تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) في C. elegans
يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي، أو RNAi، تقنية مستخدمة على نطاق واسع يتم من خلالها إدخال حمض نووي ريبوزي مزدوج السلسلة إلى الكائن الحي، مما يؤدي إلى إسكات جينات مستهدفة. وقد أتاح اكتشاف تداخل الحمض النووي الريبوزي الحائز على جائزة نوبل للباحثين إسكات أي جين في C. elegans من أجل تحديد وظيفته. يمكننا حث عملية RNAi في C. elegans عن طريق تحضير أطباق تحتوي على بكتيريا E. coli التي تعبر عن dsRNA للجين المستهدف، والتي ستتغذى عليها الديدان. بعد ذلك، تُنقل الديدان في المرحلة اليرقية الرابعة إلى أطباق RNAi وتُترك لتضع البيض. وفي مرحلة النمو المطلوبة، يتم جمع النسل وتقييمه من حيث المظاهر الفينوتيبية.
تُستخدم تقنية RNAi بشكل متكرر في C. elegans لإجراء عمليات الفحص الجيني العكسي، وعمليات الفحص الآلي عالية الإنتاجية، وكأداة لدراسة العمليات التنموية. في هذا الفيديو، سنشرح مفهوم تداخل الحمض النووي الريبوزي، ونوضح كيفية استخدام تقنية RNAi في C. elegans، ونناقش كيف يستخدم العلماء RNAi كأداة لفهم العمليات البيولوجية واسعة الانتشار بشكل أفضل.
لنبدأ أولاً بشرح كيفية عمل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference). في حالة ديدان C. elegans، يتم تغذية الديدان ببكتيريا تم تحويلها باستخدام بلازميدات تشفر حمضاً نووياً ريبوزياً مزدوج السلسلة (dsRNA) مكملاً للجين المراد إسكاته. وكما ذكرنا سابقاً، تتغذى ديدان C. elegans على هذه البكتيريا المحولة. ومن خلال آلية غير معروفة حالياً، يدخل dsRNA إلى أنسجة C. elegans بمجرد ابتلاعه.
وبمجرد دخوله إلى الخلية، يقوم إنزيم Dicer بشطر الحمض النووي الريبوزي مزدوج السلسلة إلى حمض نووي ريبوزي متداخل قصير، أو siRNA، يتراوح طوله بين 21 و 23 نيوكليوتيداً. بعد ذلك، يرتبط siRNA بمعقد الإسكات المستحث بالحمض النووي الريبوزي، والمعروف أيضاً باسم "RISC"، ثم يتم فك ارتباط سلسلتيه. ثم يرتبط معقد siRNA/RISC بالحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المستهدف عبر ازدواج القواعد المكملة. يؤدي ذلك إلى تحلل mRNA، وبالتالي تثبيط عمل ذلك الجين.
قبل البدء في الإجراء، يجب تحضير البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA) المطلوب. تتوفر تجارياً مكتبات بكتيرية تحتوي على بلازميدات تشفر dsRNA لآلاف الجينات. وبخلاف ذلك، يجب استنساخ تسلسل الجين المستهدف في بلازميد باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية. يحتوي البلازميد على جين مقاوم للمضاد الحيوي ampicillin، والذي يمكن استخدامه لاختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على البلازميد.
بعد ذلك، استخدم التقنيات القياسية لنقل البلازميد الذي يشفر dsRNA المطلوب إلى سلالة (DE3) من بكتيريا E. coli التي ستعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة. كما يتم تحويل البكتيريا باستخدام بلازميد فارغ كمجموعة ضابطة. ومن المهم الإشارة إلى أن سلالة E. coli المستخدمة في هذه التجارب تفتقر إلى RNA polymerase III، الذي قد يقوم بخلاف ذلك بهضم dsRNA. تحتوي هذه البكتيريا أيضاً على جين قابل للتحفيز بواسطة IPTG لإنزيم T7 DNA polymerase، الذي يقوم بنسخ dsRNA الموجود في البلازميد. وأخيراً، فإن بكتيريا (DE3) مقاومة لكل من tetracycline وcarbenicillin، وذلك للحفاظ على تعبير RNA polymerase III ومنع النمو البكتيري غير المرغوب فيه.
قم بنشر بكتيريا HT115(DE3) المحولة على أطباق LB agar تحتوي على 12.5 μg/ml من tetracycline و25 μg/ml من carbenicillin. تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 °C، وفي صباح اليوم التالي ستظهر المستعمرات البكتيرية على الأطباق. بعد ذلك، اختر مستعمرة بكتيرية واحدة وأضفها إلى 1 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin لاختيار البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. تُحضن المزرعة طوال الليل عند 37 °C مع الرج. وبعد التحضين الليلي، أضف 5 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin إلى المزرعة، وتُحضن لمدة إضافية تتراوح بين 4-6 ساعات عند 37 °C.
بمجرد أن تصبح البكتيريا جاهزة، يجب تحضير أطباق الديدان الخاصة بتداخل RNA (RNAi) للتغذية. تحتوي أطباق ديدان RNAi على: الآغار، والماء، والكربينيسيلين، ومزيج وسط الديدان، و IPTG لتحفيز DNA polymerase T7 في البكتيريا التي تقوم بنسخ dsRNA في البلازميد. أضف 0.5 ml من المزرعة البكتيرية إلى أطباق ديدان RNAi واتركها للحضانة طوال الليل عند 37 °C، لتكوين طبقة بكتيرية (bacterial lawn).
قبل إضافة الديدان إلى أطباق RNAi، من المهم مزامنة المرحلة التنموية للديدان، لضمان أن أي اختلافات ملحوظة في النمط الظاهري ليست ناتجة عن اختلاف المراحل التنموية. ومن أجل مزامنة المراحل التنموية، ابدأ بتعقيم ملقط سلكي بلاتيني باستخدام اللهب.
استخدم ملقط الديدان لإضافة ديدان في المرحلة L4 إلى كل طبق RNAi، واتركها للحضانة طوال الليل عند 20 °C، حتى تصبح بالغات شابة واضعة للبيض. بعد ذلك، انقل البالغين الشباب إلى طبق RNAi جديد واتركهم للحضانة لمدة 6-8 ساعات عند 20 °C، وهي الفترة التي يتم خلالها وضع البيض. وبمجرد إزالة جميع البالغين، سيكون هذا البيض متزامناً تنموياً. وأخيراً، اترك الديدان تنمو على أطباق RNAi حتى تصل إلى المرحلة التنموية المطلوبة للتحليل.
من أجل تصور الديدان، يجب تحضير شريحة باستخدام وسادة أغار بتركيز 4%. أولاً، قم بتثبيت شريحتين زجاجيتين باستخدام شريط ملصقات، مما يخلق فواصل تضمن سمكاً موحداً لوسادة الأغار. ضع شريحة زجاجية نظيفة بين الفاصلين، ثم انقل حوالي 150 μl من الأغار المنصهر بتركيز 4% إلى الشريحة بواسطة الماصة. قم بتغطية الأغار المنصهر بسرعة بشريحة إضافية بشكل عمودي على الفواصل. افصل الشرائح برفق، وستلتصق وسادة الأغار بإحدى الشرائح.
بعد ذلك، أضف 10 μl من مادة مخدرة مثل sodium azide إلى وسادة الأغار لشل حركة الحيوانات. وباستخدام ملقط سلكي من البلاتين، انقل الديدان إلى وسادة الأغار التي تحتوي على المادة المخدرة ثم ضع غطاء الشريحة. أخيراً، افحص الديدان تحت المجهر. قارن الديدان التي خضعت لعملية RNAi gene knockdown مع عينات الضبط، وسجل الاختلافات في الحجم، ومرحلة النمو، والشكل الظاهري، وأنماط تمركز البروتينات الموسومة فلورياً، وأي أنماط ظاهرة أخرى محتملة.
يعد القدرة على إجراء عمليات فحص وراثي عكسي بسهولة واحدة من أكثر تطبيقات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) قيمة. والفحص الوراثي العكسي هو نهج يُستخدم لاكتشاف وظيفة الجينات عن طريق تثبيط مجموعة معروفة من الجينات وتقييم النتيجة الظاهرية. فعلى سبيل المثال، يمكن للباحثين استخدام مكتبة من البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) لجميع الجينات تقريباً في الـ C. elegans الجينوم. يتم استزراع هذه البكتيريا في أطباق متعددة الآبار وتغذية الديدان بها. بعد ذلك، يمكن تقييم التأثيرات المظهرية لإسكات العديد من الجينات باستخدام تقنية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)، مما يعطي رؤية حول الوظائف الطبيعية للجينات داخل الجسم الحي.
تُعد عمليات المسح الجيني المؤتمتة نوعاً من أنواع المسح الجيني العكسي التي تتميز بإنتاجية عالية للغاية. وفي عمليات المسح الجيني المؤتمتة، فإن كامل... C. elegans يمكن تثبيط الجينوم بسهولة كبيرة من خلال التعامل الروبوتي مع الآلاف من المستنسخات البكتيرية، وباستخدام أدوات متخصصة للتحليل الكمي.
على سبيل المثال، تخضع الديدان التي تعبر عن مراسل فلوري محول جينياً لجين الببتيد المضاد للميكروبات nlp 29 لعملية تثبيط بالتدخل RNAi لآلاف الجينات عن طريق التغذية البكتيرية. وفي الوقت ذاته، يتم تعريض الديدان لأبواغ فطرية، ومن ثم يمكن تقييم استجابة الببتيد المضاد للميكروبات تجاه الفطر.
غالبًا ما تُدرس عملية نمو ديدان *C. elegans* باستخدام تداخل الحمض الريبي النووي (RNAi). حيث يمكن للعلماء استخدام تداخل الحمض الريبي النووي لتعطيل أي جين (أو مجموعة من الجينات) محل الدراسة، وتقييم كيفية تأثير ذلك الجين بدقة على العمليات أثناء النمو و/أو التوقيت النمائي. على سبيل المثال، قد يكشف تعطيل الجينات عبر تداخل الحمض الريبي النووي عن الجينات التي تؤدي عملية تعطيلها إلى تأخير النمو، أو الجينات المشاركة في تطور الأعضاء.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تداخل الرنا (RNA interference) في ديدان *C. elegans*. لقد استعرضنا كيفية عمل تداخل الرنا وكيفية استخدامه في C. elegans عن طريق التغذية البكتيرية. يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) أداة قيمة لعمليات الفرز الجيني العكسي، بما في ذلك عمليات الفرز الآلية عالية الإنتاجية، كما أنه أداة مفيدة لدراسة التطور. شكراً للمشاهدة!
يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNAi) تقنية مستخدمة على نطاق واسع، حيث يتم إدخال حمض نووي ريبوزي مزدوج السلاسل إلى الكائن الحي من مصدر خارجي، مما يت…
يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي، أو RNAi، تقنية مستخدمة على نطاق واسع يتم من خلالها إدخال حمض نووي ريبوزي مزدوج السلسلة إلى الكائن الحي، مما يؤدي إلى إسكات جينات مستهدفة. وقد أتاح اكتشاف تداخل الحمض النووي الريبوزي الحائز على جائزة نوبل للباحثين إسكات أي جين في C. elegans من أجل تحديد وظيفته. يمكننا حث عملية RNAi في C. elegans عن طريق تحضير أطباق تحتوي على بكتيريا E. coli التي تعبر عن dsRNA للجين المستهدف، والتي ستتغذى عليها الديدان. بعد ذلك، تُنقل الديدان في المرحلة اليرقية الرابعة إلى أطباق RNAi وتُترك لتضع البيض. وفي مرحلة النمو المطلوبة، يتم جمع النسل وتقييمه من حيث المظاهر الفينوتيبية.
تُستخدم تقنية RNAi بشكل متكرر في C. elegans لإجراء عمليات الفحص الجيني العكسي، وعمليات الفحص الآلي عالية الإنتاجية، وكأداة لدراسة العمليات التنموية. في هذا الفيديو، سنشرح مفهوم تداخل الحمض النووي الريبوزي، ونوضح كيفية استخدام تقنية RNAi في C. elegans، ونناقش كيف يستخدم العلماء RNAi كأداة لفهم العمليات البيولوجية واسعة الانتشار بشكل أفضل.
لنبدأ أولاً بشرح كيفية عمل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference). في حالة ديدان C. elegans، يتم تغذية الديدان ببكتيريا تم تحويلها باستخدام بلازميدات تشفر حمضاً نووياً ريبوزياً مزدوج السلسلة (dsRNA) مكملاً للجين المراد إسكاته. وكما ذكرنا سابقاً، تتغذى ديدان C. elegans على هذه البكتيريا المحولة. ومن خلال آلية غير معروفة حالياً، يدخل dsRNA إلى أنسجة C. elegans بمجرد ابتلاعه.
وبمجرد دخوله إلى الخلية، يقوم إنزيم Dicer بشطر الحمض النووي الريبوزي مزدوج السلسلة إلى حمض نووي ريبوزي متداخل قصير، أو siRNA، يتراوح طوله بين 21 و 23 نيوكليوتيداً. بعد ذلك، يرتبط siRNA بمعقد الإسكات المستحث بالحمض النووي الريبوزي، والمعروف أيضاً باسم "RISC"، ثم يتم فك ارتباط سلسلتيه. ثم يرتبط معقد siRNA/RISC بالحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المستهدف عبر ازدواج القواعد المكملة. يؤدي ذلك إلى تحلل mRNA، وبالتالي تثبيط عمل ذلك الجين.
قبل البدء في الإجراء، يجب تحضير البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA) المطلوب. تتوفر تجارياً مكتبات بكتيرية تحتوي على بلازميدات تشفر dsRNA لآلاف الجينات. وبخلاف ذلك، يجب استنساخ تسلسل الجين المستهدف في بلازميد باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية. يحتوي البلازميد على جين مقاوم للمضاد الحيوي ampicillin، والذي يمكن استخدامه لاختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على البلازميد.
بعد ذلك، استخدم التقنيات القياسية لنقل البلازميد الذي يشفر dsRNA المطلوب إلى سلالة (DE3) من بكتيريا E. coli التي ستعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة. كما يتم تحويل البكتيريا باستخدام بلازميد فارغ كمجموعة ضابطة. ومن المهم الإشارة إلى أن سلالة E. coli المستخدمة في هذه التجارب تفتقر إلى RNA polymerase III، الذي قد يقوم بخلاف ذلك بهضم dsRNA. تحتوي هذه البكتيريا أيضاً على جين قابل للتحفيز بواسطة IPTG لإنزيم T7 DNA polymerase، الذي يقوم بنسخ dsRNA الموجود في البلازميد. وأخيراً، فإن بكتيريا (DE3) مقاومة لكل من tetracycline وcarbenicillin، وذلك للحفاظ على تعبير RNA polymerase III ومنع النمو البكتيري غير المرغوب فيه.
قم بنشر بكتيريا HT115(DE3) المحولة على أطباق LB agar تحتوي على 12.5 μg/ml من tetracycline و25 μg/ml من carbenicillin. تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 °C، وفي صباح اليوم التالي ستظهر المستعمرات البكتيرية على الأطباق. بعد ذلك، اختر مستعمرة بكتيرية واحدة وأضفها إلى 1 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin لاختيار البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. تُحضن المزرعة طوال الليل عند 37 °C مع الرج. وبعد التحضين الليلي، أضف 5 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin إلى المزرعة، وتُحضن لمدة إضافية تتراوح بين 4-6 ساعات عند 37 °C.
بمجرد أن تصبح البكتيريا جاهزة، يجب تحضير أطباق الديدان الخاصة بتداخل RNA (RNAi) للتغذية. تحتوي أطباق ديدان RNAi على: الآغار، والماء، والكربينيسيلين، ومزيج وسط الديدان، و IPTG لتحفيز DNA polymerase T7 في البكتيريا التي تقوم بنسخ dsRNA في البلازميد. أضف 0.5 ml من المزرعة البكتيرية إلى أطباق ديدان RNAi واتركها للحضانة طوال الليل عند 37 °C، لتكوين طبقة بكتيرية (bacterial lawn).
قبل إضافة الديدان إلى أطباق RNAi، من المهم مزامنة المرحلة التنموية للديدان، لضمان أن أي اختلافات ملحوظة في النمط الظاهري ليست ناتجة عن اختلاف المراحل التنموية. ومن أجل مزامنة المراحل التنموية، ابدأ بتعقيم ملقط سلكي بلاتيني باستخدام اللهب.
استخدم ملقط الديدان لإضافة ديدان في المرحلة L4 إلى كل طبق RNAi، واتركها للحضانة طوال الليل عند 20 °C، حتى تصبح بالغات شابة واضعة للبيض. بعد ذلك، انقل البالغين الشباب إلى طبق RNAi جديد واتركهم للحضانة لمدة 6-8 ساعات عند 20 °C، وهي الفترة التي يتم خلالها وضع البيض. وبمجرد إزالة جميع البالغين، سيكون هذا البيض متزامناً تنموياً. وأخيراً، اترك الديدان تنمو على أطباق RNAi حتى تصل إلى المرحلة التنموية المطلوبة للتحليل.
من أجل تصور الديدان، يجب تحضير شريحة باستخدام وسادة أغار بتركيز 4%. أولاً، قم بتثبيت شريحتين زجاجيتين باستخدام شريط ملصقات، مما يخلق فواصل تضمن سمكاً موحداً لوسادة الأغار. ضع شريحة زجاجية نظيفة بين الفاصلين، ثم انقل حوالي 150 μl من الأغار المنصهر بتركيز 4% إلى الشريحة بواسطة الماصة. قم بتغطية الأغار المنصهر بسرعة بشريحة إضافية بشكل عمودي على الفواصل. افصل الشرائح برفق، وستلتصق وسادة الأغار بإحدى الشرائح.
بعد ذلك، أضف 10 μl من مادة مخدرة مثل sodium azide إلى وسادة الأغار لشل حركة الحيوانات. وباستخدام ملقط سلكي من البلاتين، انقل الديدان إلى وسادة الأغار التي تحتوي على المادة المخدرة ثم ضع غطاء الشريحة. أخيراً، افحص الديدان تحت المجهر. قارن الديدان التي خضعت لعملية RNAi gene knockdown مع عينات الضبط، وسجل الاختلافات في الحجم، ومرحلة النمو، والشكل الظاهري، وأنماط تمركز البروتينات الموسومة فلورياً، وأي أنماط ظاهرة أخرى محتملة.
يعد القدرة على إجراء عمليات فحص وراثي عكسي بسهولة واحدة من أكثر تطبيقات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) قيمة. والفحص الوراثي العكسي هو نهج يُستخدم لاكتشاف وظيفة الجينات عن طريق تثبيط مجموعة معروفة من الجينات وتقييم النتيجة الظاهرية. فعلى سبيل المثال، يمكن للباحثين استخدام مكتبة من البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) لجميع الجينات تقريباً في الـ C. elegans الجينوم. يتم استزراع هذه البكتيريا في أطباق متعددة الآبار وتغذية الديدان بها. بعد ذلك، يمكن تقييم التأثيرات المظهرية لإسكات العديد من الجينات باستخدام تقنية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)، مما يعطي رؤية حول الوظائف الطبيعية للجينات داخل الجسم الحي.
تُعد عمليات المسح الجيني المؤتمتة نوعاً من أنواع المسح الجيني العكسي التي تتميز بإنتاجية عالية للغاية. وفي عمليات المسح الجيني المؤتمتة، فإن كامل... C. elegans يمكن تثبيط الجينوم بسهولة كبيرة من خلال التعامل الروبوتي مع الآلاف من المستنسخات البكتيرية، وباستخدام أدوات متخصصة للتحليل الكمي.
على سبيل المثال، تخضع الديدان التي تعبر عن مراسل فلوري محول جينياً لجين الببتيد المضاد للميكروبات nlp 29 لعملية تثبيط بالتدخل RNAi لآلاف الجينات عن طريق التغذية البكتيرية. وفي الوقت ذاته، يتم تعريض الديدان لأبواغ فطرية، ومن ثم يمكن تقييم استجابة الببتيد المضاد للميكروبات تجاه الفطر.
غالبًا ما تُدرس عملية نمو ديدان *C. elegans* باستخدام تداخل الحمض الريبي النووي (RNAi). حيث يمكن للعلماء استخدام تداخل الحمض الريبي النووي لتعطيل أي جين (أو مجموعة من الجينات) محل الدراسة، وتقييم كيفية تأثير ذلك الجين بدقة على العمليات أثناء النمو و/أو التوقيت النمائي. على سبيل المثال، قد يكشف تعطيل الجينات عبر تداخل الحمض الريبي النووي عن الجينات التي تؤدي عملية تعطيلها إلى تأخير النمو، أو الجينات المشاركة في تطور الأعضاء.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تداخل الرنا (RNA interference) في ديدان *C. elegans*. لقد استعرضنا كيفية عمل تداخل الرنا وكيفية استخدامه في C. elegans عن طريق التغذية البكتيرية. يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) أداة قيمة لعمليات الفرز الجيني العكسي، بما في ذلك عمليات الفرز الآلية عالية الإنتاجية، كما أنه أداة مفيدة لدراسة التطور. شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي، أو RNAi، تقنية مستخدمة على نطاق واسع يتم من خلالها إدخال حمض نووي ريبوزي مزدوج السلسلة إلى الكائن الحي، مما يؤدي إلى إسكات جينات مستهدفة. وقد أتاح اكتشاف تداخل الحمض النووي الريبوزي الحائز على جائزة نوبل للباحثين إسكات أي جين في C. elegans من أجل تحديد وظيفته. يمكننا حث عملية RNAi في C. elegans عن طريق تحضير أطباق تحتوي على بكتيريا E. coli التي تعبر عن dsRNA للجين المستهدف، والتي ستتغذى عليها الديدان. بعد ذلك، تُنقل الديدان في المرحلة اليرقية الرابعة إلى أطباق RNAi وتُترك لتضع البيض. وفي مرحلة النمو المطلوبة، يتم جمع النسل وتقييمه من حيث المظاهر الفينوتيبية.
تُستخدم تقنية RNAi بشكل متكرر في C. elegans لإجراء عمليات الفحص الجيني العكسي، وعمليات الفحص الآلي عالية الإنتاجية، وكأداة لدراسة العمليات التنموية. في هذا الفيديو، سنشرح مفهوم تداخل الحمض النووي الريبوزي، ونوضح كيفية استخدام تقنية RNAi في C. elegans، ونناقش كيف يستخدم العلماء RNAi كأداة لفهم العمليات البيولوجية واسعة الانتشار بشكل أفضل.
لنبدأ أولاً بشرح كيفية عمل تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference). في حالة ديدان C. elegans، يتم تغذية الديدان ببكتيريا تم تحويلها باستخدام بلازميدات تشفر حمضاً نووياً ريبوزياً مزدوج السلسلة (dsRNA) مكملاً للجين المراد إسكاته. وكما ذكرنا سابقاً، تتغذى ديدان C. elegans على هذه البكتيريا المحولة. ومن خلال آلية غير معروفة حالياً، يدخل dsRNA إلى أنسجة C. elegans بمجرد ابتلاعه.
وبمجرد دخوله إلى الخلية، يقوم إنزيم Dicer بشطر الحمض النووي الريبوزي مزدوج السلسلة إلى حمض نووي ريبوزي متداخل قصير، أو siRNA، يتراوح طوله بين 21 و 23 نيوكليوتيداً. بعد ذلك، يرتبط siRNA بمعقد الإسكات المستحث بالحمض النووي الريبوزي، والمعروف أيضاً باسم "RISC"، ثم يتم فك ارتباط سلسلتيه. ثم يرتبط معقد siRNA/RISC بالحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) المستهدف عبر ازدواج القواعد المكملة. يؤدي ذلك إلى تحلل mRNA، وبالتالي تثبيط عمل ذلك الجين.
قبل البدء في الإجراء، يجب تحضير البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة (dsRNA) المطلوب. تتوفر تجارياً مكتبات بكتيرية تحتوي على بلازميدات تشفر dsRNA لآلاف الجينات. وبخلاف ذلك، يجب استنساخ تسلسل الجين المستهدف في بلازميد باستخدام تقنيات الاستنساخ القياسية. يحتوي البلازميد على جين مقاوم للمضاد الحيوي ampicillin، والذي يمكن استخدامه لاختيار المستعمرات البكتيرية التي تحتوي على البلازميد.
بعد ذلك، استخدم التقنيات القياسية لنقل البلازميد الذي يشفر dsRNA المطلوب إلى سلالة (DE3) من بكتيريا E. coli التي ستعبر عن الحمض النووي الريبوزي ثنائي السلسلة. كما يتم تحويل البكتيريا باستخدام بلازميد فارغ كمجموعة ضابطة. ومن المهم الإشارة إلى أن سلالة E. coli المستخدمة في هذه التجارب تفتقر إلى RNA polymerase III، الذي قد يقوم بخلاف ذلك بهضم dsRNA. تحتوي هذه البكتيريا أيضاً على جين قابل للتحفيز بواسطة IPTG لإنزيم T7 DNA polymerase، الذي يقوم بنسخ dsRNA الموجود في البلازميد. وأخيراً، فإن بكتيريا (DE3) مقاومة لكل من tetracycline وcarbenicillin، وذلك للحفاظ على تعبير RNA polymerase III ومنع النمو البكتيري غير المرغوب فيه.
قم بنشر بكتيريا HT115(DE3) المحولة على أطباق LB agar تحتوي على 12.5 μg/ml من tetracycline و25 μg/ml من carbenicillin. تُحضن الأطباق طوال الليل عند 37 °C، وفي صباح اليوم التالي ستظهر المستعمرات البكتيرية على الأطباق. بعد ذلك، اختر مستعمرة بكتيرية واحدة وأضفها إلى 1 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin لاختيار البكتيريا التي تحتوي على البلازميد. تُحضن المزرعة طوال الليل عند 37 °C مع الرج. وبعد التحضين الليلي، أضف 5 ml من مرق LB الذي يحتوي على 100 μg/ml من ampicillin إلى المزرعة، وتُحضن لمدة إضافية تتراوح بين 4-6 ساعات عند 37 °C.
بمجرد أن تصبح البكتيريا جاهزة، يجب تحضير أطباق الديدان الخاصة بتداخل RNA (RNAi) للتغذية. تحتوي أطباق ديدان RNAi على: الآغار، والماء، والكربينيسيلين، ومزيج وسط الديدان، و IPTG لتحفيز DNA polymerase T7 في البكتيريا التي تقوم بنسخ dsRNA في البلازميد. أضف 0.5 ml من المزرعة البكتيرية إلى أطباق ديدان RNAi واتركها للحضانة طوال الليل عند 37 °C، لتكوين طبقة بكتيرية (bacterial lawn).
قبل إضافة الديدان إلى أطباق RNAi، من المهم مزامنة المرحلة التنموية للديدان، لضمان أن أي اختلافات ملحوظة في النمط الظاهري ليست ناتجة عن اختلاف المراحل التنموية. ومن أجل مزامنة المراحل التنموية، ابدأ بتعقيم ملقط سلكي بلاتيني باستخدام اللهب.
استخدم ملقط الديدان لإضافة ديدان في المرحلة L4 إلى كل طبق RNAi، واتركها للحضانة طوال الليل عند 20 °C، حتى تصبح بالغات شابة واضعة للبيض. بعد ذلك، انقل البالغين الشباب إلى طبق RNAi جديد واتركهم للحضانة لمدة 6-8 ساعات عند 20 °C، وهي الفترة التي يتم خلالها وضع البيض. وبمجرد إزالة جميع البالغين، سيكون هذا البيض متزامناً تنموياً. وأخيراً، اترك الديدان تنمو على أطباق RNAi حتى تصل إلى المرحلة التنموية المطلوبة للتحليل.
من أجل تصور الديدان، يجب تحضير شريحة باستخدام وسادة أغار بتركيز 4%. أولاً، قم بتثبيت شريحتين زجاجيتين باستخدام شريط ملصقات، مما يخلق فواصل تضمن سمكاً موحداً لوسادة الأغار. ضع شريحة زجاجية نظيفة بين الفاصلين، ثم انقل حوالي 150 μl من الأغار المنصهر بتركيز 4% إلى الشريحة بواسطة الماصة. قم بتغطية الأغار المنصهر بسرعة بشريحة إضافية بشكل عمودي على الفواصل. افصل الشرائح برفق، وستلتصق وسادة الأغار بإحدى الشرائح.
بعد ذلك، أضف 10 μl من مادة مخدرة مثل sodium azide إلى وسادة الأغار لشل حركة الحيوانات. وباستخدام ملقط سلكي من البلاتين، انقل الديدان إلى وسادة الأغار التي تحتوي على المادة المخدرة ثم ضع غطاء الشريحة. أخيراً، افحص الديدان تحت المجهر. قارن الديدان التي خضعت لعملية RNAi gene knockdown مع عينات الضبط، وسجل الاختلافات في الحجم، ومرحلة النمو، والشكل الظاهري، وأنماط تمركز البروتينات الموسومة فلورياً، وأي أنماط ظاهرة أخرى محتملة.
يعد القدرة على إجراء عمليات فحص وراثي عكسي بسهولة واحدة من أكثر تطبيقات تداخل الحمض النووي الريبي (RNA interference) قيمة. والفحص الوراثي العكسي هو نهج يُستخدم لاكتشاف وظيفة الجينات عن طريق تثبيط مجموعة معروفة من الجينات وتقييم النتيجة الظاهرية. فعلى سبيل المثال، يمكن للباحثين استخدام مكتبة من البكتيريا التي تعبر عن الحمض النووي الريبي مزدوج السلسلة (dsRNA) لجميع الجينات تقريباً في الـ C. elegans الجينوم. يتم استزراع هذه البكتيريا في أطباق متعددة الآبار وتغذية الديدان بها. بعد ذلك، يمكن تقييم التأثيرات المظهرية لإسكات العديد من الجينات باستخدام تقنية تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)، مما يعطي رؤية حول الوظائف الطبيعية للجينات داخل الجسم الحي.
تُعد عمليات المسح الجيني المؤتمتة نوعاً من أنواع المسح الجيني العكسي التي تتميز بإنتاجية عالية للغاية. وفي عمليات المسح الجيني المؤتمتة، فإن كامل... C. elegans يمكن تثبيط الجينوم بسهولة كبيرة من خلال التعامل الروبوتي مع الآلاف من المستنسخات البكتيرية، وباستخدام أدوات متخصصة للتحليل الكمي.
على سبيل المثال، تخضع الديدان التي تعبر عن مراسل فلوري محول جينياً لجين الببتيد المضاد للميكروبات nlp 29 لعملية تثبيط بالتدخل RNAi لآلاف الجينات عن طريق التغذية البكتيرية. وفي الوقت ذاته، يتم تعريض الديدان لأبواغ فطرية، ومن ثم يمكن تقييم استجابة الببتيد المضاد للميكروبات تجاه الفطر.
غالبًا ما تُدرس عملية نمو ديدان *C. elegans* باستخدام تداخل الحمض الريبي النووي (RNAi). حيث يمكن للعلماء استخدام تداخل الحمض الريبي النووي لتعطيل أي جين (أو مجموعة من الجينات) محل الدراسة، وتقييم كيفية تأثير ذلك الجين بدقة على العمليات أثناء النمو و/أو التوقيت النمائي. على سبيل المثال، قد يكشف تعطيل الجينات عبر تداخل الحمض الريبي النووي عن الجينات التي تؤدي عملية تعطيلها إلى تأخير النمو، أو الجينات المشاركة في تطور الأعضاء.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول تداخل الرنا (RNA interference) في ديدان *C. elegans*. لقد استعرضنا كيفية عمل تداخل الرنا وكيفية استخدامه في C. elegans عن طريق التغذية البكتيرية. يُعد تداخل الحمض النووي الريبوزي (RNA interference) أداة قيمة لعمليات الفرز الجيني العكسي، بما في ذلك عمليات الفرز الآلية عالية الإنتاجية، كما أنه أداة مفيدة لدراسة التطور. شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does RNA interference work to silence genes in C. elegans?
Double-stranded RNA enters C. elegans cells after ingestion. The enzyme Dicer cleaves dsRNA into short interfering RNA (siRNA), 21-23 nucleotides long. The siRNA associates with the RNA-induced silencing complex (RISC) and binds target mRNA via complementary base pairing, leading to mRNA degradation and gene knockdown.
Q2: What is the first step in preparing bacteria for RNAi experiments?
Transform the plasmid encoding your target dsRNA into HT115(DE3) E. coli strain, which lacks RNA polymerase III and contains an IPTG-inducible T7 DNA polymerase gene. Also transform bacteria with an empty plasmid as a control. Spread transformed bacteria on LB agar plates containing tetracycline and carbenicillin, then incubate overnight at 37°C.
Q3: Why is worm synchronization important before RNAi treatment?
Synchronizing developmental stages ensures that observed phenotypic differences result from gene knockdown rather than developmental variation. Transfer L4 worms to RNAi plates overnight at 20°C to become young adults, then move them to new plates for 6-8 hours to lay eggs. This produces developmentally synchronized progeny for analysis.
Q4: How do researchers use RNAi to perform reverse genetic screens?
Reverse genetic screens knock down known genes from a library and assess phenotypic results to discover gene function. Researchers culture bacteria expressing dsRNA for many C. elegans genes on multi-well plates and feed them to worms. Phenotypic effects reveal normal in vivo gene functions and can be automated for high-throughput analysis of thousands of genes.
Q5: What happens during the bacterial culture preparation phase?
Select a single bacterial colony and add it to 1 ml LB broth with 100 μg/ml ampicillin. Incubate overnight at 37°C with agitation. Then add 5 ml fresh LB broth with ampicillin and incubate 4-6 hours at 37°C. This culture is then added to RNAi worm plates and incubated overnight at 37°C to create a bacterial lawn.
Q6: What phenotypes can be observed when analyzing RNAi-treated worms?
Compare RNAi knockdown worms with controls and note differences in size, developmental stage, morphology, and localization patterns of fluorescently tagged proteins. Scientists can also assess developmental timing effects, such as genes that delay development when knocked down, or genes involved in organ development and other biological processes.
Q7: How is a microscope slide prepared to visualize C. elegans?
Tape two glass slides with labeling tape as spacers. Place a clean slide between them and pipet 150 μl of 4% molten agar onto it. Cover with a perpendicular slide, then gently separate. Add 10 μl sodium azide anesthetic to the agar pad, transfer worms using a platinum wire pick, add a cover slip, and observe under a microscope.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
1:21
RNA Interference: The Concept
2:26
Preparing the Bacteria for RNAi in Worms
4:44
Preparing the RNAi Worm Plates and Culturing Worms
6:12
Assessing the Outcome of the RNAi Experiment
7:28
Applications
9:20
Summary