هندسة المستندة إلى الليفين يبني الأنسجة من Myofibroblasts وتطبيق القيود والضغط للحث على تنظيم الخلايا والكولاجين (إعادة)

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء تركيبات قائمة على الفيبرين يمكن استخدامها لدراسة إعادة تنظيم الخلايا والكولاجين. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الخلايا الصافنة الوريدية البشرية أولا عن أنسجة المتبرع وتوسيعها في الثقافة. الخطوة الثانية هي لصق شرائط الفيلكرو على أغشية مرنة.

في الجزء السفلي من ستة ألواح بئر لإنشاء مساحة مربعة في الوسط ، والتي ستحمل البناء. بعد ذلك ، يضاف خليط من خلايا الثرومبين الفيبرينوجين والخرز المصنف بالفلورسنت إلى الفراغ بين شرائط الفيلكرو ويسمح له بالبلمرة لتشكيل مادة هلامية. تتمثل الخطوة الأخيرة في تكييف الخلايا والحث على تكوين مصفوفة موجهة عن طريق تطبيق إما إجهاد دوري أحادي المحور على البناء أو عن طريق إطلاق سلالة ثابتة.

عن طريق تقليم هلام الفيبرين من أعمدة الفيلكرو في اتجاه واحد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تصف التغيرات في إعادة التنظيم الخلوي والكولاجين من خلال مراقبة التركيبات بمرور الوقت باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إعادة تشكيل الكولاجين المتعلقة بسرعة تكوين الكولاجين وإعادة توجيهه بواسطة أنواع الخلايا المختلفة.

للبدء ، احصل على أنسجة متبرع بشري من سانا ماجنا الوريدية وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الثانوي للمواد. ثم اعزل الخلايا الصافنة الوريدية البشرية أو H VSCs من الأنسجة باتباع بروتوكول Schnell et al ، وتخزينها في النيتروجين السائل. عند الحاجة ، قم بتوسيع الخلايا عن طريق وضع قارورة واحدة تحتوي على 250،000 H VSCs سريعة الذوبان في قارورة T 75 مع 15 مل من النمو الدافئ.

متوسط يتكون من 440 مل من DMEM المتقدم 50 مل من مصل الأبقار الجنينية. خمسة ملليلتر من 100 × بكتيريا القلم وخمسة ملليلتر من 200 مللي مولار لتر glut كحد أقصى. قم بتغيير وسط النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام لمدة أسبوعين تقريبا حتى تتلاقى الخلايا.

بمجرد التقاء ، قم بحصاد الخلايا وتقسيمها حتى المرور. تسعة. استخدام التربسين حتى يكون هناك عدد كاف من الخلايا للتجربة المخطط لها. مطلوب ما يقرب من 1.5 مليون خلية لكل بناء.

عندما يتم زراعة عدد كاف من الخلايا ، قم بحصادها بنسبة 90٪ من الطلاقة المشتركة ثم قم بتعليق الخلايا في وسط النمو عند 15 مليون خلية لكل مليلتر. ضعها على الثلج حتى الحاجة إليها. تحضير غراء السيليكون عن طريق خلط المطاط الصناعي وعامل المعالجة بنسبة 10 إلى واحد.

استخدم هذا الغراء لإرفاق سبعة ملليمترات في ثلاثة مليمترات شرائط تم التقاطها من الجانب الناعم من الفيلكرو إلى الغشاء المرن لألواح الخلايا المرنة. لتشكيل شكل متقاطع بمركز مفتوح ، جفف غراء السيليكون طوال الليل في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لضمان تصلب الغراء. ثم قم بتعقيم اللوحة عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من 70٪ من الإيثانول إلى كل بئر واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

شطف الآبار ثلاث مرات مع PBS معقمة. ثم قم بإزالة PBS من الآبار وشرائط الفيلكرو. ضع اللوحة مكشوفة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لغطاء مزرعة الأنسجة لمدة 30 دقيقة لتعقيم الأسطح.

بمجرد الانتهاء ، قم بتغطية الطبق واحتفظ به معقما حتى الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد وسط هندسة الأنسجة عن طريق إضافة 130 ملليغرام من حمض الأليك ، واثنين من الفوسفات إلى 500 مل من وسط النمو خلال الأيام السبعة الأولى من الزراعة. أيضا ، أضف ملليغراما واحدا لكل مليلتر من حمض الإبسيلون أمينوكابرويك لمنع الفيبرين من التحلل ، قم بإذابة الفيبرينوجين إلى تركيز 10 ملليغرام من البروتين الفعلي لكل مليلتر من هندسة الأنسجة متوسط مكمل بحمض أمينوكابرويك عن طريق الخلط برفق.

ثم معقمة. قم بتصفية محلول الفيبرينوجين من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون وقم بتخزينه على الثلج حتى الاستخدام. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول الثرومبين عن طريق تخفيف الثرومبين إلى تركيز نهائي قدره 10 وحدات دولية لكل مليلتر في وسط هندسة الأنسجة المكمل بحمض الأمينوكابرويك وتخزينه على الثلج حتى الاستخدام.

في المكان التالي ، تم تحضير 100 ميكرولتر من معلق الخلية مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق لكل بنية نسيجية سيتم تصنيعها. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 مرة G لمدة سبع دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول الثرومبين وأضف أربعة ميكرولترات ، وهي كريات مجهرية من البوليسترين الفلوري الأزرق لاستخدامها كعلامات مرجعية داخلية. بعد ذلك ، اسحب 50 ميكرولترا من محلول الفيبرينوجين في طرف ماصة.

قم بزيادة حجم الماصة إلى 100 ميكرولتر ثم قم بإدخال محلول 50 ميكرولتر من الفيبرينوجين في أنبوب الطرد المركزي. باستخدام خليط الثرومبين والخلية ، اخلطي الثرومبين والفيبرينوجين معا برفق عن طريق رسم خليط 100 ميكرولتر لمنع تكوين الفقاعات. بمجرد خلط المحلول جيدا ، قم بعمل ماصة خليط الجل داخل وبين شرائط الفيلكرو ، وسرعان ما نكون الوقت الجيلياني النموذجي للمواد الهلامية الفيبرينية ، بمجرد خلطها في حدود 20 ثانية ، احتضان التركيبات لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مخزنة بثاني أكسيد الكربون المرطبة بنسبة 5٪ للسماح لها بالهلام.

ثم أضف ستة ملليلتر من وسط هندسة الأنسجة مع حمض الأمينوكابرويك إلى كل بئر ، ثم ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة. استبدل الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام خلال الأيام السبعة الأولى. بعد أسبوع واحد ، قم بإزالة مكمل حمض الأمينوكابرويك من الوسائط واستمر في زراعة المواد الهلامية باستخدام وسائط هندسة الأنسجة.

لا يزال يتم تبادله كل يومين إلى ثلاثة أيام خلال الأيام الخمسة الأولى في الثقافة ، والسماح للتركيبات بالضغط وإعادة التنظيم تحت إجهاد ثابت لتشكيل ألياف الكولاجين ، ثنائية المحور بسبب قيود الألياف للحث على إعادة تنظيم الكولاجين في اتجاه واحد في ظل ظروف ثابتة. أولا ، قم بزراعة الخلايا لمدة أسبوع إضافي في اليوم 12 ، وقم بقطع بنية الأنسجة فضفاضة من شريطي فيلكرو في اتجاه واحد. سيؤدي ذلك إلى إجهاد في الاتجاه المعاكس مع ضغط الفيبرين.

بدلا من ذلك ، للتحميل الدوري ، ضع الألواح فوق مجموعة من أعمدة التحميل في لوحة قاعدة خلية مرنة ، ومجهزة بحشية في اليوم السادس ، وستدعم أعمدة التحميل الغشاء المرن للآبار وتسمح بسحب قاعدة الأعمدة لأسفل لخلق إجهاد في اتجاه واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد بروتوكول البرنامج لتطبيق إجهاد دوري على البناء. البرنامج الموضح هنا مخصص للإجهاد المتقطع الذي يشبه الموجة الجيبية ، مما يجهد البناء من صفر إلى 5٪ سلالة عند هرتز واحد لفترات ثلاث ساعات ، بالتناوب مع ثلاث ساعات من الراحة.

مع إعداد البرنامج ، قم بتشغيل مضخة التفريغ وابدأ البرنامج. ستقوم وحدة التحكم بتنظيم قوة الفراغ في النظام ، والتي تسحب الأغشية حول أعمدة الدعم لتطبيق إجهاد دوري على التركيبات وفقا للبرنامج. قم بتشغيل البرنامج لمدة أسبوع واحد مع الحرص على تبادل الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام بعد أسبوع واحد من التكييف ، مما يحفز إعادة تنظيم الكولاجين عن طريق تدوير العمود المستطيل بمقدار 90 درجة لتغيير اتجاه الإجهاد لمدة ثلاثة أيام.

لتصور إعادة تشكيل الكولاجين النشطة في الوقت الفعلي ، أضف تعقب الخلايا البرتقالي. أضف تركيزا قدره أربعة ميكرومولار لتلطيخ السيتوبلازم و CNA 35 OG 4 88. أضف تركيزا واحدا من ميكرومولار لتصور ألياف الكولاجين.

لن تتداخل هذه المجسات مع بقاء الخلية أو تكوين الكولاجين. ثم احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بإزالة لوحة الثقافة من الحاضنة ونقلها إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر لتصور الخلايا والكولاجين.

التقط صورا للمواد الهلامية على السطح وما يصل إلى حوالي 60 ميكرون في السقالة من أجل عرض التغييرات في التنظيم على هذه المستويات بمرور الوقت. ثم أعد اللوحة إلى إعداد التكييف الميكانيكي داخل الحاضنة. كرر هذا الإجراء كل بضعة أيام لتتبع تقدم إعادة تنظيم الخلايا استجابة للمنبهات.

تصبح الكريات المجهرية الفلورية المضافة إلى خليط الفيبرينوجين قبل البلمرة محاصرة في شبكة الفيبرين وتعمل بشكل جيد كعلامات مرجعية لضمان تصور نفس المنطقة في نقاط زمنية مختلفة عند زراعتها في ظل ظروف ثابتة وتثبيتها على جميع الوظائف الأربعة. لا يمكن رؤية أي ألياف حقيقية أو اتجاه خلوي بعد ثلاثة أيام من تقليم اثنين من وصلات الألياف اللاحقة. أدى الإجهاد المحوري الأحادي الناجم عن الانكماش إلى محاذاة ألياف الكولاجين الموضحة باللون الأخضر.

هنا الخلايا الصافنة الوريدية البشرية التي تم توترها بشكل دوري في اتجاه واحد لمدة أسبوع واحد على سطح البناء و 60 ميكرون في الجل. عندما تم تدوير اتجاه الإجهاد بزاوية 90 درجة ، وجد أن الاستجابة الخلوية بعد ثلاثة أيام تكون أسرع على السطح منها في قلب الأنسجة. بمجرد إتقان الهندسة ، يمكن تنفيذ تركيبات الأنسجة القائمة على FI في حوالي ساعتين.