جيل من القص التصاق خريطة طريق SynVivo شبكات الاوعية الدموية الدقيقة الاصطناعية

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على خريطة لالتصاق الجسيمات الخلوية تحت تأثير قوة القص من خلال تجربة واحدة باستخدام شبكات وعائية دقيقة اصطناعية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق طلاء جهاز الموائع الدقيقة بالبروتين المستهدف، وهو في هذه الحالة avadon. وكخطوة ثانية، يتم حقن جسيمات مبيوتنة (biotinylated particles) في الجهاز بمعدلات قص فسيولوجية، والتي ترتبط بالجهاز المطلي بـ avadon بأنماط متفاوتة تعتمد على معدلات القص المحلية.

بعد ذلك، يتم عد الجسيمات المرتبطة من أجل إنشاء خريطة التصاق قص للجسيمات باستخدام قاعدة بيانات تم إنشاؤها حاسوبيًا لقيم معدل القص في الشبكة. وتظهر النتائج أنه يمكن الحصول على خريطة التصاق قص من تجربة واحدة، مما يؤدي إلى توفير كبير في الوقت والكواشف مقارنة بغرف التدفق ذات الأطباق المتوازية التقليدية. وتتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل قنوات التدفق الخطي، في قدرتنا على إنتاج خرائط التصاق مشتركة من تجربة واحدة، مما يؤدي إلى توفير كبير في التكلفة والوقت.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال إيصال الأدوية، مثل قدرة ناقلات إيصال الأدوية على الارتباط بالأهداف المنشودة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما كنا نستخدم غرف التدفق ذات الصفائح الدوارة لفهم الآفات الخلوية المحددة تحت ظروف تدفق السوائل. ومع ذلك، فإن التركيز الأساسي لهذا المقايسة هو تقديم رؤى أساسية حول التصاق الجسيمات والخلايا.

يمكن تطبيق منصة syn vivo على مجموعة متنوعة من الأنظمة الأخرى مثل السرطان وإيصال الأدوية إلى الجهاز العصبي المركزي، والعدوى والالتهاب، والتخثر واختلال وظائف الدورة الدموية الدقيقة. يعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية نظراً لصعوبة تعلم خطوات جهاز الموائع الدقيقة، والتعود على أحجام العينات الصغيرة، كما أن أفضل الممارسات لتجنب تكون الفقاعات يتم إيصالها بشكل أفضل بصرياً. ستقوم بتوضيح الإجراء أشلي سميث، وهي باحثة علمية من مختبرنا.

يتكون جهاز SynVivo SMN الموائع الدقيقة من مجموعتين من المنافذ المتوازية، إحداهما لتدفق طلاء السطح والجزيئات و/أو الخلايا لغرض التثبيت، والأخرى لإجراء المقايسة. للبدء، اغمر الجهاز تماماً في طبق بتري يحتوي على ماء منزوع الأيونات ومعقم، ثم ضع الطبق في جهاز تفريغ. قم بعملية التجفيف واتركها مستمرة حتى يتم إزالة كل الهواء من قنوات الجهاز.

يجب أن تستغرق هذه العملية 15 دقيقة تقريباً قبل إخراج الجهاز من الماء. استخدم ملاقط دقيقة لوضع أنابيب tigon مجهزة بالماء في كل منفذ من منافذ الجهاز. يجب أن يكون طول الأنابيب بوصة واحدة تقريباً.

يمكن الآن إزالة الجهاز من الماء باستخدام ماصة أو محقنة. ضع قطرة من الماء حول قاعدة أحد أنابيب منافذ الإدخال. قم بإزالة الأنبوب بعناية.

ستمنع قطرة الماء دخول الهواء إلى الجهاز. بعد ذلك، قم بتجهيز محقنة سعة 1 مل محملة بمادة avadon بتركيز 20 µg/mL. صِل المحقنة بإبرة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقياس 24 gauge وأنبوب توصيل. أغلق منفذ الإدخال غير المستخدم باستخدام مشبك فكي.

أدخل الأنبوب في منفذ الإدخال الخاص بالجهاز. احقن avadon بمعدل تدفق قدره 1 µL لكل دقيقة لمدة 10 دقائق للسماح بالتروية الكاملة للجهاز. عند نهاية وقت التدفق.

قم بتثبيت جميع الأنابيب باستخدام مشابك فكية وضع الجهاز عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. اترك الجهاز حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة. ثم ضع الجهاز على مجهر فلوري مقلوب مجهز بمنصة آلية وكاميرا عالية الأداء.

قم بتحضير محلول من جسيمات مبيوتنة بحجم 2 ميكرون بتركيز 5 ملايين جسيم لكل ملليلتر في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS. قم بتعبئة الجسيمات في حقنة سعة 1 ملليلتر. ثم قم بتحضير حقنة ثانية سعة 1 ملليلتر من محلول PBS.

قم بتحميل كل محقنة على مضخة محاقن، ثم قم بتوصيلها بالإبرة والأنابيب باستخدام محقنة ماصة. ضع قطرة من الماء حول قاعدة أنبوب منفذ الإدخال، ثم قم بإزالة الأنابيب المستخدمة لطلاء الجهاز بعناية. أدخل أنابيب الجسيمات المبيوتينية ومحلول PBS بعناية في كل منفذ إدخال.

ابدأ بعد ذلك بحقن الجسيمات المبيوتينية (biotinylated particles) بمعدل تدفق قدره 2.5 microliters per minute. راقب منفذ الدخول في المجهر عند ظهور أولى علامات الجسيمات. ابدأ المؤقت واستمر في التدفق لمدة ثلاث دقائق.

في نهاية الدقائق الثلاث، أوقف تدفق الجسيمات المبيوتنة (biotinylated particles) مع بدء تدفق PBS في الوقت نفسه وبمعدل تدفق قدره 2.5 microliters per minute. اترك PBS يتدفق في الجهاز لمدة ثلاث دقائق لغسل الجسيمات غير المرتبطة. لبدء عملية الاستحواذ، استخدم وظيفة مسح الصورة الكبيرة (scan large image) في برنامج التصوير لالتقاط صورة للجهاز بأكمله، ثم قم بترقيم التفرعات في الجهاز بالتسلسل وأنشئ منطقة اهتمام دائرية بقطر يعادل ضعف قطر القنوات.

في هذه الحالة، اضبط قطر المنطقة المستهدفة على 200 ميكرون نظرًا لأن قطر القناة يبلغ 100 ميكرون. استخدم وظيفة العد التلقائي في برنامج التصوير لتصدير عدد الجسيمات في كل منطقة مستهدفة إلى جدول بيانات. وبالمثل، استخدم ميزة العد التلقائي لتصدير عدد الجسيمات في الجهاز بأكمله.

يتم إجراء محاكاة ديناميكا الموائع الحسابية (CFD) وتُخزن النتائج في قاعدة بيانات لإجراء المزيد من التحليلات. تتضمن المعلومات الواردة في النتائج معدلات إجهاد القص على الجدران، وتدفق الجسيمات السرعي، ومدى الالتصاق بالجهاز. تُستخدم هذه المعلومات لتحديد عدد الجسيمات التي تلتصق في كل منطقة من مناطق الاهتمام بناءً على تركيز جسيمات محدد عند الإدخال.

لإنشاء خريطة التصاق القص، احسب النسبة المئوية للالتصاق كما هو مفصل في البروتوكول النصي كخطوة نهائية. ارسم خريطة التصاق القص باستخدام معدل القص عند كل تفرع من الشبكات وقيم النسبة المئوية للالتصاق. تُظهر هذه الصورة جهاز syn vivo SMN نموذجيًا مطليًا بالـ avidan بعد ربط جسيمات مبيوتنة بحجم ميكرونين.

لاحظ أن الجسيمات تلتصق تفضيلياً بالقرب من التفرعات في الشبكة. يمكن رؤية التفرعات المرقمة في شبكة SMN الحية هنا. تمثل هذه الصورة عينة من خريطة إجهاد القص على الجدار التي تم إنشاؤها بواسطة نموذج CFD للجهاز.

يتفاوت معدل القص في الجهاز من 250 inverse seconds إلى 15 inverse seconds، كما هو ملاحظ في الأوعية الدموية الدقيقة في الجسم الحي. تجدر الإشارة إلى أنه لا يمكن الحصول على معدلات القص المتغيرة هذه في آن واحد في القنوات الموائعية الدقيقة الخطية، كونها توفر معدل قص ثابتًا لكل معدل تدفق. ويوضح المخطط المعروض هنا لقيم معدل القص عند كل تفرع من تفرعات الشبكة أن أنماط معدل القص معقدة ولا يمكن الحصول عليها من خلال علاقة تحليلية بسيطة، على خلاف قنوات التدفق الخطية.

علاوة على ذلك، توجد تشعبات متعددة في الشبكة تقع ضمن نفس فئة القص، مما يعزز الثقة الإحصائية في البيانات المعروضة. فيما يلي نتائج عينة من تحليل CFD لتدفقات الجسيمات في الشبكة، والتي تُستخدم لحساب تدفقات الجسيمات في الفروع والتشعبات الخاصة بالشبكة التجريبية.

تتبع خريطة الالتصاق القصي المحسوبة من تجربة واحدة لـ SMN باستخدام تقنية Syn vivo العلاقة العكسية الملحوظة في خرائط الالتصاق القصي التي تم الحصول عليها من تجارب القنوات الخطية. ومع ذلك، تتيح مقايسة SynVivo توليد هذه الخريطة القصية من تجربة واحدة، بينما تتطلب القنوات الخطية إجراء عدة جولات تجريبية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية استخدام أجهزة SynVivo SMN لتوليد الالتصاق المشترك من تجربة واحدة.

عند إجراء هذه التجربة، من المهم تذكر عدم إدخال فقاعات إلى جهاز SynVivo SMN للموائع الدقيقة بعد تطويره. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الالتهابات لدراسة التفاعل بين الكريات البيضاء والبطانة الغشائية عند معدلات قص مختلفة في تجربة واحدة. وفي الجيل القادم من الأجهزة، سيتمكن الباحثون من دراسة تدحرج الكريات البيضاء والتصاقها وهجرتها في تحليل واحد، وهو أمر غير ممكن حالياً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى لاستقصاء التصاق الأدوية، ووسائل إيصال الأدوية، والخلايا، وذلك لبحث تساؤلات مثل التأثير الفسيولوجي للتدفق على التصاق الخلية بالخلية، والتصاق الخلية بالدواء، والتصاق الدواء بوسيلة إيصاله.