فحص علم الوراثة الأمامي بوساطة VIGS لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة غير المضيف

الهدف العام هنا هو توضيح المنهجية باستخدام إسكات الجينات المستحث بالفيروسات لتحديد الجينات المشاركة في مقاومة العوائل غير المضيفة لتحقيق إسكات الجينات الداخلي للنبات. وبالنسبة للجين المستهدف، يتم تلقيح نباتات nicotiana hamama بتركيبات tobacco rattle virus التي تحمل جزءاً من الجين المستهدف، ثم يتم تحضير مزارع الممرضات غير المضيفة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر وتلقيحها على أوراق النباتات التي تم إسكات جيناتها. بعد ذلك، يتم تقييم المستعمرات الفلورية الخضراء للممرضات غير المضيفة تحت الأشعة فوق البنفسجية في الظلام.

من أجل تحديد النباتات التي تم إسكات جيناتها والتي تؤدي إلى إضعاف مقاومة العوائل غير المضيفة، يتم تحديد الجين المستهدف عن طريق تسلسل القطعة المدرجة في الناقل الفيروسي. وبشكل عام، تتيح منهجية المسح الجيني الأمامي بوساطة VIX للباحثين تحديد الجينات المشاركة في مقاومة العوائل غير المضيفة من النباتات ضد الممرضات البكتيرية بسهولة. وفي فترة زمنية قصيرة، أدركنا أهمية الجمع بين الوراثة الأمامية بوساطة إسكات الجينات المحرض فيروسياً مع الممرضات التي تعبر عن GFP UV لتحديد الجينات المسؤولة عن مقاومة non-ST.

لقد أجرينا سابقاً فحصاً جينياً أمامياً مضنياً عن طريق تقييم موت الخلايا الناجم عن الاستجابة المفرطة وموت الخلايا الناجم عن المرض. لذا، يتم زرع بذور nicotiana Ben في خليط تربة بدون تربة، وتُحضن البذور في غرفة نمو. بعد ثلاثة أسابيع، تُنقل الشتلات إلى أوانٍ فردية، وتُزرع في دفيئة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام على الأقل قبل الإصابة بفيروس tobacco rattle virus.

لتلقيح نواقل التين، يتم إذابة سيقان Agrobacterium المجمدة التي تحتوي على مستنسخات cDNA تدريجياً. تحت ظروف معقمة، يتم تلقيح مزارع Agrobacterium الفردية على أطباق Luria Berti agro، ثم تُحضن الأطباق عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة تصل إلى يومين.

قم بتنمية أربعة مستعمرات مكررة لكل مستنسخ لضمان توفر كمية كافية من اللقاح البكتيري (agrobacterium) لتلقيح نباتين. قم بتلقيح TRV one في وسط لوريا بيرتي (Luria berti) السائل. قم بحصاد المزارع التي نمت طوال الليل عن طريق الطرد المركزي، ثم أعد تعليق البكتيريا في محلول التلقيح المنظم، وحضنها لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز بسرعة 50 RPM.

بعد حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي، قم بقياس الكثافة الضوئية وأعد تعليق الكتل البكتيرية في محلول MES المنظم بتركيز 5 millimolar ورقم هيدروجيني pH 5.5. بعد ذلك، قم بتلقيح المزارع البكتيرية TRV1 ذات الكثافة الضوئية OD 600 البالغة 0.3 في الجانب المحوري من ثلاث إلى أربع أوراق من نبات Nicotiana hamama باستخدام حقنة بدون إبرة في موقع تلقيح TRV1. قم بوخز الأوراق بلقاح مستعمرات TRV2 المقابلة باستخدام عود أسنان لمدة أسبوعين. حافظ على النباتات في درجة حرارة منخفضة مع توفير التغذية الكافية، لأن النمو القوي ضروري لإتمام عملية إسكات الجينات بكفاءة بواسطة PGs.

على سبيل المثال، تم استخدام Pseudomonas senge PV tomato T1 في هذه التجربة. يجب أن تحمل المسببات المرضية بلازميداً يمكنه التعبير عن GFP-UV. يتم تنمية سلالات PGE في وسط King's B السائل، المكمل بـ 10 µg/mL من Rifampicin و 50 µg/mL من Kanamycin عند درجة حرارة 28 °C لمدة 12 ساعة.

قم بحصاد المزارع البكتيرية عن طريق الطرد المركزي، ثم تحقق من وجود الفلورة الخضراء باستخدام مصباح UV ذو طول موجي طويل في الظلام. وبعد غسل الخلايا مرتين بالماء المعقم، أعد تعليق الخلايا في الماء المعقم بالتركيز المطلوب واضبط قيمة OD 600. ثم قم بتلقيح المسببات المرضية المعنية على الجانب المحوري للهدف.

تُحاط الأوراق التي تم إسكات جيناتها بدوائر يبلغ قطرها حوالي 1.5 centimeter إذا لزم الأمر. وبالتزامن مع ذلك، يتم اختبار نمو العديد من المسببات المرضية غير المضيفة في النباتات المستهدفة التي تم إسكات جيناتها، مع تضمين مجموعة ضابطة ناقلة (vector control) للمقارنة. يتم غرس النمو البكتيري خلال فترة تتراوح بين يومين وخمسة أيام.

عرض الأوراق الملقحة لضوء فوق بنفسجي ذو طول موجي طويل في الظلام. تأكد من ارتداء واقيات الجلد والعينين. راقب المستعمرات البكتيرية على شكل بقع فلورية خضراء في الجانب المحوري للورقة على خلفية من الفلورة الحمراء المنبعثة من سطح الورقة.

تحقق من الفلورة الخضراء المنبعثة من الممرض المضيف الذي يعمل كضابط موجب. راقب نمو الممرض يومياً من اليوم الثاني إلى الخامس بعد التلقيح. قم بإعداد قائمة بالمستنسخات التي أدى إسكاتها إلى نمو واحد أو أكثر من الممرضات غير المضيفة.

لإزالة النتائج الإيجابية الكاذبة من الفرز الأول، كرر عملية الـ VIGs للمستنبتات المختارة، واختبر مجدداً استجابة النباتات التي تم إسكات جيناتها تجاه مسببات الأمراض غير المستهدفة. استخدم تقنية PCR للمستعمرات على المستنبت المختار لتضخيم القطعة المدرجة باستخدام بادئات A TTB one وTB two في ناقل T RV two، أو بادئات تحيط بموقع الاستنساخ.

قم بتشغيل ناتج PCR على هلام أغاروز وتحقق من تضخيم الحزمة الواحدة. بعد ذلك، قم بتسلسل قطعة جين النبات المدرجة في ناقل T RV two باستخدام إما بادئات A TTB أو بادئات تحيط بموقع الاستنساخ. أجرِ عملية blast باستخدام التسلسل وحدد تفاصيل الجين.

بروتوكول عام لإسكات أعداد كبيرة من الجينات باستخدام النواقل القائمة على فيروس هز التبغ في نباتات Nicotiana. تظهر Hamana في هذا المخطط الانسيابي. أظهرت بعض النباتات التي تم إسكات جيناتها تغيرات مظهرية متنوعة، بما في ذلك تقزم النمو، والاصفرار، ومظاهر التبييض الضوئي.

تظهر هذه البيانات الفلورة الخضراء للممرض المعرض للأشعة فوق البنفسجية (UV) في الظلام قبل تلقيح النبات، ونموه في الغرسات بعد ثلاثة أيام من التلقيح؛ وتظهر الورقة نفسها المعرضة للضوء الأبيض كعينة ضابطة. تتبع هذه التجربة نمو البكتيريا التي تعبر عن G-F-P-U-V في ثلاثة نباتات غير عائلة.

تم استخدام مسببات الأمراض لتوضيح عملية تحديد النبات الذي تم إسكات جيناته وكان عرضة لمسببات أمراض غير مضيفة في نباتات nicotiana hamama من النوع البري غير المُسكت التي تتمتع بالمناعة. لم تنمُ مسببات الأمراض هذه، ومع ذلك، نمت على الأقل مسببان للأمراض من غير المضيفات على NB sgt.

أوراق نباتية تم إسكات جين واحد فيها. تُظهر البيانات الكمية حول النمو البكتيري عملية تحديد النباتات التي تم إسكات جين فيها والتي تعاني من خلل في المقاومة غير المرتبطة بـ ST. وباستخدام نهج الوراثة الأمامية mediated figs، قمنا بإسكات حوالي 5,000 جين في نبات nicotiana hamana وحددنا النباتات التي تعاني من خلل في المقاومة غير المرتبطة بـ ST على مدار فترة زمنية بلغت حوالي سنة ونصف.

على سبيل المثال، يظهر هنا نمو مسببات الأمراض غير المضيفة في نباتين تم إسكات جينات فيهما وتحديدهما من خلال هذا الفحص. نأمل أن نكون قد أوضحنا كيفية إجراء عملية إسكات الجينات المستحثة بالفيروس لمئات الجينات، ومن ثم تقييم النباتات المسكتة من خلال مراقبة نمو مسببات الأمراض غير المضيفة في النباتات لتحليل المقاومة غير المضيفة. وباستخدام هذا البروتوكول المعتمد على إسكات الجينات المستحث بالفيروس، يمكن للمرء إسكات مئات الجينات في فترة زمنية تتراوح بين أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع، ومن ثم تقييم نمو مسببات الأمراض غير المضيفة الموصومة بـ GFP UV في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات يومياً، على مدار فترة تمتد من يومين إلى خمسة أيام.