هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الصفائح الخلوية لبناء رقعة هندسية نسيجية. يتم تحقيق ذلك أولاً بمعالجة سطح زراعة الخلايا باستخدام البوليمر الحساس للحرارة بولي بروبيل أكريلاميد، والمشار إليه أيضاً باسم p nipam. وتتمثل الخطوة الثانية في زراعة الخلايا المستهدفة بكثافة عالية على السطح المغطى بالبوليمر لإنشاء صفائح خلوية.

بعد ذلك، يتم رفع الصفائح عن طريق خفض درجة حرارة الطبق، مما يسمح للخلايا بالانفصال عن الطبق على شكل صفيحة خلوية. وتتمثل الخطوة النهائية في نقل الصفائح الخلوية السليمة دون تمزيقها إلى بنية مخصصة للزرع. وفي النهاية، يمكن استخدام المجهر الضوئي البسيط لإظهار أنه قد تم إنشاء الصفيحة الخلوية والحفاظ عليها أثناء التعامل معها أثناء تكوين مادة هندسية نسيجية قابلة للزرع.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، التي تقوم بتضمين الخلايا في مصفوفة مثل الهيدروجيل، في إمكانية توليد الحدود الجانبية للخلايا والحفاظ عليها كنسيج وظيفي. كما يمكن لهذه الطرق أن تتيح مزيداً من الدراسات في مجال هندسة الأنسجة؛ فعلى سبيل المثال، ما مدى بقاء الخلايا على قيد الحياة بعد الزرع عندما تكون في هذه الحالة المنظمة؟

سيقوم بتوضيح هذا الإجراء الدكتور William Turner، وهو زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري، والآنسة Snapshot sand do. لبدء هذا الإجراء، قم بإذابة 2.6 grams من P nipam في 2 milliliters من محلول مكون من 60%toluene و 40%hexane. بعد ذلك، سخّن الخليط إلى 60 °C لمدة 10 minutes مع التحريك حتى يذوب P nipam.

بعد ذلك، قم بقص ورقة الترشيح على شكل دائرة بقطر 60 millimeter وضعها في قمع بوخنر. قم بترشيح المحلول عبر قمع بوخنر في دورق زجاجي موزون مسبقاً. احفظ الدورق ومحتوياته في وعاء تفريغ هوائي (bell vacuum) طوال الليل.

بعد ذلك، قم بوزن الكأس الذي يحتوي على p nipam. ثم أضف الكحول الإيزوبروبيلي إلى P nipam لتحضير محلول بنسبة 50 50 وزن/وزن. بعد ذلك، ضع 2 mL من المحلول على سطح طبق زراعة الأنسجة وقم بتغطيته لمدة خمس دقائق تحت الأشعة فوق البنفسجية UV light.

بعد ذلك، اغسل الطبق بـ 2 mL من محلول PBS الدافئ مرتين قبل استخدامه لزراعة الخلايا. في هذا الإجراء، قم أولاً بعزل خلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للجرذ عن طريق غسل الخلايا بـ 2 mL من محلول PBS الدافئ. بعد ذلك، أضف 3 mL من التربسين أو أي محلول تفكيك شاطر آخر إلى الخلايا واحضنها لمدة 5 دقائق.

بعد ذلك، أضف 3 mL من الوسط الزرعي أو PBS المحتوي على 10% FBS إلى الخلايا. عقب ذلك، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي وقم بعدهاً. ومن ثم، قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق.

قم بشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو. بعد ذلك، ضع الوسط الذي يحتوي على الخلايا على طبق حساس للحرارة بقطر 35 مليمتر بتركيز يحقق 100%Confluence، ثم قم بالتحضين عند 37 درجة مئوية طوال الليل للحفاظ على التصاق الخلايا بالطبق. الآن، قم بجمع الخلايا البطانية وتفريقها إلى محلول من خلية واحدة.

يمكن أيضاً استخدام محلول التربسين بتركيز 1x، أو محلول accutase، أو محلول تفكيك الخلايا لتشتيت الخلايا المفردة. بعد ذلك، يتم تثبيط إنزيم التربسين باستخدام كمية مساوية من مثبط تربسين فول الصويا أو 10%FBS في محلول PBS. ثم تُجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) واحسب الحجم المطلوب لأبعاد الرقعة؛ فبالنسبة لرقعة بحجم 4 millimeter، يتم استخدام 2 million من الخلايا البطانية، بعد ذلك، استخلص 2 million من الخلايا وضعها في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 milliliter. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً لمدة five minutes، واشفط السائل الطافي، مع ترك الخلايا على شكل كتلة مترسبة (pellet) في الأنبوب المخروطي. الآن، قم بتحضير هيدروجيل الـ high aurin وفقاً لبروتوكول الشركة.

اخلط كلًا من الأورين عالي التركيز والجيلاتين السائل بنسبة واحد إلى واحد. بعد ذلك، انقل 80% من الحجم النهائي الإجمالي إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الراسب، وأعد تعليق الخلايا البطانية في خليط جيلاتين الأورين عالي التركيز. بعد ذلك، انقل الخلايا المعلقة إلى المصفوفة الليفية.

أضف 20% من الحجم النهائي الكلي من عامل الربط المتقاطع (crosslinker) وحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في هذه الخطوة، أخرج طبق P nypa المعالج بقطر 35 مليمتر والذي يحتوي على الخلايا من الحاضنة وضعه في غطاء تدفق الخلايا المعقم (cell culture hood). عند درجة حرارة الغرفة، قم بشفط الوسط الزرعي من الخلايا بسرعة.

ثم أضف 2 mL من الجيلاتين العادي بتركيز 6% وبدرجة حرارة 37 °C إلى الطبق بينما لا يزال الجيلاتين دافئاً، وضع الشبكة المعدنية داخل الجيلاتين، بحيث تكون مغمورة تحت سطح الجيلاتين العادي. بعد ذلك، ضع الطبق بالكامل على الثلج لمدة تتراوح من 5 إلى 7 دقائق حتى يتصلب الجيلاتين. وبعد مرور 7 دقائق، استخدم ملعقة مسطحة (spatula) لفصل حواف الجيلاتين بعناية عن جانب الطبق.

بعد ذلك، ارفع الشبكة المعدنية من الطبق باستخدام الملقط. انقل شرائح الخلايا إلى الطبق وضعها فوق مزيج الهيدروجيل والمصفوفة الليفية. أضف 2 mL من الوسط الغذائي عند درجة حرارة 37 °C إلى طبق زراعة الأنسجة، ثم احضنه طوال الليل للسماح لشرائح الخلايا بالالتصاق بسطح الهيدروجيل.

في هذه الأثناء، قم بإزالة الشبكة المعدنية بعد أن يسخن المحلول. هنا، تم استنبات الخلايا على سطح مطلي بمادة Pippa ثم نُقلت كطبقة واحدة إلى سطح المصفوفة الليفية. وقد أدت التجارب الأولية التي لم يتم فيها النقل باستخدام الشبكة المعدنية الجيلاتينية إلى تكوين رقع صغيرة ممزقة.

تمثل هذه الصورة صورة مركبة لتصميم أولي للرقعة، حيث تجمع بين صبغة mito tracker، وخلايا العضلات الملساء في الشريان الأورطي للجرذ المصبوغة باللون الأحمر، وخلايا بطانية من الوريد السري البشري ذات فلورة خضراء بصبغة calcium am، وصورة الضوء النافذ. وهذه هي الصورة المركبة لورقة خلوية مدمجة مع تركيبة هيدروجيل مصفوفة ليفية قاعدية أكثر قوة. تم التقاط هذه الصورة المركبة من أسفل الرقعة عبر مصفوفة ليفية قاعدية أكثر قوة، بينما تم التقاط هذه الصورة المركبة للأوراق الخلوية فوق المصفوفة الليفية القاعدية.

تغطي الخلايا المدمجة في الهيدروجيل الموجودة في الورقة توليفة مصفوفة الهيدروجيل الليفية القاعدية، والتي تظهر فلورة متزايدة عند الحواف بسبب تكتل الخلايا. هذه صورة نافذة للبنية، وتظهر هنا المصفوفة الليفية الطبيعية ذاتية الفلورة في DPI. وباتباع هذا الإجراء، يمكن لتجارب هندسة الأنسجة الأخرى الإجابة على تساؤلات أخرى، مثل كيفية تأثير محاذاة الخلايا والتواصل فيما بينها على نجاح عملية الزرع.

تتيح هذه التقنية للباحثين في هندسة الأنسجة استكشاف طرق معقدة لنقل أنواع متعددة من الخلايا. تجدر الإشارة إلى أن العمل مع المذيبات يمكن أن يكون خطيراً للغاية؛ لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل ارتداء الأقنعة المناسبة واستخدام غطاءات استخلاص الغازات الكيميائية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.