون

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام الأصباغ الفلورية لمراقبة التغيرات في ديناميكيات الغشاء وتركيزات الأيونات داخل الخلايا في النظام البكتيري. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان البكتيريا أولا خلال مرحلة نموها بالفلور محل الاهتمام حتى يتم توازنه عبر أغشيتها. بعد ذلك ، تتم معالجة البكتيريا بالعامل المفضل ومراقبة تألقها.

يمكن أن تظهر النتائج تغيرات في إزالة الاستقطاب الغشائي ، وسلامة الغشاء ، وتركيزات الأيونات داخل الخلايا بناء على التغيرات الملحوظة في مضان أصباغ المؤشر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على تقنيات الفيزيولوجيا الكهربية التقليدية مثل لقط الرقعة المستخدمة في أنظمة حقيقية النواة هي أنه يمكن الآن مراقبة التغيرات في ديناميكيات الغشاء وتركيزات الأيونات داخل الخلايا في البكتيريا باستخدام الفلورسنت. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن الأمر يتطلب بعض الجهد لتحسين تركيزات الصبغة.

ظروف التحميل وإعدادات الكشف ابدأ بالخلايا البكتيرية. فقط تكوير في محلول الغسيل أولا إعادة تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد على الأقل من PBS ل 100 مليون CFU لكل مليلتر ، وهو ما يكفي لخمس عينات. انقل ملليلترا واحدا من الخلايا المغسولة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 25 ميكرولترا من مرشح مولي واحد.

يحتضن محلول مخزون الجلوكوز المعقم الخلايا في كتلة تسخين 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قد يختلف الجلوكوز المضاف بناء على التجربة. بعد 15 دقيقة ، أضف خمسة ميكرولترات من الموت الارتجاعي 50 ميكرومولار ، و 10 ميكرولتر من محلول PI.

امزج الخلايا جيدا عن طريق سحب ماصاتها لأعلى ولأسفل عدة مرات. ثم قسم تعليق الخلية هذا إلى خمسة آبار عينة من صفيحة 96 بئر واضحة. قم بتحميل اللوحة في مجموعة قارئ لوحة مسبقة التسخين للكشف عن NP الموت.

الآن راقب توازن الموت على أغشية الخلايا عن طريق أخذ القياسات مرة واحدة في الدقيقة على مدى 30 إلى 40 دقيقة حتى تستقر القراءة على قيمة المعالجة المسبقة. ثم أخرج اللوحة وأضف العامل التجريبي المفضل. أعد اللوحة على الفور إلى القارئ واستمر في مراقبة الموت الارتجاعي وتألق PI للمدة الزمنية المطلوبة.

عند إعداد المخزن المؤقت للتحميل لهذا الإجراء ، تأكد من تدويره لفترة وجيزة قبل إضافة PBS و Probenecid. بعد إضافة هذه المحاليل ، قم بدوامها مرة أخرى ولفها بورق الألمنيوم إلى مليلتر واحد من تعليق خليتين x. أضف مليلتر واحد من اثنين × المخزن المؤقت للتحميل.

هذا يكفي ل 10 عينات. احتضان المزيج في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 75 دقيقة ، محمي من الضوء في جميع هذه الفحوصات. قد يحتاج تركيز الصبغة ووقت الحضانة إلى التعديل لتحسين الفحص ومستوى الكشف عن التألق الأساسي ، اعتمادا على الأنواع البكتيرية المحددة ومتغيرات النظام التجريبي الأخرى.

بعد الحضانة ، اغسل الخلايا ثلاث مرات لكل غسلة. بيليه الخلايا في 2 ، 400 Gs لمدة 10 دقائق وأعد تعليقها في ملليلترين من PBS تحتوي على واحد x pronic. بعد الغسيل الثلاث ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.

يتيح ذلك للإسترو داخل البكتيريا التحلل المائي لمجموعات الإستر من الصبغة ، مما يجعل الصبغة نشطة داخل الخلية. الحبيبات التالية ، تقوم الخلايا بإزالة snat وتعليقها في ملليلترين من PBS تحتوي على واحد x Probenecid. إذا لزم الأمر ، يمكن الآن إضافة الجلوكوز مرة أخرى لإعادة تنشيط البكتيريا التي تحمل 200 ميكرولتر من الخلايا في بئر واحد من صفيحة 96 جيدا لكل عينة وتحميل اللوحة في قارئ التسخين المسبق في عينة واحدة.

حسنا ، قم أولا بإنشاء قراءة خط الأساس بالأطوال الموجية المناسبة وبمعدل قراءة واحدة في الثانية لمدة دقيقة واحدة. ثم قم بإزالة اللوحة وأضف حوالي خمسة ميكرولترات من العلاج المفضل. إلى ذلك.

حسنا ، قم بتقطيع الماصة بسرعة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلطها في العلاج وإعادة اللوحة على الفور إلى القارئ. استمر في أخذ القياسات للوقت المطلوب. لتحليل البيانات ، احسب نسبة قيم الفلورسنت لكل نقطة زمنية بقسمة القيمة ، واحد على القيمة اثنتين ، وارسم قيم النسبة على الرسم البياني.

أثناء التحضير ، قم بإنشاء مجموعة من خمسة أو ستة مخازن عالية البوتاسيوم بقيم الأس الهيدروجيني من 6.5 إلى 8.0. كما في الإجراء السابق ، استخدم دوامة لإعداد المخزن المؤقت للتحميل من مزرعة منتصف مرحلة السجل لغسل الخلايا وتركيزها. ثم استبدل SNAT بملليلترين من BS لعمل تعليق بأربعة خلايا x.

اجمع بين مليلتر واحد من نظام التعليق ذو الخلايا الأربعة x مع مليلتر واحد من مخزن التحميل الثنائي. الآن احتضان الخلايا في حمام مائي 30 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة. احميها من الضوء.

الآن اغسل الخلايا ثلاث مرات. بيليه الخلايا كما هو موضح سابقا. أضف أربعة ملليلتر من PBS يحتوي على اثنين x دعامة بنين ، وجلوكوز مليمولار واحد وكرر الطرد المركزي بعد الغسلات الثلاثة.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أخرى. لتحديد مرشح مضان الخلفية ، قم بتعقيم حوالي 500 ميكرولتر من المعلق البكتيري المنشط لإزالة البكتيريا. ثم انقل 200 ميكرولتر من المرشح إلى صفيحة 96 بئر وقم بقياس الامتصاص من تلك البئر لمدة دقيقة.

للحصول على منحنى معايرة في الجسم الحي ، قم بتدوير 500 ميكرولتر ALI واط من الخلايا المحملة والنشطة وإعادة الضغط. قم بتعليقها في سلسلة من المخازن المؤقتة عالية البوتاسيوم ذات الأس الهيدروجيني المختلف لكل عينة ، أضف 20 ميكرومولار من الزينة. هذا يوازن درجة الحموضة داخل الخلايا للخلايا مع درجة الحموضة للمخزن المؤقت المحيط.

ثم احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة ، انقل العينات إلى لوحة 96 Well في قارئ اللوحة. قم بقياس تألق كل عينة لبضع دقائق لإنشاء قراءة دراسة لكل منها. حسنا.

لتحليل هذه البيانات ، اطرح قيم مضان الخلفية ، ثم احسب نسبة قيم التألق بقسمة القيمة. واحدا بالقيمة الثانية ، ارسم قيم النسبة لكل مخزن مؤقت للأس الهيدروجيني لإنشاء منحنى المعايرة لقياس التغيرات في الأس الهيدروجيني داخل الخلايا. قم بتحميل 200 ميكرولتر من الخلايا المنشطة في صفيحة وقم بقياس التألق كل خمس ثوان لمدة خمس دقائق.

في الوقت نفسه ، أضف 10 ميكرومولار CCCP إلى عينة واحدة مع إضافة العوامل ذات الأهمية إلى العينات الأخرى. CCCP هو تحكم إيجابي يتماشى مع الوقت لتقليل الأس الهيدروجيني داخل الخلايا. أعد اللوحة على الفور إلى القارئ واستمر في قياس التألق كل خمس ثوان لمدة 10 دقائق.

كعنصر تحكم إضافي ، أضف 20 ضرسا صغيرا NI حامية إلى جميع العينات لموازنة درجة الحموضة للبكتيريا مع المخزن المؤقت لمدة خمس دقائق أخرى. عند استكشاف قطبية الغشاء ، تحتاج البكتيريا إلى التحضين مع الموت مرة أخرى لمدة 40 دقيقة تقريبا للسماح للصبغة بالتوازن فوق الغشاء. يشار إلى ذلك من خلال الانخفاض المطرد في التألق الذي ينخفض المستوى.

لا يتطلب PI التوازن ، ولكن إلى جانب الموت ، فهو مفيد لمراقبة تمزق الغشاء. بالتزامن مع القطبية ، يشار إلى إزالة الاستقطاب وتمزق البكتيريا من خلال ارتفاع شدة الفلورسنت لكلتا الصبغتين لأقل من 2:00 صباحا ، يتم حساب نسبة إشارتين الفلورية وتتوافق الزيادة أو النقصان في هذه النسبة مع الكالسيوم داخل الخلايا. بالنسبة ل PBFI am ، يتم قياس البوتاسيوم داخل الخلايا بنسب التألق.

يتم قياس الهيدروجين داخل الخلايا باستخدام نسب التألق ل B-C-E-C-F am. عند إضافة الكالسيوم أيونو ، يتدفق الكالسيوم بأربعة أيونات ، مما يؤدي إلى زيادة نسبة التألق. إضافة فالمي له تأثير معاكس يتسبب في تدفق البوتاسيوم خارج الخلية ، والذي يشار إليه من خلال انخفاض نسبة التألق.

يسمح B-C-E-C-F بقياس منحنيات المعايرة الأولى داخل الخلايا في مخازن مختلفة من الأس الهيدروجيني المعروف. يتوافق انخفاض نسبة التألق في الصبغة مع انخفاض في درجة الحموضة. يظهر هذا مع إضافة بروتون القوة CCCP ، الخط الأسود ، وبعد إضافة مبتت القوة الدافعة للبروتون الخط الأزرق.

يظهر السهم الثاني إضافة النيسين ، الذي يوازن تركيزات الهيدروجين داخل الخلايا وخارجها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس إزالة الاستقطاب الغشائي ، وسلامة الغشاء ، وتركيزات الأيونات داخل الخلايا في الخلايا البكتيرية. يجب أن تكون قادرا أيضا على استخدام هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لدراسة الخصائص الأخرى والخلايا البكتيرية.