هندسة الأنسجة: بناء ومتعددة الخلايا 3D سقالة لتسليم الطبقات صفائح خلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام صفائح الخلايا لبناء رقعة هندسية للأنسجة. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة سطح زراعة الخلية أولا باستخدام البوليمر البوليمر البولي بروبيل أكريلاميد الحساس للحرارة ، والذي يشار إليه أيضا باسم p nipam. الخطوة الثانية هي زراعة الخلايا ذات الأهمية بكثافة عالية على السطح المطلي بالبوليمر لإنشاء صفائح خلايا.

بعد ذلك ، يتم رفع الأوراق عن طريق خفض درجة حرارة اللوحة ، مما يسمح للخلايا بالانفصال عن اللوحة كورقة من الخلايا. الخطوة الأخيرة هي تحريك صفائح الخلايا السليمة دون تمزيقها على بنية للزرع. في النهاية ، يمكن استخدام الفحص المجهري الضوئي البسيط لإظهار أن ورقة الخلية قد تم إنشاؤها وصيانتها أثناء معالجتها أثناء إنشاء مادة هندسية للأنسجة قابلة للزرع.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، والتي ستدمج الخلايا في مصفوفة مثل الهلاميات المائية ، هي أنه في هذه التقنية ، يمكن إنشاء الحدود الجانبية للخلايا والحفاظ عليها كنسيج وظيفي. يمكن أن تتيح هذه الأساليب أيضا إجراء مزيد من الدراسات في مجال هندسة الأنسجة. على سبيل المثال ، ما مدى بقاء الخلايا على قيد الحياة بعد الزرع عندما تكون في هذه الحالة المنظمة؟

سيوضح هذا الإجراء الدكتور ويليام تيرنر ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري والسيدة Snapshot sand do. لبدء هذا الإجراء قم بإذابة 2.6 جرام من P nipam في ملليلترين من محلول 60٪ تولوين ، 40٪ هكسان. بعد ذلك ، سخني المزيج إلى 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وقلبي حتى يذوب P nipam.

ثم قم بقص ورق الترشيح إلى دائرة قطرها 60 ملم وضعها في قمع بوشنر. قم بتصفية المحلول من خلال قمع Buchner في دورق زجاجي موزون مسبقا. احتفظ بالدورق والمحتويات في مكنسة الجرس طوال الليل.

بعد ذلك ، قم بوزن الدورق مع p nipam. أضف بعد ذلك كحول الأيزوبروبيل إلى P nipam لإنشاء محلول وزن 50 50. بعد ذلك ، ضع ملليلترين من المحلول على سطح لوحة زراعة الأنسجة وقم بتغطيته لمدة خمس دقائق تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

ثم اغسل الطبق بملليلترين من PBS الدافئ مرتين قبل استخدامه لزراعة الخلايا. في هذا الإجراء ، أولا ، قم بعزل خلايا العضلات الملساء الأبهرية عن طريق غسل الخلايا بملليلترين من PBS الدافئ. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ملليلتر من التربسين أو محلول آخر لفصل الخلايا واحتضنه لمدة خمس دقائق.

ثم أضف ثلاثة ملليلتر من وسائط الثقافة أو PBS التي تحتوي على 10٪ FBS إلى الخلايا. بعد ذلك ، اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي الشكل وعدادها. بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق.

استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو. بعد ذلك ، ضع الوسائط التي تحتوي على الخلايا على صفيحة حساسة للحرارة مقاس 35 ملم بتركيز يحقق التقاء بنسبة 100٪ ، ثم احتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل للحفاظ على التصاق الخلية باللوحة. الآن اجمع الخلايا البطانية وتفريقها في محلول خلية واحدة.

باستخدام التربسين x واحد ، يمكن أيضا استخدام المخزن المؤقت للتفكك الحاد أو الخلية لتشتت الخلية الواحدة. بعد ذلك ، قم بإلغاء تنشيط إنزيم التربسين بكمية متساوية من مثبط التربسين فول الصويا أو 10٪ FBS في PBS. ثم اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي واحسب الحجم المطلوب لأبعاد التصحيح لرقعة أربعة ملليمترات ، يتم استخدام 2 مليون خلية بطانية بعد ذلك ، واستخرج 2 مليون خلية وضعها في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. ثم قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة خمس دقائق ، وشفط المادة الطافية ، تاركا الخلايا على شكل حبيبات في الأنبوب المخروطي. الآن قم بإعداد هيدروجيل الأورين العالي وفقا لبروتوكول الشركة.

اخلطي الأورين العالي والجيلاتين السائل بنسبة واحد إلى واحد. بعد ذلك ، قم بنقل 80٪ من الحجم النهائي الكلي إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا البطانية في خليط الجيلاتين عالي الأورين. بعد ذلك ، انقل الخلايا العالقة إلى المصفوفة الليفية.

أضف 20٪ من إجمالي الحجم النهائي للرابط المتقاطع وتحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. في هذه الخطوة ، قم بإزالة اللوحة المعالجة ب P nypa مقاس 35 ملم والتي تحتوي على الخلايا من الحاضنة وضعها في غطاء مزرعة الخلايا. في درجة حرارة الغرفة ، قم بشفط الوسائط بسرعة من الخلايا.

ثم أضف ملليلترين من 37 درجة مئوية ، 6٪ جيلاتين عادي إلى اللوحة بينما لا يزال الجيلاتين دافئا ، ضع الشبكة المعدنية في الجيلاتين ، واغمرها تحت سطح الجيلاتين العادي. بعد ذلك ، ضع الطبق بالكامل على الثلج لمدة خمس إلى سبع دقائق ، مما يسمح للجيلاتين بالتصلب. بعد سبع دقائق ، استخدم ملعقة لفصل حواف الجيلاتين بعناية عن جانب اللوحة.

بعد ذلك ، ارفع الشبكة المعدنية من اللوحة بالملقط. انقل ورقة الخلية إلى الطبق وضعها فوق تركيبة هيدروجيل المصفوفة الليفية. أضف ملليلترين من الوسط 37 درجة مئوية إلى لوحة زراعة الأنسجة واحتضانها طوال الليل للسماح لورقة الخلايا بالالتصاق بسطح الهيدروجيل.

في غضون ذلك ، قم بإزالة الشبكة المعدنية بعد تسخين المحلول. هنا ، تمت زراعة الخلايا على سطح مطلي ببيبا ثم نقلها كورقة إلى سطح المصفوفة الليفية. أسفرت التجارب المبكرة التي لم يتم نقلها مع الشبكة المعدنية الجيلاتين عن بقع صغيرة ممزقة.

تمثل هذه الصورة صورة مركبة بتصميم رقعة مبكرة تجمع بين متتبع ميتو ، وخلايا العضلات الملساء الأبهرية المصبوغة باللون الأحمر ، والخلايا البطانية للوريد السري البشري الفلورسنت الأخضر ، وصورة الضوء المرسلة. وهذا هو مركب ورقة الخلية جنبا إلى جنب مع تركيبة هيدروجيل المصفوفة الليفية الأقوى ذات القاعدة الليفية. تم التقاط هذه الصورة المركبة من أسفل الرقعة من خلال مصفوفة ليفية قاعدة أقوى ، وتم التقاط هذه الصورة المركبة لصفائح الخلايا فوق المصفوفة الليفية الأساسية.

تغطي خلايا تركيبة الهيدروجيل في الصفيحة تركيبة هيدروجيل المصفوفة الليفية الأساسية ، والتي تظهر زيادة التألق عند الحواف بسبب تجميع الخلايا. هذه صورة نقل للبناء وتظهر هنا مصفوفة القاعدة الليفية الطبيعية الفلورية ذاتية الفلورية في DPI. باتباع هذا الإجراء ، يمكن لتجارب هندسة الأنسجة الأخرى الإجابة على أسئلة أخرى مثل كيفية تأثير محاذاة الخلايا والتواصل على نجاح الزرع.

تسمح هذه التقنية للباحثين في هندسة الأنسجة باستكشاف طرق معقدة لزرع أنواع متعددة من الخلايا. لا تنس أن العمل مع المذيبات يمكن أن يكون خطيرا للغاية. يجب دائما اتخاذ الاحتياطات ، مثل ارتداء الأقنعة المناسبة والأغطية الكيميائية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.