محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة التغيرات التفاعلية للعصبونات الطرفية تجاه البيئات المجهرية البنكرياسية المختلفة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنتاج نواتج تحلل نسيجي كامل من بنكرياس بشري طبيعي وأنسجة بنكرياسية مصابة. وكخطوة ثانية، يتم عزل خلايا العقد الجذرية الظهرية (DRG) من جرذان حديثة الولادة، والتي يتم معالجتها لاحقاً بنواتج التحلل النسيجي المعزولة.

بعد ذلك، وبعد التحضين لمدة 48 ساعة، يتم تثبيت الخلايا لإجراء صبغ مناعي فلوري مزدوج لاحقاً. وتظهر النتائج الاختلافات في نمط تفرع كثافة الزوائد الشجرية للعصبونات وكثافة الخلايا الدبقية للعصبونات المستنبتة في مستخلصات نسيجية مختلفة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في تسهيل الدراسات في مجال طب الجهاز الهضمي العصبي، مثل دور الوسائط الجزيئية في التغيرات اللدنة العصبية في أمراض الجهاز الهضمي المختلفة.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول الخصائص العصبية المختلفة لأمراض البنكرياس، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل السرطانات أو الحالات الالتهابية في الجهاز الهضمي بأكمله. لقد خطرت لنا فكرة استخدام هذه الطريقة عندما بدأنا تعاوننا مع باحثين في مجال الأمراض العصبية في الجهاز الأطفالي، مثل مرض Ong، وقمنا بتطبيق ذلك لأغراضنا لعمل تجانس لأنسجة البنكرياس البشرية. انقل مكعبات من أنسجة البنكرياس بحجم 5×5×5 مليمتر مباشرة من درجة حرارة -80 °C إلى النيتروجين السائل.

بعد ذلك، ضع الكتل المجمدة أولاً في أنابيب التجانس التي يمكن أن تحتوي على كرة تفكيك معدنية، ثم ضعها في جهاز تجانس الأنسجة وقم بعملية التجانس دون السماح للأنسجة بالذوبان مباشرة بعد التفكيك. أعد تعليق ناتج التجانس الذي يشبه المسحوق الصلب في 300 إلى 500 µL من 0.1 XPBS المبرد بالثلج. لا تستخدم أي محلول تحلل (lysis buffer) لأن هذا قد.

قم بتحليل الخلايا العصبية ثم قم بطرد المتجانس مركزياً بسرعة 21,130 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة على الأقل. اجمع الرائق الصافي الذي يحتوي على مستخلص الأنسجة لجمع الرائق من الخطوط الخلوية البنكرياسية البشرية. قم بزراعة الخلايا حتى تصل نسبة التلاقي إلى 70 إلى 80% على الأقل في وسط نمو طبيعي.

عندما تصبح الخلايا جاهزة، اغسلها ثلاث مرات على الأقل باستخدام محلول PBS المخصص لزراعة الخلايا، ثم ازرعها في وسط خالٍ من المصل لمدة تصل إلى 48 ساعة. بعد ذلك، قم بقياس تركيز البروتين في متجانس الأنسجة أو في السوائل الطافية لخط الخلايا باستخدام مقايسة برادفورد للبروتين. ثم قم بتقسيم مستخلصات الأنسجة والسوائل الطافية لخط الخلايا إلى حصص بحيث يكون التركيز النهائي للمستخلص أو السائل الطافي في الوسط العصبي هو 100 micrograms per milliliter.

ثم تُخزن عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. وباستخدام جراد فأر حديث الولادة من عمر P2 إلى P12 مقطوع الرأس، يتم قطع الجلد وكشف العمود الفقري. بعد ذلك، تُجرى عملية استئصال صفيحة فقارية أمامية لكشف الحبل الشوكي.

بعد ذلك، قم بكشف واستئصال العقد الجذرية الظهرية (DRGs). ضع العقدة الجذرية الظهرية في وسط MEM مبرد بالثلج ومضاف إليه Gentamycin وmetronidazole. استمر في جمع العقد الجذرية الظهرية، بدءاً من العقد الجذرية الظهرية الذيلية وصولاً إلى العقد الجذرية الظهرية الرقبية العلوية.

عند الانتهاء، يتم جمع 52 من العقد الجذرية الظهرية (DRGs)، وهو عدد كافٍ للوحة ذات 24 بئراً. بعد ذلك، استخدم مقصاً دقيقاً لفصل العقد الجذرية الظهرية عن جذورها وأعصابها. ثم قم بقص أي بروزات طرفية أو مركزية متبقية.

بعد جمع العقد الجذرية (DRGs)، يتم تحضينها في محلول HBSS المضاف إليه إنزيم collagenase type two عند درجة حرارة 37 °C لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. وبعد انتهاء فترة التحضين، يتم تفتيت العقد الجذرية (DRGs) عن طريق تمريرها عبر محاقن ذات أقطار متناقصة.

لاحظ أن التركيزات المفرطة من tri يمكن أن تؤدي إلى تدمير العصبونات، ولكنها أقل تدميراً للخلايا الدبقية. وبمجرد أن يصبح الوسط الذي يحتوي على DRGs عكراً، قم بطرد المعلق مركزياً عند 93.9 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تخلص من الوسط وأعد التعليق.

قم بتعليق الخلايا في وسط neuro basal لتحضيرها للزرع. استخدم مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتقدير العدد الإجمالي للعصبونات والخلايا الدبقية. بعد ذلك، قم بزرع الخلايا على شرائح غطاء زجاجية مطلية مسبقاً بمقاس 13 مليمتر.

في طبق يحتوي على 24 بئراً، يعتمد نوع الطلاء المستخدم على الأهداف التجريبية. بعد ذلك، تملأ الآبار بوسط غذائي عصبي أساسي (neuro basal medium) وتترك الخلايا لتلتصق بالآبار طوال الليل. وفي اليوم التالي، يتم إذابة الوسط الغذائي المكمل بمستخلص الأنسجة أو الوسط الغذائي المكمل بطافي الخلايا (cell line supernatant).

بعد ذلك، اسحب وسط الاستزراع من العقد الجذرية الظهرانية (DRGs) وقم بإجراء غسيل اختياري ولطيف للغاية باستخدام PBS. ثم انقل ببطء باستخدام الماصة مستخلص الأنسجة المضاف إليه الوسط الغذائي أو وسط supernatant الخاص بخط الخلايا المضاف إليه الوسط الغذائي فوق الخلايا لتحقيق تركيز 100 µg/mL. الآن، اترك الخلايا تنمو لمدة 48 ساعة عند 37 °C في الوسط الغذائي المضاف إليه مستخلص الأنسجة أو supernatant خط الخلايا بعد مرور 48 ساعة.

قم بشفط الوسط الغذائي والتثبيت في 4%paraform aldehyde من أجل التلوين المناعي. وبالنسبة للتلوين المناعي الفلوري المزدوج، استخدم واسمات محددة للعصبونات وواسمات محددة للخلايا الدبقية لتحديد الهندسة المورفولوجية. استخدم مجهراً ضوئياً مقلوباً مجهزاً بكاميرا CCD بالتزامن مع برنامج آلي لقياس كثافة الزوائد الشجيرية باستخدام تكبير 200 x.

قم بقياس كثافة الزوائد الشجيرية للمزارع العصبية من خلال وضع شبكة قياس بمقاس 50 في 50 ميكرون، وحساب كثافة الألياف لكل مربع مقاس من خلال عدد الألياف المتقاطعة. كرر هذا التحليل لأربع مناطق مختلفة من النمو الأكثر كثافة في أربع إلى خمس صور مجهرية ممثلة على كل شريحة غطاء. قم بقياس متوسط عدد التفرعات لكل عصبون، ومتوسط طول التفرع، وحجم المنطقة المحيطة للنمو العصبي من 30 عصبوناً منفرداً تم اختيارها عشوائياً من كل شريحة غطاء، وذلك عن طريق تحديد الزوائد الشجيرية والمنطقة المحيطة؛ حيث تظهر هنا عصبونات DRG المستزرعة باستخدام مستخلص نسيجي من بنكرياس طبيعي.

وفي المقابل، تُظهر عصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) المستنبتة مع مستخلصات أنسجة التهاب البنكرياس المزمن أو سرطان البنكرياس كثافة أكبر في الاستطالات العصبية كما هو موضح. وهنا تظهر عصبونات الضفيرة العضلية المعوية المستنبتة مع مستخلصات مختلفة من أنسجة البنكرياس البشرية.

تُكوّن عصبونات الضفيرة المعوية التي نُميت في مستخلصات التهاب البنكرياس المزمن أو سرطان البنكرياس عصبونات أطول وتظهر نمط تفرع أكثر تعقيداً من تلك التي نُميت في مستخلصات من بنكرياس سليم. وعند زراعة عصبونات العقد الجذرية الظهرية (DRG) مع الطافي من خلايا سرطان البنكرياس، لوحظ أيضاً زيادة في الكثافة العصبية مشابهة لما لوحظ مع مستخلصات الأنسجة. ومع ذلك، كانت هذه الزيادة قابلة للعكس عند استنفاد أو حصر عوامل تغذية عصبية مختارة مثل our tein أو عامل نمو الأعصاب (nerve growth factor).

تستجيب خلايا Ggl بشكل مختلف لمستخلصات أنسجة البنكرياس المختلفة، حيث أدت المستخلصات المأخوذة من التهاب البنكرياس المزمن أو سرطان البنكرياس إلى تعزيز نمو الخلايا الدبقية وزيادة أعدادها في المزارع الدبقية المشتقة من العقد الجذرية الظهرية (DRG). وعلى الرغم من أن التأثير كان أكثر وضوحاً مع مستخلصات سرطان البنكرياس مقارنة بمستخلصات التهاب البنكرياس المزمن، إلا أنه بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون أربع إلى خمس ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح بعد تطويرها.

مهدت هذه الطريقة الطريق للباحثين في مجال طب الجهاز الهضمي العصبي لاستكشاف آليات اللدونة العصبية في مختلف أمراض الجهاز الهضمي، بما في ذلك اضطرابات الجهاز الهضمي الالتهابية والخبيثة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك تصور جيد حول كيفية عزل العصبونات الطرفية لدراسة اللدونة العصبية في البنكرياس، وكيفية تطبيق هذا النظام واختبارات التغيرات العصبية الأخرى واختبارات اللدونة العصبية في اضطرابات الجهاز الهضمي.