تحليل الخلوي الحيوانات المنوية: الأعمال التحضيرية لايف والثابتة من

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح وتحضير خصى ذباب الفاكهة للفحص المجهري. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح أزواج الخصى من بطن الذباب الذكر. وتتمثل الخطوة الثانية في تمزيق الخصى عند المستوى المناسب من النمو، ثم سحقها لتحرير الخلايا الموجودة بداخلها.

بعد ذلك، يتم تثبيت الخصيتين المهروسة ثم تحضينهما في أجسام مضادة أولية وثانوية. وتتمثل الخطوة النهائية في تثبيت النسيج على شريحة للتصوير. وفي النهاية، يُستخدم مجهر تباين الطور أو مجهر التألق المناعي لفحص الخلايا في مراحل مختلفة من عملية تكوين الحيوانات المنوية للكشف عن العيوب ودراسة المورفولوجيا، ولملاحظة التموضع دون الخلوي لمجموعة متنوعة من البروتينات.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا التطور، مثل تحديد الأدوار الحاسمة للبروتينات أثناء تقدم عملية تكوين الحيوانات المنوية. ويُعد العرض المرئي لعملية تشريح خصى ذباب RAs أمراً بالغ الأهمية، لأن المبتدئ في هذا الإجراء قد يواجه في البداية صعوبة في تحديد موقع الخصى داخل بطن الذبابة. بالإضافة إلى ذلك، فإن توضيح الطريقة الأكثر نجاحاً لإجراء عملية سحق الأنسجة بصرياً أسهل من وصفها بالكلمات.

لبدء عملية التشريح، يتم تخدير الذباب في زجاجة أو قارورة باستخدام تدفق من ثاني أكسيد الكربون. ثم تُنقل الذباب المخدرة إلى منصة تشريح الذباب. يتم فرز الذباب تحت مجهر تشريحي باستخدام فرشاة صغيرة لجمع ما يقرب من ست إلى ثمانة ذكور من سلالة oph ذات النمط الجيني المطلوب.

بعد ذلك، قم بإزالة الأجنحة من كل ذبابة باستخدام الملاقط، وذلك لمنع الذباب من الطفو في السائل. وأثناء عملية التشريح، أضف 500 µL من المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات أو PBS على شكل قطرة واحدة فوق طبق تشريح مغطى بالسيليكون وذو خلفية سوداء.

بعد ذلك، وجه الملاقط نحو الطرف الأمامي لإحدى الذباب منزوعة الأجنحة. أمسكها من منطقة الصدر واغمرها في قطرة PBS. حدد البنية ذات اللون البني الداكن الموجودة في الطرف الخلفي من البطن البطني، واستخدم زوجاً آخر من الملاقط للإمساك بالأعضاء التناسلية الخارجية وسحبها للخلف حتى تنفصل عن البطن.

في معظم الحالات، تتم إزالة الخصيتين والحويصلات المنوية والغدة الملحقة من البطن جنباً إلى جنب مع الأعضاء التناسلية الخارجية. ومع ذلك، في حال عدم حدوث ذلك، أدخل زوجاً من الملاقط في البطن واستخرج الخصيتين برفق. افصل الخصيتين عن الغدد الملحقة والأعضاء التناسلية الخارجية باستخدام زوجين من الملاقط.

ميز الخصى من النوع البري عن الأنسجة البيضاء المجاورة من خلال لونها الأصفر. ولتحضير العينة للتصوير الحي، استخدم ملقطاً لوضع زوجين إلى ثلاثة أزواج من الخصى برفق في قطرة من PBS بحجم 4 إلى 5 µL على شريحة غطاء زجاجية مربعة. بعد ذلك، قم بتمزيق.

افتح كل خصية باستخدام ملقط عند مستوى مناسب لزيادة وجود أنواع الخلايا الجرثومية المطلوبة في التحضير. ستخرج محتويات الخصية من المنطقة الممزقة إلى الشريحة. خلال خطوة الهرس لزيادة تركيز الخلايا الجذعية المنوية والخلايا المنوية، قم بتمزيق الخصية بالقرب من طرفها القمي لتعزيز التركيز.

بالنسبة للخلايا المنوية والطلائع المنوية، قم بتمزيق الخصيتين عند موضع قاعدي قليلاً بالنسبة للمستوى الأول لزيادة تركيز الخلايا الجرثومية الأكثر نضجاً. قم بتمزيق الخصيتين في منطقة أقرب إلى بداية الانحناء. الخطوة التالية هي سحق الخصيتين عن طريق وضع شريحة مجهرية بلطف فوق غطاء الشريحة.

تجنب تسليط الضغط يدويًا وتفادَ حبس فقاعات الهواء. استخدم العينة خلال 15 دقيقة من التحضير لمراقبة الخلايا الحية. وباستخدام مجهر تباين الأطوار، قم بسحب أي سائل زائد بلطف من تحت غطاء الشريحة باستخدام منديل تنظيف للسماح بتسطيح التحضير حتى تصبح الخلايا الجرثومية في بؤرة التركيز بوضوح.

قم بتجميد الشرائح المُعدة التي تحتوي على خصى مهروسة تجميدًا سريعًا عن طريق غمرها باستخدام ملقط معدني في النيتروجين السائل حتى يتوقف تصاعد الفقاعات من السائل. أزل غطاء الشريحة فورًا باستخدام شفرة حلاقة. ثم انقل الشرائح باستخدام الملقط المعدني إلى حامل شرائح زجاجي مبرد مسبقًا ومليء بـ 95%ethanol مبرد بالثلج، واحفظ العينة عند درجة حرارة -20 °C لمدة 10 دقائق.

انقل الشرائح التي تمت موازنتها إلى حامل شرائح زجاجي مملوء بـ 4%formaldehyde في PBS بالإضافة إلى 0.1%Triton X 100 أو PBST، واحفظها في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. ثم انقل الشرائح إلى حامل مملوء بـ PBS. اغسل الشرائح في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة عن طريق التخلص من المحلول الموجود في الحامل واستبداله بمحلول PBS جديد.

كرر عملية الغسل مرة واحدة. تخلص من محلول PBS واغمر الشرائح في محلول PBST لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لنفاذية الأغشية الخلوية. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات في محلول PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وارسم دائرة حول النسيج المهروس على الشريحة باستخدام قلم حاجز كاره للماء من أجل حصر محاليل الأجسام المضادة والحفاظ على رطوبة النسيج في جميع الأوقات أثناء إجراء التصبيغ المناعي.

ثم أضف من 30 إلى 40 µL من الجسم المضاد الأولي المخفف في PBST إلى النسيج الموجود داخل الدائرة. قم بحضن الشريحة في غرفة رطبة ومظلمة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 °C بعد الحضن في الجسم المضاد الأولي. اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، أضف 30 إلى 40 µL من جسم مضاد ثانوي مقترن بفلوروفور ومخفف في PBS إلى النسيج، ثم حضنه في الظلام لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اغسل الشرائح ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 30 إلى 40 µL من محلول DAPI إلى النسيج الموجود داخل الدائرة.

ضع غطاء شريحة زجاجياً برفق فوق النسيج، مع توخي الحذر الشديد لتجنب حبس أي فقاعات هوائية. في حالة ظهور فقاعات هوائية، حرك غطاء الشريحة بعناية دون إتلاف العينة حتى تخرج الفقاعات من جوانب الغطاء. جفف السوائل الزائدة من حواف الشريحة باستخدام منديل تنظيف.

ثم قم بتثبيت غطاء الشريحة باستخدام طلاء الأظافر، وافحص الخلايا المصبوغة مناعياً باستخدام مجهر فلوري خلال ثلاث إلى أربع ساعات. يوضح هذا الرسم التوضيحي مواقع مستويات نضج الخلايا المختلفة داخل خصيتي Drosophila. يحتوي المستوى الأول على خلايا أصغر سناً في المراحل المبكرة من عملية تكوين الحيوانات المنوية، بينما يحتوي المستوى الثالث على خلايا حيوانية منوية أكثر نضجاً.

يحتوي المستوى الثاني على مجتمع مختلط من الخلايا الجرثومية في مرحلة الانقسام الاختزالي والخلايا ما بعد الانقسام الاختزالي. وتظهر صورة تباين الطور المقابلة تحرر الخلايا المنوية والمنطوية على الخلايا المنوية الأولية المبكرة والمتأخرة عند تمزيق الخصية عند المستوى الأول. كما يشير السهم الأصفر إلى اندماج خليتين أو أكثر مترابطتين نتيجة لعدم اكتمال عملية انقسام السيتوبلازم.

تُظهر هذه الصورة الناتجة عن عملية الضغط صورة مقابلة بتباين الطور توضح تحرر الخلايا المنوية الأولية المتأخرة والخلايا ما بعد الانقسام الاختزالي، بما في ذلك الطلائع المنوية المستديرة، والطلائع المنوية المستطيلة، والحيوانات المنوية الناضجة عند تمزق الخصية في المستوى الثاني. يمكن استخدام تصوير تباين الطور للخصى المضغوطة أيضاً لتحديد العيوب بسهولة في الطلائع المنوية المستديرة الوفيرة. تظهر هنا الطلائع المنوية من النوع البري ذات نواة فاتحة في طور التباين، وهي متصلة بتجمع ميتوكوندري واحد داكن في طور التباين وبحجم متساوٍ تقريباً.

في المقابل، تحتوي الطلائع المنوية من خصيتي Aun على نوى صغيرة متعددة وتجمع ميتوكوندري واحد كبير نتيجة فشل انقسام السيتوبلازم وأخطاء في فصل الكروموسومات. الصور ذات التدرج الرمادي المعروضة هنا مأخوذة من تحضير لخصى مهروسة مصبوغة بكواشف تحدد الأنابيب الدقيقة والحمض النووي DNA والجسم المركزي بالألوان. وتظهر الصور مجتمعة خلية منوية منقسمة، ومجالاً واسعاً من الطلائع المنوية المستديرة، وحزمة من الحيوانات المنوية الناضجة. وبمجرد إتقان تحضير العينات، يمكن إجراء مجهر تباين الطور في غضون 20 إلى 30 دقيقة.

يمكن إتمام تحضير العينات للفحص المجهري المناعي الفلوري في غضون ست ساعات إذا نُفذت العملية بشكل صحيح. وبالإضافة إلى معالجة خصيتي oph للفحص المجهري، يمكن استخدام الخصيتين المستأصلتين بدلاً من ذلك للتحليل البيوكيميائي للبروتينات.