العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير مستنبتات نقية من الخلايا البطانية من أدمغة أجنة في المرحلة الرابعة لدراسة تكوين الأوعية الدموية الدماغية والتفاعلات الوعائية العصبية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الغشاء القشري وعزل الرأس من أدمغة الأجنة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إنتاج معلق من الخلايا المفردة باستخدام عمليات التفكيك والترشيح والهضم للأنسجة التي تم جمعها.

تتمثل الخطوة الثالثة في وسم الخلايا مغناطيسياً باستخدام خرزات CD 31 الدقيقة. وتتمثل الخطوات النهائية في تنقية الخلايا الموّسمة بـ CD 31 عن طريق الفصل المغناطيسي ثم استزراعها. وفي النهاية، يتم الحصول على مجموعات نقية من الخلايا البطانية حول البطينية لإجراء مزيد من الدراسات من خلال مجهر التألق المناعي ومقاييس تكوين الأوعية الدموية.

ستفيد هذه الطريقة الدراسات التي تركز على الآليات الخلوية والجزيئية. وبالنسبة لتحليل الدماغ، يمكنها أن تعمل كأداة لتوضيح التفاعلات بين الخلايا البطانية في البطينات والتبادل التأثيري مع أنواع الخلايا العصبية. كما أنها تنطوي على إمكانات هائلة لمهام التحليل العلاجي.

يعد استعراض هذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية للتغلب على بعض الصعوبات التقنية المرتبطة بعزل واستزراع مجموعات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الجنيني. لهذا البروتوكول، ضع رؤوس جراء في اليوم الجنيني E 15 من أمهات CD one في محلول PBS بارد جداً تحت المجهر الستيريوسكوب. قم بإزالة الأدمغة باستخدام مقص دقيق الرأس وملقط دقيق.

يعد التشريح الجيد أمراً بالغ الأهمية، ويُكتسب من خلال الممارسة والحفاظ على الأدوات في حالة ممتازة. بعد ذلك، استخدم الملقط للإمساك بالدماغ بإحكام، واستخدم مقصات الطرف الدقيق (microtip scissors) لإزالة الغشاء المغلف. تعد هذه الخطوة الأكثر تحدياً في الإجراء، ولكن المهارات اللازمة ستُكتسب مع الممارسة.

بعد ذلك، قم بإزالة الدماغ المتوسط (mesencephalon) والدماغ الخلفي (metencephalon). اعزل الرأس (cephalon). ثم انقله، مع التأكد من خلوه من الغشاء القشري، إلى طبق زراعة بحجم 35 مليمتر يحتوي على 2 مليلتر من PBS على الثلج.

اجمع كل المخالب في طبق واحد. ابدأ بتقطيع المخالب إلى شظايا يتراوح حجمها بين واحد أو اثنين مليمتر باستخدام شفرة مشرط. اجمع الأنسجة في أنبوب سعة 15 milliliter يحتوي على 2 milliliter من وسط DMEM الكامل.

قم بتفكيك النسيج بلطف ولكن بدقة باستخدام ماصة سعة 1 mL حتى تختفي التكتلات ويتم الحصول على معلق حليبي. قم بطرد المعلق مركزياً عند 800 إلى 1000 G لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة الطافي بعناية عن طريق الشفط ثم أعد التعليق.

قم بتعليق الراسبة في وسط DMEM مع DS one. الآن، قم بتفكيك الخلايا مرة أخرى باستخدام عملية تدوير لطيفة وكرر خطوة الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الراسبة في وسط DMEM كامل مدفأ.

قم بترشيح الخلايا العالقة عبر مشبك نايلون بمسام 70 ميكرون، واجمع أجزاء الخلايا المحتجزة على المشبك ثم قم بهضمها بشكل إضافي في 2 مل من DMEM مع collagenase و dis bays. انتظر لبضع دقائق ثم اغسل النسيج. قم بإجراء عملية الطرد المركزي ثلاث مرات وأعد تعليق الراسب في DMEM مع DS one pool، ثم اجمع العينة المغسولة مع الراشح مع الحفاظ عليها مبردة على الثلج.

بعد ذلك، اغسل المزيج باستخدام وسط DMEM كامل عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليقه. الآن، حدد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) وابدأ عملية الوسم المغناطيسي. الأحجام المذكورة في هذا البروتوكول مناسبة لما يصل إلى 10 مليون خلية؛ وفي حال وجود أعداد أكبر من الخلايا، قم بزيادة المقادير بشكل تناسبي.

ابدأ بطرد تعليق الخلايا مركزياً عند 300 G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم اسحب السائل الطافي تماماً وأضف 90 µL من منظم التنقية المبرد إلى كرسلة الخلايا، يليه 10 µL من الخرزات الدقيقة المقترنة بـ CD 31. اخلط الخلايا جيداً باستخدام ماصة سعة 200 µL ثم حضّن التعليق لمدة 15 دقيقة في الثلاجة، مع مراعاة عدم تجاوز هذه المدة لضمان بقاء عملية الوسم نوعية. اغسل الخلايا بإضافة من 1 إلى 2 mL من منظم التنقية المبرد والطرد المركزي عند 300 G لمدة 10 دقائق.

قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الخلايا في 500 microliters من منظم التنقية المبرد. الآن، قم بتحميل عمود MS في المجال المغناطيسي لجهاز max separator. بعد ذلك، اشطف العمود بـ 500 microliters من منظم التنقية في درجة حرارة الغرفة.

ثم قم بتطبيق معلق الخلايا على العمود. يتسع العمود لما يصل إلى 20 مليون خلية. اجمع وتخلص من جميع السوائل المارة التي تحتوي على الخلايا غير المسمىّة.

اغسل العمود بـ 500 microliters من محلول التنقية المنظم ثلاث مرات. تأكد دائماً من أن خزان العمود فارغ قبل إضافة الحصص التالية من محلول التنقية المنظم. الآن، قم بإزالة العمود من جهاز الفصل الأقصى (max separator) وضعه على أنبوب سعة 15 milliliter.

أضف 1 mL من محلول التنقية المنظم إلى العمود، وقم فوراً بغسل الخلايا الموُسمة مغناطيسياً عن طريق دفع المكبس المرفق بقوة داخل صفيحة العمود. يتم تجميع الخلايا المغسولة في طبق زراعة بقطر 35 mm مكسو مسبقاً بـ collagen type one.

قم الآن بتنمية الخلايا باستخدام ECCM في حاضنة مضبوطة على درجة حرارة 37 °C مع 95% أكسجين و5% ثاني أكسيد الكربون. استبدل الوسط كل أربعة أيام. وراقب نمو الخلايا في طبق الزرع عبر المجهر يومياً.

التوصيف المظهري للخلايا البطانية حول البطينات أو PVE CS يتغير من اليوم الأول إلى اليوم 12 كما يظهر عبر المجهر الضوئي بتباين الطور. أظهرت الخلايا الملتصقة بالطبق في اليوم الأول مورفولوجيا مميزة لانقسام الخلايا بين اليوم الخامس والثامن. تنتقل PVE CS من المورفولوجيا التي تشبه رصف الطريق إلى مورفولوجيا مغزلية الشكل نموذجية للخلايا البطانية وأكثر قرباً لحالتها في الجسم الحي.

بحلول اليوم 12، تصل مستنبتات PVEC إلى مرحلة الالتحام الكامل. ويمكن استزراع p vs بسهولة لتوسيع المستعمرة بعد عملية الاستزراع الفرعي.

تم تحديد نقاء مزارع الخلايا البطانية بنسبة 100% باستخدام علامات الخلايا البطانية التالية: ISO lectin وvon Willbrand factor وCD 31 PE وcam one وVE cadherin. تم وسم صور عالية التكبير لخلايا PV Cs المحضرة من أجنة CD one، وكذلك أجنة tie two GFP التي تعبر خلاياها البطانية عن GFP، باستخدام ISO lectin، حيث أظهرت تلك الخلايا المورفولوجيا الشائعة التي تشبه حصى الرصيف والشكل المغزلي، بالإضافة إلى مورفولوجيا مضلعة ذات بروزات نحيلة في بعض أطباق المزرعة المطلية بالكولاجين. وفي غياب matrigel، شكلت pve, CS أنماطاً شبكية تشبه الخصائص الفريدة للشبكة الوعائية المحيطة بالبطينات في الجسم الحي.

يعكس هذا القدرة العالية على تكوين الأوعية الدموية لـ pve. Cs.An وقد تم إجراء اختبار تكوين الأوعية الدموية، حيث أضيفت 20, 000 من PVE CS إلى أطباق زراعة مغلفة بـ matrix gel matrix. وأظهرت خلايا PV Cs هذه تكويناً قوياً للأنابيب خلال 18 ساعة.

يمكن إجراء دراسة طويلة المدى لـ pve CS بما في ذلك الهجرة والمورفولوجيا الحركية ومقاييس وظائف الخلايا، بالإضافة إلى التجارب الحيوية في الجسم الحي (in vivo)، عن طريق وسم PV مقابل Isolated from CD one embryos باستخدام بلورات Q dot النانوية. توفر هذه البلورات النانوية فلورة مستقرة وكثيفة داخل سيتوبلازم الخلايا الحية.

يمكن نقل الجينات إلى خلايا Pve EECS باستخدام متتبعات خلوية مثل cell light plasma membrane. ويُستخدم RFP back MAM 2.0 لضمان رؤية واضحة لمورفولوجيا الخلايا في تجارب تصوير الخلايا الحية. وقد تم استزراع خلايا Pve CS في أوساط زراعية متعددة، وجرى مقارنة مورفولوجيا الخلايا بواسطة مجهر تباين الطور و ISO selectin قبل عملية الصبغ.

بينما أظهرت خلايا PV CS التي نمت في وسط ECCM شكلاً مغزلياً ووصلت إلى مرحلة الاندماج بحلول اليوم 12، أظهرت خلايا pve CS التي نمت في وسط نمو الخلايا البطانية للدماغ لدى الجرذان شكلاً مستطالاً للغاية ووصلت إلى مرحلة الاندماج بحلول اليوم 20. من ناحية أخرى، أظهرت خلايا PV CS المستزرعة في وسط D-M-E-M-F 12 شكلاً مسطحاً ومضلعاً فقط دون تكوين أي أشكال مغزلية، وتميزت بنمو سريع جداً ووصلت إلى مرحلة الاندماج بحلول اليوم الرابع.

تمت زراعة خلايا PVEC في وسط ECCM لمدة تصل إلى ثلاثة ممرات دون فقدان النمط الظاهري والوظيفة. وبناءً على ذلك، فإن ECCM هو الوسط المفضل لزراعة PVEC. وبمجرد إتقان هذه الخطوة، يمكن إنجازها في غضون ثلاث ساعات إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

من المرجح أن يؤدي الاستزراع المشترك للخلايا البطانية المحيطة بالبطينات مع السلائف العصبية إلى تحفيز تكوين الخلايا العصبية وهجرتها بشكل أفضل بكثير من الخلايا البطانية المستمدة من دماغ بالغ أو من مصادر أخرى. وبالتالي، قد تكون هذه الخلايا ذات قيمة في المساعدة على استعادة الوظائف العصبية في العديد من السيناريوهات المختلفة.