فحص علم الوراثة الأمامي بوساطة VIGS لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف

الهدف العام هنا هو توضيح المنهجية باستخدام إسكات الجينات الناجم عن الفيروس لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيفين لتحقيق VIGs للنبات الداخلي. يقوم الجين المستهدف بتلقيح نباتات نيكوتيانا حمامة بفيروس خشخجة التبغ يصنع التين الذي يحمل جزءا من الجين المستهدف ، ويقوم بإعداد وتلقيح المزارع المسببة للأمراض غير المضيفة التي تعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر على أوراق النبات الصامتة الجينية. بعد ذلك ، قم بتقييم مستعمرات الفلورسنت الخضراء لمسببات الأمراض غير المضيفة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في الظلام.

من أجل تحديد النباتات الصامتة الجينية التي تعرض مقاومة غير المضيفين للخطر ، حدد الجين المستهدف عن طريق تسلسل الإدخال في ناقل الفيروس. بشكل عام ، تسمح هذه المنهجية للفحص الجيني الأمامي بوساطة VIX للباحثين بتحديد الجينات المشاركة في مقاومة النباتات غير المضيفة لمسببات الأمراض البكتيرية بسهولة. في فترة زمنية قصيرة ، أدركنا أن أهمية الجمع بين إسكات الجينات الناجم عن الفيروس تتوسط في علم الوراثة الأمامي مع GFP للأشعة فوق البنفسجية التي تعبر عن مسببات الأمراض لتحديد الجينات المسؤولة عن مقاومة ST.

عندما قمنا سابقا بفحص جيني أمامي ممل من خلال تسجيل نقاط لموت الخلايا الناجم عن الاستجابة المفرطة وموت الخلايا الناجم عن الأمراض. لذا فإن بذور نيكوتيانا بن على خليط تأصيص بدون تربة تنبت البذور في غرفة النمو. بعد ثلاثة أسابيع ، قم بزرع الشتلات في أواني فردية ، وزرعها في دفيئة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام على الأقل قبل ظهور فيروس حشرجة التبغ.

تلقيح ناقلات التين إلى إذابة السيقان المجمدة للبكتيريا الزراعية التي تحتوي على استنساخ (كدنا) تدريجيا. يقوم ناقل Intv اثنين في ظل ظروف معقمة بتلقيح مزارع البكتيريا الزراعية الفردية على Luria. تحتضن ألواح Berti agro الألواح عند 28 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين.

قم بزراعة أربع مستعمرات مكررة لكل استنساخ بحيث يتوفر لقاح agrobacterium كاف لتلقيح نباتين. تلقيح TRV واحد في وسط سائل لوريا بيرتي. احصد الثقافات المزروعة بين عشية وضحاها عن طريق الطرد المركزي ، وأعد تعليق البكتيريا في التلقيح ، والعازلة ، واحتضانها لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة على شاكر عند 50 دورة في الدقيقة.

بعد حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، قم بقياس الكثافة البصرية وتعليق الكريات البكتيرية في خمسة ملليمولار MES عازلة الرقم الهيدروجيني 5.5 بعد ذلك تلقيح ثقافة بكتيرية T RV واحدة تحتوي على OD 600 من 0.3 في الجانب المحوري من ثلاثة إلى أربعة أوراق نيكوتيانا حمامة باستخدام حقنة بدون إبر في موقع T RV واحد تلقيح. وخز الأوراق بلقاح مستعمرتين T RV باستخدام عود أسنان لمدة أسبوعين. حافظ على النباتات تحت درجة حرارة منخفضة مع التغذية الكافية لأن النمو القوي مهم لإسكات الجينات بكفاءة بواسطة الخنازير.

على سبيل المثال ، يتم استخدام pseudomonas senge PV tomato T one في هذه التجربة. يجب أن تحمل مسببات الأمراض بلازميد يمكنه التعبير عن نمو سلالات PGE في الملوك ، وتكون سائلة ومتوسطة مع 10 ميكروغرام لكل مليلتر. يمكن أن يحتوي ريفامبيسين على 50 ميكروغرام لكل مليلتر من المايسين عند 28 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.

احصد الثقافات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي ، ثم تأكد من وجود مضان أخضر باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الطول الموجي في الظلام. بعد غسلتين في ماء معقم ، قم بتعليق الخلايا عند التركيز المطلوب من الماء المعقم وضبط OD 600. ثم قم بتلقيح مسببات الأمراض المعنية على الجانب المحوري للهدف.

تطوق الأوراق الصامتة الجينات بقطر حوالي 1.5 سم إذا لزم الأمر. في نفس الوقت ، اختبر العديد من مسببات الأمراض غير المضيفة لنموها في الجين المستهدف ، كما تتضمن النباتات الصامتة أيضا التحكم في النواقل للعرض. زرع نمو بكتيري بين يومين وخمسة أيام.

قم بتعريض الأوراق الملقحة لضوء الأشعة فوق البنفسجية بطول موجي طويل في الظلام. تأكد من ارتداء واقي للبشرة والعين. راقب المستعمرات البكتيرية كبقع فلورية خضراء في الجانب المحوري للورقة في خلفية التألق الأحمر المنبعث من سطح الورقة.

تحقق من التألق الأخضر المنبعث من العامل الممرض المضيف الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابي. راقب نمو مسببات الأمراض يوميا من يومين إلى خمسة أيام بعد التلقيح. قم بعمل قائمة بالاستنساخ الذين تم إسكاتهم ، مما أدى إلى نمو واحد أو أكثر من مسببات الأمراض غير المضيفة.

لإزالة الإيجابيات الخاطئة من الشاشة الأولى. كرر VIGs للنسخ المستنسخة المختارة ومرة أخرى ، اختبر استجابة النباتات الصامتة الجينات لمسببات الأمراض غير التكلفة. استخدم مستعمرة PCR على الاستنساخ المحدد لتضخيم الإدراج باستخدام A TTB واحد و TB اثنين من الاباديات في T RV اثنين من المتجهات أو الاشعال لتفريغ موقع الاستنساخ.

قم بتشغيل منتج PCR على هلام aros وتحقق من تضخيم النطاق الفردي. ثم قم بتسلسل إدخال الجين النباتي في T RV المتجه الثاني باستخدام إما بادئات أو بادئات A TTB التي تحيط بموقع الاستنساخ. قم بإجراء الانفجار باستخدام التسلسل وتحديد تفاصيل الجينات.

بروتوكول معمم لإسكات أعداد كبيرة من الجينات باستخدام التين القائم على فيروس حشرجة موت التبغ في نيكوتيانا. يظهر هامانا في هذا المخطط الانسيابي. أظهرت بعض النباتات الصامتة الجينات العديد من التغييرات المظهرية ، بما في ذلك توقف النمو والاصفرار والأنماط الظاهرية للتبييض الضوئي.

تظهر هذه البيانات التألق الأخضر لمسببات الأمراض المعرضة للأشعة فوق البنفسجية في الظلام قبل تلقيح النبات وزرع نموها بعد ثلاثة أيام من التلقيح ، تظهر نفس الورقة المعرضة للضوء الأبيض كعنصر تحكم. تتعقب هذه التجربة نمو G-F-P-U-V التي تعبر عن البكتيريا في بلانا. ثلاثة غير مضيفين.

تم استخدام مسببات الأمراض لإثبات عملية تحديد النبات الصاتم الجيني الحساس لمسببات الأمراض غير المضيفة في النوع البري غير الصامتة نباتات نيكوتيانا حمامة ذات المناعة. لم تنمو هذه مسببات الأمراض. ومع ذلك ، نما اثنان على الأقل من مسببات الأمراض غير المضيفة على NB sgt.قام

جين واحد بإسكات الأوراق. توضح البيانات الكمية عن نمو البكتيريا عملية تحديد النباتات الصامتة الجينية المعرضة للخطر بسبب مقاومة غير ST. باستخدام نهج علم الوراثة الأمامي بوساطة التين هذا ، قمنا بإسكات حوالي 5000 جين في نيكوتيانا هامانا وحددنا النباتات التي تعرض مقاومة غير ST للخطر على مدى حوالي عام ونصف.

على سبيل المثال ، يظهر هنا نمو مسببات الأمراض غير المضيفة في نباتين صامتين من الجينات تم تحديدهما من هذه الشاشة. نأمل أن نكون قد نقلنا كيفية إجراء إسكات الجينات الناجم عن الفيروس لمئات الجينات ، ثم تقييم النباتات الصامتة من خلال مراقبة نمو مسببات الأمراض غير المكلفة في بلانا لتشريح المقاومة غير التكلفة. باستخدام هذا الجين الناجم عن الفيروس ، بروتوكول إسكات الوساطة ، يمكن للمرء أن يتمكن من إسكات مئات الجينات في حوالي أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع ، ثم تقييم نمو مسببات الأمراض غير الخيول المصنفة بالأشعة فوق البنفسجية GFP في حوالي ساعتين إلى ثلاث ساعات في اليوم ، تمتد حوالي يومين إلى خمسة أيام.