JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Neuroscience

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

التحليل الوظيفي للتغذية اليرقات الدائرة في ذبابة الفاكهة

Full Text

10,522 Views

09:23 min

November 19, 2013

DOI: 10.3791/51062-v

Parag K. Bhatt¹, Wendi S. Neckameyer¹

¹Department of Pharmacological and Physiological Science,Saint Louis University School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

دائرة التغذية في يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن يخدم نموذج بسيط لكنها قوية تسمح التغيرات في معدل التغذية لتكون مرتبطة مع بعض التعديلات في الدوائر العصبية فموي معدي. وتتألف هذه الدائرة من الخلايا العصبية هرمون السيروتونين المركزية التي ترسل التوقعات إلى السنانير الفم وكذلك المعى الأمامي.

Transcript

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نظام نموذج ذبابة الفاكهة لربط المخرجات السلوكية بالتغييرات في الهندسة العصبية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء أقفاص سكانية من ذبابة الفاكهة البالغة أولا لجمع اليرقات. الخطوة التالية من الإجراء هي تقييم القدرة الحركية لليرقات المتأخرة من الثانية إلى أوائل العصر الثالث.

الخطوة الثالثة هي تقييم سلوك تغذية اليرقات من خلال مراقبة امتداد وتراجع خطافات الفم. الخطوة الأخيرة هي تشريح وإعداد عينات بطينية مثبتة من يرقات الطور الثالث المتأخرة باستخدام تقنيات كيميائية مناعية. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج كيف ترتبط الانحرافات في الهندسة العصبية أثناء التطور بالتغيرات السلوكية من خلال الاستخدام المشترك للمقايسات السلوكية والفحص المجهري المناعي.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو فهم أفضل لتطور العمارة العصبية ، مما يسمح للمرء بفهم تقدم الأمراض العصبية بشكل أفضل. وعرض الإجراء سوف يكون prag bot طالب دراسات عليا في مختبري. حافظ على أقفاص ذبابة الفاكهة عند 25 درجة مئوية في دورة مظلمة فاتحة مدتها 12 ساعة.

طالما أن المجموعات الضابطة والتجريبية تتعرض لنفس ظروف الإضاءة ، فيمكن إجراء هذه التقنية في بيئة معملية قياسية. باستخدام مجموعات محددة ، قم بجمع اليرقات عن طريق السماح للإناث بوضع البيض طوال الليل على عصير التفاح. تقوم ألواح أجار بتغيير الطبق في الصباح ووضع قطعة صغيرة من الخميرة في وسط الطبق الذي تم جمعه.

ستجذب الخميرة اليرقات المفرغة ، وتسمح للبيض بالتطور لمدة 24 ساعة عند 25 درجة مئوية ، وفي اليوم التالي ، تجمع يرقات الطور الأول من العجينة. باستخدام ملعقة معدنية ، انقل اليرقات إلى عصير تفاح طازج أو طبق عصير عنب. يمكن إضافة معجون خميرة إضافي لتغذية اليرقات حتى يتم إجراء المقايسات لجمع يرقات الطور الثاني والثالث المبكر مما يسمح للطور الأول بالتقدم في العمر لمدة 40 إلى 48 ساعة.

خلال هذا الإطار الزمني ، تكون معدلات التغذية ثابتة في التجميع. ترفع يرقات الطور الثالث المتأخرة اليرقات في زجاجات. يمكن أن يكون رفع يرقات الطور الثالث المتأخر على أطباق العصير ضارا بسبب تراكم الزراعة في نظام المعدة الجسدي.

يمكن تأكيد عمر اليرقات من خلال مورفولوجيا خطاف الفم حيث توجد تغييرات واضحة في هذا الهيكل. مع كل قالب يرقات ، اجمع يرقات الطور الثاني المتأخر وأوائل الطور الثالث عن طريق غسل طبق العصير بالماء برفق وعلى نطاق واسع وصب اليرقات في مرشح شبكي ، ثم تابع التحليل السلوكي. ضع يرقة واحدة في أواخر الثانية إلى أوائل العصر الثالث على ركيزة 2٪ acer في طبق زراعة أنسجة 100 ملم ، واترك اليرقات تتأقلم لمدة 30 ثانية لمدة دقيقة واحدة بالضبط.

باستخدام إحصاء مضاد ، كل حركة خلفية إلى أمامية فوق الركيزة ، سجل كل انقباض يحدث على مدى ثلاثة أرباع جسم. عندما تتأرجح اليرقات جنبا إلى جنب، ولكنها لا تغير موضعها فعليا، لا يتم تسجيل هذه الحركات. في بعض الأحيان ، يولد الانقباض الأمامي الكامل للخلف حركة إلى الخلف مثل الحركة الأمامية.

يتم تسجيل الحركة الخلفية أيضا. استبدل لوحة الفحص بعد اختبار 10 على الأكثر في المجموع. قم بإجراء ما لا يقل عن 20 تسجيلا لكل حالة تجريبية.

سجل كل يرقة مستخدمة في الفحص الحركي في مقايسة التغذية باستخدام إينوكس حاد. رقم خمسة ، ملاقط. انقل اليرقة بعناية من الصفيحة الزراعية الحركية إلى وسط صفيحة مملوءة بالزراعة مغطاة بخمسة ملليلتر من محلول الخميرة المتجانس.

في محلول الخميرة ، ستبقى اليرقات في مكانها إلى حد كبير وترتبط تغذية العلف ارتباطا مباشرا بمعدل تقلصات خطاف الفم ، والتي ينظر إليها على أنها امتداد وتراجع حقوق البلعوم الرأسي السماح لليرقات بالتأقلم لمدة 30 ثانية ، ثم لمدة دقيقة واحدة ، سجل عدد تقلصات خطاف الفم باستخدام عداد. ابدأ بتحميل الفورمالديهايد المحضر حديثا بنسبة 4٪ EM في PBS في زجاج بثلاثة آبار. ثم انقل يرقة الطور الثالث المتجولة إلى طبق تشريح باستخدام PBS.

باستخدام ملقط واحد ، امسك الطرف الخلفي والآخر أمسك خطافات الفم أثناء الإمساك بالطرف الخلفي غير المتحرك. اسحب خطافات الفم برفق للوصول إلى الشجاعة. إزالة أي أنسجة مرتبطة مثل الغدد اللعابية, الدماغ, الجسم الدهني, وهلم جرا.

ثم انقل كل أمعاء إلى طبق الآبار الثلاثة الذي يحتوي على إصلاح الفورمالديهايد. احتضان الأحشاء عند أربع درجات مئوية طوال الليل في صندوق زراعة الأنسجة غير الشفاف. في اليوم التالي قبل إزالة محلول التثبيت ، قم بإزالة الجزء المعدي وقص الأمعاء الوسطى بالقرب من البطينين المثبتين بحيث يمكن رؤية الإسقاطات بوضوح دون عوائق.

الآن ، استبدل المثبت ب XPBT واحد واترك الأنسجة تحتضن لمدة 10 دقائق مع هزاز لطيف. قم بإجراء غسل PBT ست مرات. بعد ذلك ، أضف السيروتونين ، مما سيعزز إشارات السيروتونين دون التأثير على الهندسة المعمارية العصبية.

ثم احتضان الشجاعة لمدة ساعة عند أربع درجات مئوية دون تأرجح. بعد ساعة ، اغسل الشجاعة جيدا باستخدام PBT ست مرات كما هو الحال لإزالة الجسم المضاد الأساسي. ثم احتضان الشجاعة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية مع الجسم المضاد الأساسي المضاد السيروتونين.

في اليوم التالي ، كرر غسلات PPT الستة واتبعها بحضانة الجسم المضاد الثانوي عند أربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. استخدم واحدا إلى 400 Alexa floor 5 68 ماعز مضاد للولايات المتحدة ، أو واحد إلى 400 مضاد للأرانب IgG. قم بإزالة الجسم المضاد الثانوي باستخدام نظام غسيل PBT ثم احتضان الشجاعة في أربعة مللي مولار كربونات الصوديوم مع هزاز لطيف لمدة 10 دقائق.

يمكن بعد ذلك تركيب الأحشاء في 4٪ N بروبيل غالات مع 20 مللي مولار كربونات الصوديوم كمخزن مؤقت وعرضها تحت التألق عند تكبير 400 × للتحليل. تجنب التقاط الصور في الطرف الخلفي من البطينين المثبت لأن هذه الألياف مجمعة بإحكام. المزيد من الألياف الخلفية في الأمعاء الوسطى أكثر تشعبا لأنها تفتت بمجرد دخولها الأنسجة.

يمكن قياس ألياف Neurite باستخدام البرامج التجارية مثل neuro lucita و neuro Explorer عن طريق العمل عليها يدويا أو باستخدام البرامج المتاحة مجانا. ستجعل صور تتبع النيريت البسيطة غير الواضحة من الصعب التمييز بين الألياف والدوالي ولا ينبغي استخدامها إذا كانت بنية الألياف يمكن تمييزها بوضوح عن الخلفية. وإذا كان من الممكن تحديد الدوالي الفردية على طول النيريت ، فإن التحضير مناسب للتحليل.

أيضا ، إذا كان من الممكن تحديد الدوالي الفردية من بقية الألياف ، فهذا مؤشر آخر لجودة الصورة للتحليل. يتم تجميع الألياف المحورية البارزة من الدماغ في عصب التكرار وهي غير مناسبة للتحليل حتى تصل إلى البطين المثبت حيث تنفصل وتعصيب. نظام المعدة البخاري قم بتحليل جميع الألياف باستثناء تلك الموجودة خارج نطاق التركيز.

في بعض الحالات ، تنحني الألياف بين مستويات متعددة من التركيز ، وتتبع إسقاطات الألياف الفردية من الدماغ إلى البطينين المثبتة وتحسب الدوالي والفروع ، ثم تحسب تواتر الدوالي الكبيرة لكل وحدة طول. تعد دراسة دائرة التغذية هرمون السيروتونين فعالة في تحليل تأثير عوامل معينة على نمو الجهاز العصبي. من خلال تحديد معدل التغذية ، من الممكن ربط البنية المحورية لدائرة التغذية بإخراجها الوظيفي.

لا يظهر الفحص الحركي أي فرق في الاستجابات الحركية بين الأنماط الجينية الضابطة والطافرة. إذا كانت الطفرات تؤثر فقط على دائرة التغذية ، فإن الجسم الإهليلجي المتحور يفتح. يحتوي EBO three على عيب هيكلي في الجسم الإهليلجي للمجمع المركزي.

سلالة الوالدين من النوع البري. كشفت CSWU أن EO ثلاثة ينتج عنه تغذية مكتئبة بينما لا تتأثر الحركة. أثرت العيوب التنموية في الطفرات الثلاثة EO على بنية البول في القناة الهضمية.

أظهرت هذه اليرقات المزيد من التفرع بالإضافة إلى المزيد من الدوالي ، الصغيرة والكبيرة ، على طول اليورات. لاحظ أن العقد الفرعية عند الأسهم ، والدوالي عند رؤوس الأسهم ، والدوالي الكبيرة عند علامة النجمة. تم تحديد هذه التغييرات في التفرع العصبي للتحليل الإحصائي.

عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر عدم إتلاف اليرقات أو عينات الأنسجة المقطوعة.

Explore More Videos

علم الأعصاب العدد 81 العصبية مسارات ذبابة الفاكهة المجهري تصوير الأعصاب والسلوك آليات السلوك الدوبامين المناعية محوار مقدم المعدة السيروتونين دوالي نموذج حيواني