صيانة C. elegans

تعد الرعاية والصيانة الصحيحة لديدان Caenorhabditis elegans أمرًا أساسيًا لنجاح التجارب.

فهي تتطلب مساحة صغيرة جدًا، وتكلفتها منخفضة في الإيواء، وتتميز بخصوبة عالية، وسهولة في التعامل. ولكن مجرد كونها بسيطة في التربية لا يعني أن الأبحاث المجراة عليها بسيطة؛ ففي الواقع، وصف سيدني برينر ديدان C. elegans بعبارته الشهيرة "هدية الطبيعة للعلم،" ومنذ تقديمها في عام 1974، ظهرت هذه الديدان في عدد من التجارب الحائزة على جائزة نوبل.

سنوضح في هذا الفيديو الطرق الأساسية للحفاظ على C. elegans في المختبر، بما في ذلك: الإيواء والتغذية، والتعامل، بالإضافة إلى تجميد الديدان وإذابتها.

توجد C. elegans في الطبيعة في التربة وتتغذى على المواد النباتية المتحللة. وفي المختبر، من المهم الحفاظ على النيماتودا في أفضل حالة ممكنة، لذا نقوم بإيوائها وتغذيتها باستخدام طرق محددة للغاية.

يمكن تربية C. elegans عند درجة حرارة 16 أو 20 أو 25 °C اعتماداً على متطلبات التجربة، كما يمكن تربيتها إما على أوساط صلبة أو في أوساط سائلة. وفي كلتا الحالتين، يتم تغذيتها بـ OP50، وهي سلالة قياسية من E. coli تُستخدم خصيصاً لاستزراع الديدان الخيطية في جميع مختبرات الديدان حول العالم.

عند تربيتها عند 25 °C، تُكمل C. elegans دورة حياتها بسرعة أكبر بـ 2.1 مرة مقارنة بتربيتها عند 16 °C. وتعني دورة الحياة الأسرع أن الديدان تنضج بشكل أسرع، وتضع بيوضاً أكثر، وتستهلك كمية أكبر من الغذاء. وإذا تُرِكت الديدان تعاني من الجوع أو أصبحت مزدحمة للغاية، فإنها تدخل في مرحلة يرقية تسمى مرحلة الداور (dauer stage). وتتميز يرقات الداور بمقاومتها للإجهاد وعدم شيخوختها.

عند الحفاظ عليها في أوساط صلبة، يتم استزراع C. elegans على أطباق آغار مُحضرة باستخدام أوساط نمو الديدان الخيطية أو أوساط NGM. وقبل يوم من تحضير الأطباق، يتم تلقيح وسط LB السائل بمستعمرة واحدة من OP50 E. coli، ثم يُحضن الوسط عند 37 °C طوال الليل مع الرج.

لتحضير الأوساط الصلبة، قم بقياس وخلط الكميات المناسبة من هذه المكونات مع ماء منزوع الأيونات في دورق إرلنماير.

بعد التعقيم بجهاز الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة على الأقل، اترك الآغار ليبرد حتى 55 °C في حمام مائي. وبمجرد أن يبرد الوسط إلى 55 °C، يجب أن تكون قادراً على إمساك الوعاء الزجاجي بيديك العاريتين بشكل مريح. وباستخدام تقنية تعقيم مناسبة، يمكن إضافة الملحقات مثل العقاقير أو المضادات الحيوية في هذا الوقت، ثم يتم التحريك لخلطها. بعد ذلك، يتم نقل NGM المنصهر بواسطة الماصة إلى أطباق بتري حتى تمتلئ بمقدار 2/3. وتُترك الأطباق المُحضرة حديثاً لتجف على المنضدة طوال الليل.

في صباح اليوم التالي، يتم ترسيب OP50 عند 3500 x g لمدة 10 دقائق، ثم إعادة تعليق البكتيريا في وسط LB بتركيز 10X. والآن، يتم توزيع مستعمرة مركزية بواسطة الماصة على كل طبق. يجب تجنب ملامسة طرف الماصة لسطح NGM والحرص على عدم ملامسة المزرعة لجدران الطبق. تُترك الأطباق لتجف على المنضدة طوال الليل، وبمجرد جفافها، تُعرض الأطباق للأشعة فوق البنفسجية (UV) لتعقيمها. وبذلك تصبح جاهزة للاستخدام في استزراع الديدان.

يتم التعامل مع ديدان C. elegans بشكل فردي باستخدام أداة تُعرف باسم "ملقاط الديدان" (worm pick). عادة ما يُصنع الملقاط من سلك مكون من 90% بلاتين و10% إريديوم بمقياس 30، رغم أن بعض الباحثين قد يفضلون تركيبات معدنية مختلفة قليلاً. لصنع الملقاط، ابدأ بكسر طرف ماصة باستير إلى الطول المفضل.

اقطع حوالي 3 إلى 4 cm من السلك وضع 0.5 cm منه داخل طرف الماصة. قم بتثبيت السلك بالزجاج فوق موقد بنزن. يكون طول السلك البارز من الزجاج حوالي 3 إلى 3.5 cm، ولكن يمكن أن يختلف ذلك وفقاً للتفضيلات الشخصية.

قم بتسطيح طرف السلك باستخدام حافة صلبة، ثم اثنِ الجزء المسطح للأعلى لتشكيل مغرفة صغيرة. وأخيراً، قم بصنفرة حواف الملقاط لمنع إتلاف الدودة أو الآجار.

لالتقاط الديدان، قم بتعقيم سلك الملقاط على اللهب، ثم غطِ الطرف ببكتيريا OP50 E. coli كثيفة ولزجة من طبق NGM. توخَّ الحذر لعدم ثقب أو خدش سطح الآجار.

أثناء النظر عبر مجهر التشريح، قم بغرف الدودة برفق على الطرف المسطح واللزج للملقاط حتى تلتصق الدودة به.

بمجرد استقرار الدودة على الملقاط، انقلها فوراً عن طريق ملامسة الطرف بخفة إلى السطح الجديد لطبق جديد وتحريكه عبر المستعمرة البكتيرية، حيث ينبغي أن تزحف الدودة خارج الملقاط. يجب ألا تبقى الدودة على الملقاط لفترة طويلة جداً لتجنب جفافها.

أحد الأسباب التي تجعل C. elegans نموذجاً شائعاً للبحث هو إمكانية تخزين المستنبتات لفترات طويلة دون حدوث أي تأثيرات سلبية.

أولاً، اغسل اليرقات الجائعة حديثاً باستخدام 0.5 ml من Buffer M9، وحرك الأنبوب بلطف لتحرير جميع اليرقات والحيوانات البالغة، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microcentrifuge) أو أنبوب تجميد (cryotube). بعد ذلك، أضف كمية مساوية من glycerol بتركيز 30% في Buffer M9. وأخيراً، ضع القارورة في صندوق معزول وخزنها عند -80 °C.

لاستعادة الديدان، أخرج الأنبوب من مجمد -80 واتركه يذوب في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب المحتويات تماماً. انقل السائل بواسطة الماصة إلى طبق NGM جديد يحتوي على بساط من OP50 واحضه عند 20 °C. بعد مرور 2-3 أيام، انقل 10-15 حيواناً إلى طبق جديد واتركها تتكاثر لجيل واحد. ثم اجمع النسل وافحص الظواهر المظهرية (phenotypes) للتأكد من صحتها.

بعد أن رأينا كيفية تربية C. elegans في المختبر، دعونا نلقِ نظرة على كيفية تعديل ظروف التغذية والإيواء والتعامل معها لأغراض التجارب.

لقد سمح الاكتشاف الحائز على جائزة نوبل في تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) للباحثين بإسكات أي جين في C. elegans من أجل تحديد وظيفته.

يمكننا حث تداخل RNAi في C. elegans عن طريق تحضير أطباق تحتوي على بكتيريا E. coli التي تعبر عن dsRNA للجين المستهدف، والتي ستتغذى عليها الديدان.

بعد ذلك، يتم نقل الديدان في المرحلة اليرقية الرابعة إلى أطباق RNAi وتُترك لوضع البيض. وعند الوصول إلى مرحلة النمو المطلوبة، يتم جمع النسل وتقييم الأنماط الظاهرية. وبما أننا نتشارك حوالي نصف جينومنا مع هذه الدودة، فإن العديد من الرؤى المستخلصة تكون قابلة للتطبيق على الأمراض البشرية.

بسبب دورة حياتها السريعة، تعد C. elegans نموذجاً مناسباً بشكل خاص لدراسة الشيخوخة.

أولاً، يتم إنشاء مجتمع متزامن زمنياً من C. elegans عن طريق السماح للخنثى البالغة بوضع البيض على أطباق NGM. تضع الديدان البيض لمدة 6-8 hr ثم يتم إزالتها.

عندما تصل الديدان إلى المرحلة المطلوبة، يتم نقلها إلى أطباق NGM جديدة تحتوي على ampicillin لمنع التلوث البكتيري وFUDR لمنع التكاثر.

من هذه النقطة فصاعداً، يتم مراقبة الديدان البالغة كل 2-3 days حتى تموت جميع الديدان. وتُزال الديدان الميتة من الطبق، ويتم تسجيل عدد الديدان الحية والميتة.

إن تحليل مدى الحياة في سياق التأثيرات الجينية أو البيئية الضارة يمكن أن يقدم رؤى مهمة حول عملية الشيخوخة.

باستخدام الليزر، يمكن إجراء عمليات قطع المحاور العصبية (axotomies) أو قطع محاور فردية في ديدان C. elegans حية لدراسة كيفية تجدد الخلايا العصبية.

ولكن، نظراً لأن الديدان لا تتوقف عن الحركة أبداً، يتم وضعها على وسائد agarose بتركيز 10% في محلول من الخرزات الدقيقة (microbeads). ثم يتم وضع شريحة غطاء (cover slip) في الأعلى. تزيد الخرزات الدقيقة من معامل الاحتكاك بين الوسادة وشريحة الغطاء، مما يؤدي فعلياً إلى تثبيت الدودة في مكانها.

تصبح الشريحة الآن جاهزة لإجراء عمليات قطع المحاور العصبية. يتم إظهار العصبونات وتوسيطها تحت المجهر، ثم يتم إطلاق الليزر باستخدام دواسة القدم. وتعمل قوة الليزر المثالية على قطع العصبون دون إلحاق الضرر بالبنى المجاورة. ويتم قطع أكبر عدد ممكن من المحاور العصبية في كل حيوان.

بعد ذلك، يتم إزالة وسادة agarose بعناية من الشريحة، وتُترك الديدان لتتعافى على طبق NGM مستزرع عند درجة حرارة 20 °C. وبين 8-48 hr بعد عملية قطع المحور العصبي، يمكن تحضير العصبونات لتقييم التجدد. في الجزء القاصي (distal) من القطع، يشكل العصبون جذعاً، بينما في الجزء الداني (proximal)، يتجدد العصبون مكوناً زوائد عصبية (neurites) مستطيلة.

لقد شاهدت للتو عرض JoVE حول الصيانة الأساسية لديدان Ceanorhabditis elegans. راجعنا في هذا الفيديو: طرق إيواء وتغذية C. elegans، وكيفية التعامل معها، وتجميد النيماتودا واستعادتها.

كما قمنا بجولة موجزة في بعض التطبيقات التي تجعل من C. elegans أداة بحثية قوية للغاية. ورغم أن C. elegans تختلف عن الثدييات في نواحٍ عديدة، إلا أن تركيبتها الجينية المتشابهة، وسهولة صيانتها، وبساطة التعامل معها تجعلها نموذجاً هاماً في السعي لفهم بيولوجيا الثدييات والأمراض. شكراً للمشاهدة!