بروتوكول الاستجابة ململة الإرشاد للتحقيق اللدونة السلوكية في الحشرات: تطبيق لالأساسية، الطبية الحيوية، والبحوث الزراعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية تنفيذ الإشراط السلوكي لاستجابة انعكاسية بسيطة تجاه الغذاء في نحل العسل. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق صيد نحل العسل، وتثبيتها في أحزمة تقييد، وتغذيتها بكمية صغيرة من محلول سكري، ثم السماح لها بالتعود على التقييد. بعد ذلك، يتم اختيار النحل المخصص للإشراط الذي يُظهر دافعية كافية عند لمس قرون استشعاره بالسكروز.

خلال مرحلة الإشراط، يتم إقران تقديم الرائحة بمكافأة من السكروز لاستحثاث الاستجابة الشرطية. بعد ذلك، تقيس التجارب غير المعززة وجود الاستجابة أو غيابها، وزمن وصول الاستجابة، ومدتها. وتتمثل الخطوة النهائية في تحليل البيانات والعرض البياني لتجارب الإشراط والاختبار.

لقد تم تطبيق هذه التقنية بنجاح في دراسات بيولوجيا نحل العسل وصحته، حيث يتسم سلوك التعلم بحساسية خاصة تجاه المعاملات المزعجة مثل المبيدات الحشرية، مما يجعل من الممكن تقييم تأثير هذا النوع من المعاملات على سلوك نحل العسل عند مستويات دون القاتلة. ويساعد العرض المرئي لهذه الطريقة في فهم توقيت المثير المطلوب لتحقيق تكييف فعال والأخطاء الشائعة التي تقلل من الفعالية. وسوف يواجه الشخص المبتدئ في هذه الطريقة صعوبة في الاهتمام بالتفاصيل المطلوبة سواء في البروتوكول أو في الظروف المحيطة.

للبدء، قم بجمع النحل العامل من مدخل المستعمرة أثناء توقفه قبل المغادرة أو عند عودته من البحث عن الغذاء. يتم التقاط نحلة واحدة فقط في كل أنبوب. أمسك فتحة الأنبوب بشكل أفقي أو متجهاً للأسفل أثناء إغلاق الغطاء لمنع هروب النحلة.

بمجرد جمع النحل، عد إلى المختبر وضع بضع أنابيب في كل مرة في مزيج من الجليد والماء. بمجرد أن يصبح النحل غير قادر على الحركة، أخرج الأنبوب من الجليد فوراً لتجنب التعرض المفرط للبرودة، ثم ضع النحلة في سرج تثبيت. قم بتثبيت النحلة بحيث يكون صدرها الظهري مواجهاً للجزء المقطوع من الحامل، ورأسها فوق الحافة العلوية مباشرة.

اضغط برفق على النحلة بحيث تبرز أجزاء الفم خارج حافة الحامل. مرر شريطاً من الشريط اللاصق القوي (duct tape) بين الرأس والصدر من الجانب الظهري، وثبّت الطرف الحر بإحكام في جانب الحامل. تأكد من أن الشريط الموجود في السرج أملس ومشدود.

يجب ألا تكون هناك فجوات ملحوظة بين مقدمة حامل النحل والشريط اللاصق. ففي حال وجود فجوات، قد لا يتمكن النحل من تمديد per bois بشكل صحيح أو قد يتمكن من الهروب. اترك النحل لمدة 30 دقيقة تقريبًا للتعافي من عملية التسخير قبل البدء في التغذية.

بعد ذلك، في منطقة بعيدة تماماً عن منطقة التدريب، قم بتغذية كل نحلة بحوالي ثلاثة إلى أربعة µL من السكروز بتركيز 0.5 molar خلال الفترة الفاصلة بين التغذية والتكييف. ضع النحل في منطقة هادئة من المختبر وفي حاوية بلاستيكية تحتوي على مناشف ورقية مبللة. خلال هذا الوقت، وقبل بدء التكييف بدقائق قليلة، اختبر دافعية النحل للتغذية عن طريق لمس قرون استشعارهم بقطرة صغيرة من محلول السكروز بتركيز 0.5 molar.

لا تسمح لها بالتغذية خلال هذا الاختبار. إذا استجابت النحلات عن طريق بسّ خيوط استشعارها (psis)، فمن المرجح أنها تمتلك الدافع الكافي للتعلم ويمكن استخدامها في البروتوكول. عند الجاهزية، ضع حقنة الرائحة الزجاجية في حامل من صلصال النمذجة واضبطها بحيث تكون الفتحة الموجودة في الطرف العريض موجهة مباشرة نحو النحلات وعلى بُعد 10 E. يجب أن يكون طرف الحقنة على مسافة سنتيمتر واحد إلى سنتيمرين من النحلة، ثم ثبّت الوصلة التي تربط الخرطوشة بأنابيب تدفق الهواء ونظام الصمام فوق الطرف الضيق للحقنة.

في بداية كل تجربة، ضع النحلة المقيدة على الوتد في ساحة التكييف بحيث تكون قرون استشعارها موجهة مباشرة نحو خرطوشة الرائحة. اترك النحلة تستريح في الساحة لمدة تتراوح من 15 إلى 25 ثانية قبل بدء تحفيز الرائحة للسماح لها بالتعود على محيطها الجديد. اضغط على زر البدء لتفعيل آلية التوقيت الخاصة بتوصيل الرائحة.

راقب استجابة النحلة للرائحة بعد بدء التحفيز وقبل تقديم المثير غير الشرطي. بعد كل تجربة، اترك النحلة ترتاح في منطقة الإشراط لمدة تتراوح من 15 إلى 25 ثانية أخرى للسماح بتكوين الذاكرة الأولية. إن نقل النحلة في وقت مبكر جداً بعد التجربة سيقلل بشكل كبير من فعالية كل تجربة إشراط.

لتقديم السكروز، أمسك طرف الإبرة على مسافة تتراوح بين سنتيمترين وثلاثة سنتيمترات من النحلة أثناء تقديم الرائحة. استخدم حافة ساحة التدريب لمنع اهتزاز المحقنة، حيث يمكن أن تشتت هذه الحركة انتباه النحلة. ستصدر إشارة تغذية أثناء تقديم محفز الرائحة.

بمجرد صدور إشارة التغذية، المس قرون الاستشعار بخفة حتى تمد النحلة خرطومها، ثم قم بتغذية النحلة. إن التوقيت بين تقديم الرائحة وتقديم السكروز أمر بالغ الأهمية. ومن الناحية المثالية، يجب أن يتداخل هذان المحفزان لفترة وجيزة.

إذا انقضت أكثر من بضع ثوانٍ بين تقديم الرائحة وتقديم السكروز، فسيقل أداء عملية الإشراط. بعد الإشراط، استخدم تجارب اختبار غير معززة لتقييم مدى تذكر النحل للارتباط الشرطي. أولاً، قم بتثبيت كاميرا فيديو على حامل ثلاثي الأرجل فوق منطقة التدريب، وقم بضبط تركيز الكاميرا على مقدمة رأس النحلة بحيث تظهر قرون الاستشعار والخرطوم بوضوح تام.

تأكد من وضع مصباح LED صغير، يشير إلى تقديم محفز الرائحة، في منطقة خلف النحلة بحيث يكون مرئياً في الفيديو، ولكن ليس للنحلة. يتيح ذلك تحديد وقت بدء وانتهاء الرائحة أثناء التحليل. وللحصول على النتائج الأكثر اتساقاً، استخدم خراطيش رائحة محضرّة حديثاً للاختبار بمجرد الانتهاء من إعداد كل شيء.

ابدأ الاختبار بتقديم الرائحة كما هو موضح سابقاً. ابدأ التسجيل قبل 20 ثانية من تقديم الرائحة واستمر في التسجيل لمدة 20 ثانية على الأقل بعد ذلك. بعد الاختبار، استخدم برنامج تحرير الفيديو لتقييم استجابة كل نحلة للشرط المثير.

استخدم نظام تسجيل ثنائي لتقييم استجابة تمدد الـ psis، حيث يتم تسجيل الاستجابات إما كإيجابية أو سلبية. يتم تسجيل استجابة B كإيجابية عندما يمتد الـ B psis إلى ما بعد الخط الواصل بين طرفي الفكوك المفتوحة فقط عندما يمد B الـ prob bois بعد بدء ظهور الرائحة، ولكن قبل انتهائها. يتم تسجيل استجابة B كسلبية في حال عدم حدوث تمدد للـ prob Bois خلال التجربة، أو إذا تمدد الـ Pro Bois بعد انتهاء الرائحة. يمكن جمع معايير أخرى مثل زمن الاستجابة للتمدد، وعدد ومدد استجابة التمدد الإجمالية للظروف.

زادت المثيرات على مدار تجارب الإشراط اللاحقة. وانخفضت الاستجابات لروائح الاختبار الجديدة، التي اختلفت عن المثير في طول السلسلة الكربونية أو موضع الكربون-كربون، بما يتناسب مع درجة الاختلاف بين مثير الإشراط ورائحة الاختبار الجديدة. وتوضح هذه البيانات التباين والنجاح في الإشراط بين الباحثين الجدد.

اختلفت الاستجابات تجاه octal اعتماداً على المجموعة التي أجرت الاختبار. وخلال تجارب الاختبار، أحدثت الرائحة المستخدمة كمحفز شرطي أقوى استجابة. وعند استخدام octal كمحفز شرطي، كانت الاستجابة أثناء الاختبار أقوى مقارنةً بـ methyl cyclone، وهي رائحة جديدة.

وبالمثل، أدى ميثيل سيكلون إلى استجابات أقوى عندما استُخدم كمثير شرطي. وعند استخدام الاقتران العكسي، انخفضت الاستجابة الشرطية لتصل إلى مستوى قريب من مستوى الرائحة الجديدة، مما يوضح أهمية التوقيت الدقيق لإتمام عملية الاشتراط بنجاح. وبعد تطوير هذه التقنية، مهدت الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف الأسس العصبية للتعلم والذاكرة في الكائنات النموذجية الحشرية مثل نحل العسل.

لا تنسَ أن التعامل مع الحشرات، وخاصة نحل العسل، قد يكون خطيراً. تأكد من ارتداء معدات الوقاية المناسبة عند العمل مع هذه الحيوانات.