التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام في المختبر الالتزام الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص قدرة بروبيوتيك العقدية خلية الليفاريوس على تثبيط التصاق المكورات الرئوية بخط الخلايا الظهارية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير الطبقات الأحادية للخلايا الظهارية CCL 23 أولا. في صفيحة 24 بئر ، تتم إضافة المكورات السلوفرية والمكورات الرئوية التالية إلى الطبقة الأحادية بالتسلسل ويتم تحضين الخلايا.

في الخطوة الأخيرة ، يتم غسل الآبار لإزالة البكتيريا غير الملتصقة. يتم تحلل الخلايا الظهارية CCL 23 ويتم حصاد محتويات البئر. في النهاية ، يمكن تقييم تأثير اللعاب على التصاق بالمكورات الرئوية عن طريق تحديد عدد المكورات الرئوية المرتبطة بالخلايا.

تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الأمراض المعدية ، مثل ما إذا كانت البروبيوتيك يمكن أن تمنع التصاق مسببات الأمراض البكتيرية مثل المكورات الرئوية. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما بدأنا في التحقيق في الاستخدام المحتمل للتنويم المغناطيسي للعصيات اللبنة ، GG ، والبروبيوتيك الأخرى في الجهاز التنفسي. يوضح هذا الإجراء جين مانينغ وزين لطلاب الدكتوراه من مختبرنا في اليوم السابق للتجربة انقسام إلى ثقافة التقاء ، CCL 23 الخلايا الظهارية ، ثم تخفيفها في وسائط Prewarm إلى 150،000 خلية لكل تركيز مليلتر في أنبوب معقم 50 ملليلتر.

البذرة التالية ، ملليلتر واحد من الخلايا لكل بئر في صفيحة زراعة أنسجة 24 معالجة وتحتضن الخلايا بين عشية وضحاها. ثم باستخدام حلقة 10 ميكرولتر ، قم بتلقيح 10 إلى 12 مستعمرة منفصلة جيدا من كل مزرعة بكتيرية في 10 مليلتر من مرق تود هيويت بالإضافة إلى 0.5٪ مستخلص الخميرة. دوامة وجيزة واحتضان الثقافات لمدة 14 إلى 16 ساعة في يوم التجربة.

دوامة كل من المزارع البكتيرية لمدة ثلاث إلى خمس ثوان ، ثم أضف 100 ميكرولتر من المكورات الرئوية و 100 ميكرولتر من اللعاب في أنابيب مسبقة التدفئة ، تحتوي على 10 ملليلتر من المرق. دوامة الأنابيب الملقحة لمدة ثلاث إلى خمس ثوان واحتضانها عند 37 درجة مئوية لتنمية الثقافات إلى منتصف مرحلة السجل. بعد التأكد من الطلاقة المشتركة بنسبة 80٪ على الأقل لثقافة الخلايا CCL 23 ، استخدم ماصة النقل لإزالة الوسائط من كل بئر من لوحة 24 بئر ، مع إمالة اللوحة قليلا لتجنب إزعاج الطبقة الأحادية للخلية ثم غسل الآبار مرتين عن طريق إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من PBS قبل التسخين وإزالة السائل برفق باستخدام ماصة نقل.

قم بإمالة اللوحة أثناء الغسيل للمساعدة في الحفاظ على الطبقة الأحادية بعد الغسيل الثاني. أضف 500 ميكرولتر من وسائط التسخين إلى كل بئر وأعد الطبق إلى الحاضنة أثناء تحضير المزارع البكتيرية. أولا ، قم بقياس الكثافة الضوئية لمليلتر واحد من ثقافة الليفاريوس عند المادة الماصة 600.

ثم انقل خمسة ملليلتر من ثقافة Sal Levarius إلى أنبوب سعة 10 ملليلتر وجهاز طرد مركزي إلى أنبوب لمدة أربع دقائق عند 1،870 Gs في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من snat Resus, الحبيبات في 200 إلى 1000 ميكرولتر من نقطة 85٪ كلوريد الصوديوم اعتمادا على قراءة OD إلى تركيز نهائي من حوالي 1.5 في 10 إلى المستعمرة التاسعة تشكيل وحدات لكل مليلتر. تعد إضافة العدد الصحيح من البكتيريا أصعب جزء من التجربة حيث لا يتم تحديد العدد الفعلي للبكتيريا المضافة حتى يتم إجراء عد المستعمرات في اليوم التالي.

الآن انقل لقاح اللعاب المعلق إلى أنبوب fuge دقيق يسمى عالية. قم بتخفيف التركيز العالي عند واحد إلى 10 وواحد إلى 100 في نقطة أكثر 85٪ كلوريد الصوديوم لعمل تركيزات متوسطة ومنخفضة من ألفار لأنابيب دوامة الفحص بين التخفيفات لإنشاء آبار التحكم في الهيبارين. قم بإزالة 40 ميكرولترا من الوسائط من كل بئر تحكم وأضف 50 ميكرولترا من الهيبارين إلى التركيز النهائي البالغ 100 وحدة لكل مليلتر لكل بئر.

أضف 10 ميكرولترات من النقطة ، و 85٪ كلوريد الصوديوم إلى خلايا CCL 23 فقط ، وخلايا CCL 23 بالإضافة إلى المكورات الرئوية تعمل فقط على دوامة جميع تركيزات مناطق SIV. ثم أضف 10 ميكرولتر من تركيزات مختلفة غير مخففة من واحد إلى 10 وواحد إلى 100 سيف إلى الآبار المناسبة لتعزيز التلامس البكتيري مع الخلية. قم بالطرد المركزي أحادي الطبقة على اللوحة لمدة ثلاث دقائق عند 114 Gs في درجة حرارة الغرفة ثم احتضان اللوحة لمدة ساعة أثناء احتضان الخلايا بشكل متسلسل ، قم بتخفيف مخزون اللعاب بشكل متسلسل في نقطة 85٪ كلوريد الصوديوم واستخدم موزعا معقما لتفريق 100 ميكرولتر من 10 إلى سالب خمسة ، و 10 إلى سالب ستة و 10 إلى سالب سبعة تخفيفات مكررة على ألواح أجار دم الحصان.

استزراع الصفائح في وضع مقلوب بين عشية وضحاها باتجاه نهاية الطبقة الأحادية كحضانة مرهم. قم بقياس الكثافة البصرية لمزرعة المكورات الرئوية ثم قم بتدوير مليلتر واحد من الخلايا. يقوم Resus بتعليق الحبيبات في 300 إلى 2000 ميكرولتر من نقطة 85٪ كلوريد الصوديوم اعتمادا على قراءة OD إلى تركيز نهائي يبلغ حوالي 150 مليون وحدة تشكيل مستعمرة لكل مليلتر.

ثم أضف 10 ميكرولترات من المكورات الرئوية غير المخففة إلى جميع الآبار باستثناء آبار التحكم السلبية ، وقم بالطرد المركزي للوحة 24 بئر مرة أخرى ثم احتضان المزارع المشتركة لمدة ثلاث ساعات أثناء خطوة الحضانة. قم بتخفيف مخزون المكورات الرئوية بشكل متسلسل ووصفه بطريقة مشابهة للساليفاريوس. بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، افحص الخلايا الموجودة تحت المجهر بحثا عن أي تأثير اعتلال خلوي.

الآن قم بإزالة الوسائط من كل بئر واغسل المزارع المشتركة برفق ثلاث مرات باستخدام XPBS واحد لإزالة البكتيريا غير الملتصقة ، مع الحرص على عدم إزعاج الطبقات الأحادية. ثم يغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ احفر لمدة سبع دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، أضف 800 ميكرولتر من THB لكل منها.

ماصة البئر لأعلى ولأسفل عدة مرات وحصاد معلقات الخلية من كل بئر في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة. أخيرا ، قم بتخفيف المكورات الرئوية الملتصقة بشكل متسلسل ثم عد المستعمرات في اليوم التالي على ألواح التخفيف المناسبة. لتحديد كمية المكورات الرئوية والفار في هذا الجدول ، يتم عرض نتائج تجربة تمثيلية تمت فيها إضافة المكورات الرئوية إلى خلايا CCL 23 بعد ساعة واحدة من إضافة السلوفار.

تم قياس الالتصاق بالمكورات الرئوية من خلال كل من العد القابل للحياة والمضاءة. كانت نتائج A-Q-P-C-R متسقة بين الطريقتين لكل من العدد المطلق للبكتيريا والنسبة المئوية للالتصاق. تطبيع لعدد المكورات الرئوية الملتصقة في الآبار التي تحتوي على المكورات الرئوية وحدها.

يستخدم الهيبارين كعنصر تحكم حيث من المعروف أنه يمنع التصاق بالمكورات الرئوية. لذلك ، فإن تقليل الالتصاق بحوالي 40٪ أو أكثر في عينات المكورات الرئوية بالإضافة إلى عينات الهيبارين مقارنة بالمكورات الرئوية وحدها يدل على نجاح الفحص. نظرا لأن اللعاب يمنع الالتصاق بالمكورات الرئوية بطريقة تعتمد على الجرعة حيث أدى التركيز العالي للعالب البالغ حوالي 10 من المكورات اللعابية إلى المكورات الرئوية الواحدة إلى أقل التصاق بالمكورات الرئوية.

توضح هذه الطعوم التصاق المكورات الرئوية بخلايا CCL 23 عند إضافة اللعاب ، قبل ساعة واحدة من المكورات الرئوية بشكل متزامن ، أو بعد ساعة واحدة من المكورات الرئوية. يعتبر ألفار أكثر فاعلية في تثبيط التصاق بالمكورات الرئوية عند إضافته قبل المكورات الرئوية ، حيث أن الجرعات العالية والمتوسطة من ألفار قللت بشكل كبير من التصاق بالمكورات الرئوية في اختبار ما قبل الإصدار. في حين أن طبعة Coit وطبعة ما بعد الاختبار فقط هي الجرعات العالية من Slovar التي تمنع الالتصاق بالمكورات الرئوية.

لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء فحص في المختبر لقياس تثبيط التصاق بالمكورات الرئوية بواسطة مناطق خلايا المكورات العقدية البروبيوتيكية.