Name: الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod Parhyale hawaiensis (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-16T23:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: تعلم تقنية الاستئصال اليدوي لخلايا البلاستومير من أجنة Parhyale hawaiensis في مراحل الانقسام المبكرة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة الأحياء الجنينية للقشريات والتطور التطوري.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر الريحان وعارف حسان الشهاوى للعمل الكاميرا، Tripti غوبتا وFrederike Alwes للحصول على المساعدة صقل تقنية الاجتثاث الخلية، وأعضاء المختبر Extavour لردود الفعل على البيانات والفيديو والمخطوطة. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل معهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد (البذور غرانت عدد SG-0057-10-00) مؤسسة إليسون الطبية (جديد الباحث جائزة عدد AG-NS-07010-10) لفريق الخبراء الاستشاري، وجوائز برنامج بحوث كلية هارفارد ل ARN.

يشار إلى التعليقات التي قد تكون مفيدة في تنفيذ بعض الخطوات بخط مائل. 1. اليوم 1: إعداد مواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المواد التالية (انظر الجدول المواد والمعدات): <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 سم و 22 سم ماصات باستور </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماس الكاتب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) تحتوي على 1 ملغ / مل الامفوتريسين B (1:100 من محلول المخزون 100 ملغ / مل)، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (1:50 من محلول المخزون تحتوي على 5،000 وحدة / مل من البنسلين و 5،000 ملغ / مل من الستربتوميسين) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية مياه البحر الاصطناعي (الملوحة بين 0،0018-0،0020) دون إضافات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاوية بلاستيكية كبيرة للأزواج الإسكان (لا يقل عن 15 سم x 15 سم x 5 سم) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري صغيرة تصطف مع Sylgard </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (3 سم أو 5 سم) أطباق بتري الصغيرة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على زجاجة ساعة أو الزجاج لوحة متعددة جيدا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المستمدة ملقط (نستخدم ملقط حادة جيئة وذهابام القديم دومون # 5 ملقط التي تضررت بطريق الخطأ في الإجراءات المختبرية الأخرى، والتي قمنا أغراض أخرى باستخدام ملقط شحذ الحجر للتأكد من أن طرفي ملقط وسلاسة، أن كلا من أسنان هي طول نفس، وأنه لم يعد لديهم نقطة حادة. ملقط غرامة للغاية، مثل دومون # 5 جديدة ملقط، غير مرغوب فيها لأنها قد تجرح الأجنة و / أو الإناث.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة باستور مع نهاية اتسعت (انظر الخطوة 1.2 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداة استرجاع الجنين يتكون من رقيقة، سلك التنغستن منحني جزءا لا يتجزأ في نهاية رقيقة من ماصة باستور (يمكن الاستعاضة عن بديل تنفيذ، وانظر 1.3 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الفم مع فتحة صغيرة (انظر الخطوة 1.4 أدناه) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبرة الزجاج مصنوعة من الزجاج الشعرية سحبت (انظر الخطوة 1.5 أدناه) </li></ul> لا تستخدم مواد سامة للإنسان في هذا البروتوكول. ومع ذلك، يجب على الباحثين التأكد من أنها ارتداء القفازات أو الملابس الواقية الأخرى كما هو مطلوب من قبل جويدل إدارة المخاطرإيناس مؤسستهم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل باستور ماصة اتسعت، والنتيجة الأولى حول ماصة باستير 15 سم عند النقطة التي يبدأ ماصة لتضييق مع الكاتب الماس، والتفاف المنطقة وسجل من ماصة في Kimwipe أو منشفة ورقية لحماية الأصابع، ثم بعناية كسر قبالة الطرف في سطر النتيجة. عقد نهاية كسر من ماصة على لهب الموقد بنسن لعدة ثوان لضمان سلاسة حواف. وينبغي أن يكون افتتاح أضيق قليلا من أقصى عرض لها ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل التنغستن أداة تشريح الأسلاك، سلك التنغستن إدراج في نهاية 15 سم الزجاج ماصة باستور، وعقد لفترة وجيزة على لهب الموقد بنسن لإذابة الزجاج، وتحديد السلك في المكان. استخدام ملقط لمنحنى بلطف نهاية السلك في شكل مدمن مخدرات. انظر الشكل 3 للحصول على مثال لشكل مناسبة لهذه الأداة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل فتحة صغيرة للماصة الفم، وسحب نهاية رقيقة من 22 سم ماصة باستير إلى قسمين اوفإيه لهب، وقطع غيض من نهاية صغيرة. تضاف إلى نهاية حامل ماصة الفم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل إبرة الزجاج التي سيتم استخدامها لثقب عن Blastomeres من الفائدة أثناء إجراء الاجتثاث باستخدام مجتذب الإبرة. يظهر على شكل إبرة مناسبة في الشكل 4. تم سحب هذه الإبرة على ساحبة سوتر P97 إبرة باستخدام البرنامج مع المعلمات 2X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 20، والوقت = 250) + 1X (الحرارة = 566، وسحب = 100، السرعة = 100، الوقت = 250). برنامج محدد وأداة تستخدم لجعل إبرة يمكن أن تختلف، ولكن يجب أن يكون إبرة نقطة غرامة، ولكن أيضا يكون قوي بما فيه الكفاية على عدم كسر عندما دفعت ضد المشيماء الجنين. </li></ol> 2. يوم 1: الأزواج التجمع Parhyale التزاوج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة باستير اتسعت (الخطوة 1.2 أعلاه) لجمع التزاوج P. الأزواج hawaiensis من الحاوية ثقافة كبيرة، ونقلها إلى وعاء يحتوي ج منفصلةالعجاف مياه البحر الاصطناعي. فإنه ليس من الضروري أن مياه البحر هذه تتم تصفيته. فمن الأفضل لجمع أزواج التزاوج في فترة ما بعد الظهر في وقت لاحق وترك الأزواج في درجة حرارة الغرفة (20-23 درجة مئوية) بين عشية وضحاها، لذلك ان في صباح اليوم التالي، سيكون قد تم إخصابها معظم الأجنة وأودعت مؤخرا، وبالتالي في أوائل مراحل الانقسام مناسبة ل الاجتثاث. جمع ما لا يقل عن 20 أزواج التزاوج لضمان أن بعض الإناث سيتم تنفيذ المرحلة المبكرة الانقسام الأجنة من صباح اليوم التالي. </li></ol> 3. يوم 2: التجمع Parhyale الأجنة <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، ولبث تصفية مياه البحر الاصطناعي (FASW) مع CO 2. سيكون قد سبح بعض الإناث خالية من الذكور أثناء الليل؛ جمع هذه الإناث وفصل تخدير لهم في FASW / CO 2. ويمكن إزالة ما تبقى من الذكور المفردة من الحاوية الزوج التزاوج، وعاد إلى ثقافة كبيرة. يمكن حفظ أزواج التزاوج المتبقية لجمع الجنين في وقت لاحقفي اليوم أو في اليوم التالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الإناث الخدر واحدة تحمل أجنة إلى الزجاج ووتش في FASW / CO 2. ومن المرجح أن تودع جميع الإناث فصل البيض، والتي سوف تكون مرئية بالعين كما وردي شاحب أو الأرجواني الكروية من خلال لوحات وركي شفافة من الإناث (الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت الأجنة في مراحل الانقسام في وقت مبكر، وبالتالي مناسبة لقسيم أرومي الاجتثاث، فإن الباحث لديك لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة ويفحصها تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عرض إجراء تشريح تحت المجهر، فهم لوحات وركي على طول جانب واحد من الجسم مع ملقط. سوف الأجنة تكون مرئية في الحقيبة الحضنة بطني بين هذه اللوحات وركي (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج رقيقة، والأسلاك منحني أداة (الشكل 3، خطوة 1.3 أعلاه) في نهاية الخلفي من الحقيبة الحضنة، ورفع بلطف السلك في نهاية الأمامي من الحقيبة الحضنة لفصل الحضنةفرش الحقيبة (هذه الزوائد البطنية يتم تعديل دعا oostegites 30)، وفتح الحقيبة وتخفيف الأجنة. الأجنة التي هي في غضون الساعة الأولى أو نحو ذلك من التي تزرع يتم تضمين كل ذلك ضمن رقيقة جدا، وغشاء شفاف من شأنها أن تتعطل بسهولة بواسطة أداة الأسلاك؛ يختفي هذا الغشاء قبل ما يقرب من 2-3 ساعة بعد وضع البيض، والأجنة ليست ملزمة إلى بعضها البعض أو إلى الأنثى بأي شكل من الأشكال من هذه النقطة فصاعدا طوال مرحلة التطور الجنيني. إذا كان العثور الباحثون انه غير مريح أو صعبة للمناورة الأداة الأسلاك المنحنية لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة، بديلا تنفيذ يمكن استخدامها، طالما أن الحركات هي لطيف ويتم تطبيق أي ضغط قاس على الأجنة أو الحقيبة الحضنة. غيرها من الأدوات المناسبة لإزالة الأجنة من الحقيبة الحضنة تشمل ملقط اضعافها أو الزجاج الشعرية مع نهاية مختومة وممهدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لطرد المياه من خلال الحقيبة الحضنة فتح، ودفع خارج رانه الأجنة، والتي ينبغي أن تستقر في الجزء السفلي من الزجاج ووتش. نقل الإناث لتنظيف FASW (دون CO 2) للسماح الانتعاش قبل إعادة تقديم لها لثقافة الرئيسي. يمكن وضعها الإناث متعددة في طبق الانتعاش نفسه، ولكن تسمح الإناث حتى يتعافى تماما قبل إعادتهم إلى الثقافة الرئيسية، لأنها قد يؤكل من قبل الحيوانات الأخرى لا تزال في حالة تخدير جزئي فيها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة لنقل الأجنة إلى طبق بتري مع FASW نظيفة، وعرض تحت المجهر لتحديد مراحلها الجنينية. الأجنة المنفصلة التي هي في الانقسام الثالث (المرحلة 4 5)، والتي هي مناسبة لهذا الإجراء. كما ينبغي أن يكون من الممكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي مرحلة الانقسام قبل تشكيل القرص الجرثومية (مراحل 07-08 مايو). </li></ul> 4. يوم 2: الذوبان خلايا واحدة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء Sylgard مبطنة طبق بيتري مع طبقة ضحلة من FASW. استخدام دون تغيير 15 سم باستور بيpette لنقل الجنين واحدة على لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط حادة، ولفة بلطف الجنين لتحديد الخلية أن يكون ذاب (أرقام 2A و 2B). مقدمة ز خط الجرثومية يمكن حصرها في أصغر قسيم مكروي، الذي يجلس على رأس أصغر قسيم كبروي MÁV. بالإضافة إلى ذلك، لا ز الاتصال مباشرة الخلية أون، والذي هو قسيم مكروي مباشرة عبر من ذلك، كما مل micromeres الأديم المتوسط ​​السلائف وحصة السيد حدود الخلية في المنتصف من الجنين. السيد هو قسيم أرومي على يمين غرام، و مل هو قسيم مكروي على يسار ز. وmacromeres شقيقة السيد، مل، وحمام هي السلائف الأديم الظاهر ايه، ش، والجيش الشعبي على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط في LEFر اليد إذا كان الباحث هو اليد اليمنى (أو في اليد اليمنى إذا أعسر الباحث)، توجيه الجنين مع الخلية التي تهم الحق (أو إلى اليسار إذا أعسر الباحث)، و فهم بلطف الجنين بين ملقط لتثبيته. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إبرة سحب الزجاج (الخطوة 1.5 أعلاه؛ الشكل 4)، ثقب بلطف الخلية من الفائدة. لا يدخل الإبرة بعيدا جدا، حتى لا تدفع الإبرة في الخلايا المجاورة أو أسفل الخلية من الفائدة. الإبرة لديه فقط لثقب المشيماء وغشاء الخلية الأساسية، وليس بحاجة لتمديد عميقا في الخلية أن يكون ذاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبادل إبرة تستخدم لثقب الجنين في نهاية كوب من ماصة الفم مع غرامة سحبت ماصة باستير طرف (الخطوة 1.4 أعلاه). عقد غيض من ماصة على مقربة من الحفرة التي تم إنشاؤها في الخلية من الفائدة، وتطبيق الشفط لطيف جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جدا الضغط بلطف الجنين مع ملقط. كما محتوى الأرومةودفعت مجرد الخروج من المشيمه من خلال ثقب بإنشائه في الخطوة 4.4، أمتص له في ماصة الفم للسماح مشهدا من الجنين. إذا كانت حفرة كبيرة بما فيه الكفاية، ونواة الخلية ثقب يمكن أن ينظر إليها في الظهور أيضا. هذا هو الاختيار الجيد للتأكد من تم إزالة محتويات الخلية بأكملها ولا يمكن تجديدها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة بعناية الجنين كما يتم إزالة قسيم أرومي من الفائدة. والحدود من الخلية بثقب تنحسر نحو ثقب في المشيمه، مما يجعل من التقاطعات من الخلايا الكامنة مرئية. مواصلة الضغط حتى يتم إزالة كافة قسيم أرومي من الفائدة. استخدام ملقط للفة الجنين من جانب إلى آخر وتأكيد بصريا أن كل قسيم أرومي من الفائدة هو ذهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام دون تغيير 15 سم باستور ماصة، ونقل الجنين لتنظيف FASW + (FASW + 1 ملغ / مل الامفوتريسين B، و 100 وحدة / مل البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الأجنة ذاب قسيم أرومي في الآبار الفرديةنظيفة لوحة 48 جيدا في FASW +، وتغيير 50٪ من المضادات الحيوية تستكمل FASW + اليومية. في أيدينا الأجنة البقاء والتطور بشكل جيد، حتى بعد الاجتثاث، في مجموعة من درجات الحرارة 18-28 درجة مئوية. يجب على الباحثين جمع الأجنة بهم عند درجة حرارة التي لديهم سطح نظيف (ولكن ليس بالضرورة العقيمة) الذي رفع الأجنة مع الحد الأدنى من الإزعاج. لتكون قادرة على المقارنة بين توقيت الأحداث التنموية في الأجنة ذاب قسيم أرومي مع الضوابط، ونحن إحالة القارئ إلى المعلومات التدريج التنموية التفصيلية التي يتوفر الأجنة التي أثيرت في 18 º C 4، 25 º C 4، و 26 º C 5،6. </li></ol>

<ol><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Model+Organisms%3A+A+Laboratory+Manual+Volume%22%5BJournal%5D)">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , CSHL Press. 373-404 Forthcoming.</li>
<li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+insect+embryogenesis%3A+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Insect+Morphol.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li>
<li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li>
<li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li>
<li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Genesis. 42, 124-149 (2005).</li>
<li>Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+analysis+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis+reveals+an+early+restriction+of+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates.</a> Development. 129, 5789-5801 (2002).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+and+dissection+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Price, A. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+divergent+mechanisms+of+mesoderm+development+in+arthropods%3A+the+expression+of+Ph-twist+and+Ph-mef2+in+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+B.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis.</a> J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+hybridization+of+labeled+RNA+probes+to+fixed+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+otd+orthologs+in+the+amphipod+crustacean%2C+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).</li>
<li>Prpic, N. M., Telford, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%3A+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li>
<li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).</li>
<li>Liubicich, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+Parhyale+Ultrabithorax+recapitulates+evolutionary+changes+in+crustacean+appendage+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+evolution+of+appendage+specialization+by+Hox+gene+misexpression+in+an+emerging+model+crustacean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).</li>
<li>Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li>
<li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology%5BTitle%5D)+AND+%22Evol.+Dev%22%5BJournal%5D)">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li>
<li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li>
<li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genom%22%5BJournal%5D)">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li>
<li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ASGARD%3A+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22Database%22%5BJournal%5D)">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li>
<li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+cell+lineage%2C+movement%2C+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li>
<li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machinery+of+germ+line+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li>
<li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li>
<li>Fraser, S. E., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+metamorphosis+of+experimental+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular metamorphosis of experimental embryology.</a> Cell. 100, 41-55 (2000).</li>
<li>Olsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clash+of+traditions%3A+the+history+of+comparative+and+experimental+embryology+in+Sweden+as+exemplified+by+the+research+of+G%C3%B6sta+J%C3%A4gersten+and+Sven+H%C3%B6rstadius%5BTitle%5D)+AND+%22Theory+Biosci%22%5BJournal%5D)">A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius.</a> Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).</li>
<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protoc%22%5BJournal%5D)">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li>
<li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li>
<li>Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitz%2C+EH+%22Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates%22">Microscopic Anatomy of Invertebrates</a>. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن تصف بروتوكول للالاجتثاث دليل والإزالة المادية كاملة من واحد عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت مبكر من amphipod P. hawaiensis. ونحن لشرح استخدام هذا البروتوكول عن طريق إزالة واحدة خط الجرثومية الخلية السلائف ز من ثماني خلايا مرحلة الجنين، وتبين أن الاجتثاث قد حققت نجاحا من خلال التأكد من عدم وجود خلايا ابنة ز &#39;ق في مرحلة التطور الجنيني في وقت لاحق. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لإزالة أي من micromeres من الجنين في مراحل الانق...

برزت Parhyale hawaiensis amphipod القشريات على مدى العقد الماضي كنموذج كائن واعدة مع إمكانات كبيرة لاستخدامها في البحوث التطورية البيولوجيا التطورية 1. بين المفصليات، معظم أنظمة النموذج هي الحشرات، ودرس على نطاق واسع معظم هذه هي ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن. D. البطن هو عضو من ذوات الجناحين أجل الحشرات، وعلى هذا النحو يعرض العديد من الميزات الجنينية التي يتم اشتقاق فيما يتعلق بتلك المتفرعة من باسالي الحشرات 2. علاوة على ذلك، يتم تداخل الحشرات داخل شعيبة Pancrustacea 3، وهذا يعني أن الحشرات لها أقرب أقربائهم داخل الجماعة منذ فترة طويلة &quot;طبيعية&quot; ودعا pancrustaceans، وأن هذه المجموعة هي paraphyletic. وهذا يشير إلى أنه بالإضافة إلى المتفرعة باسالي نماذج الحشرات، وهناك حاجة لدراسات أخرى لمن القشريات اكتساب نظرة اوسع من التاريخ التطوري للالصفات التنموية والآليات الجزيئية الثانية التي تم دراستها بشكل جيد في D. البطن. ومع ذلك، عدد قليل جدا من القشريات تم راسخة لتحليل المختبر التجريبي للتنمية. وamphipod P. hawaiensis هو نظام نموذجي مختبر لين العريكة للغاية، قابلة لمجموعة من التقنيات التجريبية. عرض مزدوجات الأرجل العديد من المزايا الفريدة داخل فوق رتبة الأم Peracarida (النطاط الشاطئ، وصواريخ سكود، والجمبري جيدا)، ولذلك يعتقد أن تستمد نسبيا ضمن هذه المجموعة من القشريات. ومع ذلك، فإن السهولة النسبية في التلاعب الجيني الجنينية والوظيفية التي توفرها Parhyale جعل هذا amphipod إضافة قيمة إلى المخزون الحالي للكائنات النموذج. كحيوان المختبر، P. hawaiensis توفر العديد من المزايا. الحيوانات متسامحون إلى مجموعة واسعة من درجات الحرارة والملوحة، والبقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافات كبيرة من مياه البحر الاصطناعي 1. فمن السهل أن نميز betwالذكور والإناث التابعين على أساس الاختلافات الشكلية واضحة، وعلى الأخص، وكبيرة، مدمن مخدرات، والزوائد الجذع الأمامي أن الذكور استخدامها لفهم الإناث أثناء التزاوج. للعمل الجنينية والتنموية، P. hawaiensis لديها العديد من الميزات جذابة جدا. مرحلة التطور الجنيني تستغرق حوالي 10 يوما والوقت لمرحلة النضج الجنسي ما يقرب من ستة أسابيع عند 28 º C (لكن لاحظ أن Parhyale ينجو جيدا في درجات حرارة تتراوح من حوالي 20-30 º C، وأن معلومات مفصلة التدريج التنموية متاح للأجنة التي أثيرت في 18 º C 4 ، 25 º C 4، و 26 º C 5،6). البالغين تتزاوج على مدار السنة في المختبر، لذلك هي الأجنة متوفرة في أي وقت من السنة. وضع الإناث 2-20 (اعتمادا على عمر الأنثى) البويضات المخصبة في الحقيبة الحضنة بطني الواقعة بين أول عدة أزواج من الأرجل (أرقام 1A و 1B)، وأنه من الممكن لجمع هذه الأجنةق في التنمية في وقت مبكر جدا من دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة (الشكل 1C). الأجنة البقاء على قيد الحياة في تصفية مياه البحر الاصطناعي حتى الفقس، يمكن ان تكون ثابتة للالتعبير الجيني لاحقة أو التحليل النسيجي 7، ويسمح جدول التدريج مفصلة التحديد الدقيق للتقدم من خلال التنمية 5. وقد استخدمت بروتوكولات قوية لإجراء تحليل التعبير الجيني عن طريق الموقع التهجين أو المناعية 8-15 4،16،17 في، ضربة قاضية الوظيفية التي تدخل الحمض النووي الريبي 13،15 أو 12 morpholinos، ومستقرة خط نقل الجينات الجرثومية 18. باستخدام نظام نقل الجينات والتعبير ومحرض 14 فخ محسن ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب 19 للتحقيق وظيفة الجين في P. hawaiensis. في حين أن تسلسل الجينوم للجمهور غير متوفر حاليا، والتي تحتوي على Transcriptome على النصوص التي تنتج أثناء التطور الجنيني وoogenesis والنحلن دي نوفو تجميعها والمشروح 20، وأودعت في قاعدة بيانات يمكن البحث 21، وتسهيل اكتشاف الجينات. باختصار، P. hawaiensis هو كائن نموذج لين العريكة للغاية ومناسبة لمناهج تجريبية وراثية متعددة لفهم التنمية. على عكس الانقسامات المخلوي في وقت مبكر من D. البطن، P. الأجنة hawaiensis يلتصق holoblastically بعد الإخصاب (الشكل 2A). وقد أظهرت نسب تحليل تتبع ذلك عن طريق الانقسام الثالث، والحظ كل من انشقاق عن Blastomeres الثالث على وجه التحديد أن تؤدي إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو خط الجرثومية 6 (الشكل 2B). هذه البيانات، جنبا إلى جنب مع بيانات ميكروأري 22، نسب خلية يحلل 6،23، ولقد اقترح التجارب قسيم أرومي العزلة 4 أن الإمكانيات التنموية هي منفصلة على الأقل بعض انشقاق عن Blastomeres الثالث بالميراث غير المتماثلة من سلل المحددات مصير. وفقا لذلك، في التجارب قسيم أرومي الاجتثاث التي تمت إزالة السلائف خط الجرثومية (وهو ما يسمى &quot;ز&quot; في Parhyale النسب الخلية التسميات 6) في مرحلة الخلية الثمانية، تفتقر الأجنة الخلايا الجرثومية في المراحل التنموية في وقت لاحق 4، كما يدل على ذلك عدم وجود خلايا معربا عن البروتين فاسا، الذي هو علامة خط الجرثومية في معظم metazoans 24. في المقابل، أظهرت التجارب الجسدية الاجتثاث قسيم أرومي أن P. الأجنة hawaiensis أيضا تمتلك قدرات تنظيمية كبيرة، مثل أن مصير الأديم المتوسط ​​أو الأديم الظاهر عن Blastomeres السلائف ذاب في مرحلة الثمانية خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية 25. كيف يمكن أن يحدث التنظيمية استبدال مصير الخلية، ومدى الحكم الذاتي اعتماد مصير خلية جسدية من قبل عن Blastomeres، ما زال مجهولا. تقنيات الجنينية التجريبية مثل قسيم أرومي الاجتثاث يمكن أن تكون مفيدة في فهمهاقرع الاستقلالية النسبية وnonautonomy القرارات مصير الخلية 26،27، وبالتالي فهي ذات أهمية في دراسة P. hawaiensis مرحلة التطور الجنيني. في التجارب التي أثبتت استبدال التنظيمية من الأدمة وأرومية متوسطة الأنساب، تم تنفيذ الاجتثاث قسيم أرومي عن طريق الحقن 28 و الإثارة اللاحقة من الأصباغ الضوئية 25. في حين أن هذا الأسلوب هو فعالة في قتل قسيم أرومي حقن (ق)، فإنه لا إزالة خلايا الجسم الميتة من الجنين. بالإضافة إلى ذلك، لوحظت اختلافات بين البيانات التي تجمع من خلال النسب الخلية إلى مراحل تكون المعيدة من التطور الجنيني عن طريق حقن عن Blastomeres مع استشفاف النسب الفلورسنت 28،29، والبيانات التي جمعتها التالية عن Blastomeres رابط الجأش من خلال تطوير نفس المراحل الجنينية 23. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. نشرنا سابقا نتائج النسب خلية تحليل الأجنة في الخلايا التي تم واحد ذاب 23 يدويا. ومع ذلك، فإن عمليات حساسة المطلوبة لإزالة واحدة من أوائل عن Blastomeres الانقسام الأجنة المرحلة لم يتم وصفها بشكل كامل. هنا نقدم بروتوكول لجمع P. الأجنة hawaiensis والاجتثاث دليل لقسيم أرومي واحد من ثمانية خلايا الجنين المرحلة. الهدف من هذا الأسلوب هو تحقيق الإزالة الكاملة للجسم خلية من الجنين، مما يتيح مراقبة السلوكيات الخلوية والكفاءات مصير خلية من الخلايا المتبقية خلال مرحلة التطور الجنيني والتنمية في مرحلة ما بعد الجنينية. يظهر لدينا بروتوكول إزالة السلائف ز خط الجرثومية (الشكل 2C)، ولكن يمكن تطبيقها على أي خلية في المرحلة ثماني خلايا، أو عن Blastomeres من مراحل الانقسام في وقت سابق. من حيث المبدأ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لإزالة الخلايا واحد من أوائل الأجنة مرحلة الانقسام من آلات موسيقية أخرىص الشق holoblastically اللافقاريات البحرية.

<table><tbody><tr><td>ماصة باستور 15 سم</td><td>ويتون</td><td>53499-630 VWR</td><td>لنقل الأجنة السليمة والمفصولة بالبلاستومير من طبق إلى آخر.</td></tr><tr><td>ماصة باستور 22 سم</td><td>ويتون</td><td>53499-632 VWR</td><td>لصنع أطراف ماصة الفم.</td></tr><tr><td>أطباق بتري 3 سم</td><td>Thermo Scientific</td><td>25382-334 VWR</td><td>استخدم بعضها دون تغيير لجمع الأجنة وتخزينها ؛ قم بتغطية بعضها بطبقة من Sylgard (انظر أدناه) لإنشاء سطح عمل لاستئصال الأريمة.</td></tr><tr><td>48 بئر ألواح</td><td>Greiner Bio-One</td><td>82051-004 VWR</td><td>لزراعة الأجنة بعد الاستئصال.</td></tr><tr><td>مرشحات أعلى الزجاجة 0.2 & ميكرو; m</td><td>Nalge Nunc International</td><td>28199-296 VWR</td><td>لإنشاء FASW (انظر أدناه).</td></tr><tr><td>موقد بنسن</td><td>VWR</td><td>89038-530 VWR</td><td>لإنشاء أداة سلك التنغستن وطرف ماصة الفم الدقيقة.</td></tr><tr><td>الكاتب الماسي</td><td>موسكو للإضاءة الرياضية</td><td>52865-005 VWR</td><td>لإنشاء ماصات باستور واسعة الفم لجمع الأزواج.</td></tr><tr><td>أدوات العلوم الدقيقة</td> <td>الملقط</td><td>11050-10 أدوات العلوم الدقيقة</td><td>لحمل الإناث المخدرات أثناء إزالة الأجنة من كيس الحضنة. لا يجب أن تكون هذه ملقط دومون ناعم الرؤوس - يمكن أن تكون الأطراف على الأقل حادة مثل تلك الموجودة في الملقط الذي تم إدراج رقم الكتالوج له هنا.</td></tr><tr><td>Fungizone-Amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942 Sigma Aldrich</td><td>أضف إلى FASW إلى التركيز النهائي البالغ 1 مجم / مل ، واستخدم هذا المحلول لزراعة الأجنة المستعصصة بالبلاستومير.</td></tr><tr><td>الشعيرات الدموية الزجاجية 4 بوصات طويلة ، 1 / 0.58 OD / ID (مم) أدوات</td> <td>الدقة العالمية</td><td>1B100-4 أدوات الدقة العالمية</td><td>لصنع إبر لثقب الأريمة المراد استئصالها.</td></tr><tr><td>زجاج ساعة بقطر 300 مم</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>70543-30 علوم المجهر الإلكتروني</td><td>للاستخدام في إزالة الأجنة من كيس الحضنة للإناث المخدرات.</td></tr><tr><td>مياه البحر الاصطناعية الفورية للمحيط (ASW)</td><td>المحيط الفوري</td><td>IS160 النظم البيئية المائية</td><td>تصنع ASW عن طريق إذابة الملح في المياه منزوعة الأيونات إلى ملوحة 1.022-1.024.</td></tr><tr><td>مياه البحر الاصطناعية المصفاة الفورية للمحيط (FASW)</td> تستخدم الأنظمة البيئية <td>المائية الفورية للمحيط</td><td>IS160</td><td>0.2 ومايكرو ؛ م مرشحات لتعقيم ASW. المكياج بكميات صغيرة (< 250 مل) حسب الحاجة.</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>21905-026 VWR</td><td>لكسر الطرف الدقيق لماصات باستور المعدلة لجمع الأزواج.</td></tr><tr><td>محول ماصة الفم</td><td>Drummond Labware</td><td>A5177-5EA Sigma Aldrich</td><td>أدخل طرف ماصة باستور المسحوبة بدقة في هذه النهاية ، لاستخدامها لإزالة محتويات الخلايا المبثوقة أثناء إجراء الاستئصال.</td></tr><tr><td>أنبوب ماصة الفم</td><td>Aldrich</td><td>Z280356 Sigma Aldrich قص</td><td>هذا ليكون طويلا بما يكفي لتعليقه بشكل مريح حول رقبتك أثناء إجراء الاستئصال.</td></tr><tr><td>شركة مجتذب الإبرة</td><td>Sutter Instrument</td><td>Company P97 Sutter Instrument</td><td>Company لصنع الإبر من الشعيرات الدموية الزجاجية لثقب الأريمية المراد استئصالها.</td></tr><tr><td>محلول البنسلين والستربتومايسين</td><td>Mediatech</td><td>45000-650 VWR</td><td>أضف إلى FASW إلى التركيز النهائي البالغ 100 وحدة / مل البنسلين و 100 مجم / مل من الستربتومايسين ، واستخدم هذا المحلول لزراعة الأجنة المستعصصة بالبلاستومير.</td></tr><tr><td>لمبة مطاطية</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>100488-418 VWR</td><td>لاستخدام ماصات باستور لنقل الأجنة من طبق إلى طبق.</td></tr><tr><td>سيلجارد 184</td><td>كيه آر أندرسون ، إنك.</td><td>NC9659604 فيشر المكياج العلمي</td><td>وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. صب طبقة بسمك 2-5 مم في طبق بتري 3 سم لإنشاء سطح عمل لاستئصال الأريمة.</td></tr><tr><td>سلك التنغستن 0.004 بوصة قطرها</td><td></td> أنظمة <td>AM 719000 أنظمة AM</td><td>استخدم هذا لعمل أداة لإزالة الأجنة من كيس الحضنة للإناث المخدرات.</td></tr></tbody></table>

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات amphipod<em&gt; parhyale hawaiensis</em

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

وhawaiensis amphipod Parhyale هو القشريات الصغيرة وجدت في الموائل البحرية المد والجزر في جميع أنحاء العالم. على مدى العقد الماضي، برز Parhyale كما كائن نموذج واعد للدراسات المختبرية للتنمية، وتوفير المقارنة outgroup مفيدة للمدروسة نموذج المفصلية الحي ذبابة الفاكهة السوداء البطن. وعلى النقيض من الانشقاقات المخلوي من ذبابة الفاكهة، والانشقاقات في وقت مبكر من Parhyale هي شمولي التنسج. تعيين مصير باستخدام الأصباغ التتبع حقنها في وقت مبكر عن Blastomeres أظهرت أن وضعت كل الطبقات الجرثومية الثلاث وخط الجرثومية التي كتبها المرحلة ثمانية الخلايا. في هذه المرحلة، والحظ ثلاثة عن Blastomeres أن تؤدي إلى الأديم الظاهر، ومقدر لثلاثة تؤدي إلى الأديم المتوسط، وعن Blastomeres المتبقيين هي السلائف من الأديم الباطن والجرثومية خط على التوالي. ومع ذلك، فقد أظهرت التجارب الاجتثاث قسيم أرومي أن الأجنة Parhyale أيضا تمتلك قابليات تنظيمية كبيرةوفاق، مثل أن مصائر عن Blastomeres ذاب في مرحلة ثماني خلايا يمكن الاستيلاء عليها من قبل أحفاد بعض عن Blastomeres المتبقية. وقد سبق وصفها قسيم أرومي الاجتثاث من جانب واحد من طريقتين: حقن وتفعيل لاحقة من الأصباغ الضوئية أو الاجتثاث اليدوي. ومع ذلك، جذ بالضوء يقتل عن Blastomeres ولكنه لا يزيل خلايا الجسم الميتة من الجنين. ولذلك قد الإزالة المادية كاملة من عن Blastomeres محددة يكون الأسلوب المفضل الاجتثاث عن بعض التطبيقات. هنا نقدم بروتوكول للالإزالة اليدوية للعن Blastomeres واحدة من مرحلة الثمانية خلايا الأجنة Parhyale، مما يدل على الأدوات والإجراءات اليدوية اللازمة لإزالة كاملة من خلايا الجسم مع الحفاظ على ما تبقى على قيد الحياة عن Blastomeres وسليمة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى أي خلية Parhyale في مرحلة الثمانية خلايا، أو عن Blastomeres الأخرى مراحل الانقسام في وقت مبكر. بالإضافة إلى ذلك، من حيث المبدأ هذا البروتوكول يمكن أن تطبق على الحريه في وقت مبكرvage الأجنة مرحلة أخرى اللافقاريات البحرية الشق holoblastically.

التالية الاجتثاث ناجحة من الانقسام ثالث واحد P. micromeres hawaiensis كما هو موضح في هذا البروتوكول، وmicromeres المتبقية التحول تدريجيا مواقعها قليلا وذلك لتحتل جزئيا المساحة المحتلة سابقا من قبل قسيم أرومي ذاب. على سبيل المثال، عندما تتم إزالة غرام، المجاورة عن Blastomeres السيد ومل التحول قليلا ويأتي للمشاركة في حدود الخلية الجانبية التي كانت سابقا في اتصال مباشر مع ز (قارن الشكل 2A و ...

وhawaiensis amphipod Parhyale هو كائن نموذج واعد للدراسات علم الأجنة القشريات والتنمية المفصلية المقارن والتطور. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإزالة دليل عن Blastomeres احد من بداية مرحلة الانقسام الأجنة من Parhyale.

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

يوضح هذا العرض التقنية المستخدمة لإزالة الخلية السلفية للخط الجرثومي من الأجنة المبكرة في الـ pod. يعد القشري Parhyale hawaiensis كائناً نموذجياً ناشئاً يتمتع بإمكانات واسعة للاستخدام في أبحاث التطور والنمو. معظم مفصليات الأرجل النموذجية هي من الحشرات، وأكثرها دراسة هي ذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster. تندرج الحشرات ضمن تحت شعبة Pancrustacea، وتوفر دراسة القشريات الأخرى خارج نطاق الحشرات رؤية أوسع للتاريخ التطوري للسمات النمائية والآليات الجزيئية التي تمت دراستها باستفاضة في Drosophila.ومع ذلك، فإن القليل جداً من القشريات قد تم اعتمادها بشكل جيد للتحليل المختبري التجريبي للنمو. ويعد Parelli نظاماً نموذجياً مختبرياً سهل التعامل معه للغاية، وبالتالي يمثل إضافة قيمة إلى قائمة الكائنات النموذجية. وباعتباره حيواناً مختبرياً، فإن parli سهل جداً في التربية والعمل معه.يمكن لهذا الكائن البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في مستنبتات كبيرة من مياه البحر الاصطناعية، ومن السهل التمييز بين الذكور والإناث بناءً على اختلافات مورفولوجية واضحة. وأبرز هذه الاختلافات هي الزوائد الأمامية الكبيرة والمعقوفة التي يستخدمها الذكور للإمساك بالإناث أثناء التزاوج من أجل الدراسات النمائية. يتميز نوع Parelli بعدة سمات جذابة للغاية، حيث تتزاوج الأزواج على مدار العام، مما يجعل من الممكن جمع الأجنة في أي وقت.تضع الإناث الأجنة في جريب الحضانة الموجود بين الأزواج الأولى من الأرجل، ومن الممكن جمع الأجنة في مراحل مبكرة جداً من النمو دون قتل الأنثى أو إتلاف الأجنة. تبقى الأجنة على قيد الحياة في مياه بحر اصطناعية مُفلترة حتى مرحلة الفقس، ويوجد جدول تفصيلي للمراحل يسمح بتحديد دقيق لمدى التقدم في النمو. يظهر هنا مجموعة مختارة من مراحل نمو paral وصولاً إلى الفقس، بدءاً من مرحلة الخلايا الثماني من النمو.تتمايز كل خلية في جنين الـ paral بشكل محدد إلى واحدة من الطبقات الجرثومية الثلاث أو إلى الخلايا الجرثومية البدائية. ويعد تحديد مجموعة الخلايا الجرثومية هو محل الاهتمام الخاص في هذا العرض التوضيحي. ومن المعروف أن الخلية المسمى G، والتي ترمز للخط الجرثومي (germline)، هي السلف الفريد للخط الجرثومي في تجارب تتبع السلالة في الـ parli؛ حيث تُظهر هذه التجارب أن سلالات الخلية G تصبح جميعها خلايا جرثومية، ولا تنتمي أي من سلالاتها إلى أي من الطبقات الجرثومية الأخرى.بالإضافة إلى ذلك، أُجريت تجارب تم فيها إزالة G من الجنين دون إلحاق الضرر ببقية الخلايا. وفي هذه التجارب، افتقرت الأجنة التي أُزيل منها G إلى الخلايا الجرثومية طوال بقية فترة التكوين الجنيني، وهو ما استُدل عليه من خلال غياب الخلايا التي تعبر عن البروتين vasa، والذي يعد علامة للخط الجرثومي في الكائنات النموذجية عبر متعددات الخلايا. سنقوم الآن بتوضيح كيفية جمع أجنة parli واستئصال G يدويًا من جنين في مرحلة الخلايا الثماني.يوضح هذا الفيديو كيفية إزالة G، ولكن يمكن تطبيق ذلك على أي خلية في مرحلة الخلايا الثماني. لهذا الجزء من الإجراء، سنحتاج إلى ماصة باستور ذات نهاية موسعة، وماصة باستور ثانية غير معدلة، ومياه بحر اصطناعية مفلترة، ووعاء كبير لإيواء الأزواج، وأطباق بتري صغيرة، وصفيحة آبار زجاجية، وملاقط، وأداة تشريح تتكون من سلك منحني رفيع في نهاية ماصة باستور. لم يتم استخدام القفازات في هذا العرض التوضيحي، ولكن تذكر إضافة معدات الوقاية وفقاً لإدارة المخاطر في مؤسستك. لصنع ماصة باستور الموسعة، قم أولاً بعمل خدش حول الماصة باستخدام قلم ماسي ثم اكسر الطرف بعناية.ثبت الأنبوب فوق لهب لعدة ثوانٍ لتنعيم الحواف. يجب أن تكون الفتحة أضيق قليلاً من العرض الأقصى للماصة. لصنع أداة التشريح السلكية، أدخل سلك تنجستن في طرف ماصة زجاجية وثبتها فوق لهب لصهر الزجاج.لتثبيت السلك في مكانه، استخدم الملقط لثني نهاية السلك برفق لسهولة التعامل معه باستخدام الأداة. يجب أن يكون طول الطرف المعقوف أكثر بقليل من نصف سنتيمتر. اجمع الأزواج باستخدام ماصة باستور واسعة الفتحة وانقلهم إلى وعاء منفصل يحتوي على مياه بحر اصطناعية.اترك الأزواج في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. وفي صباح اليوم التالي، قم بتشبيع مياه البحر الاصطناعية المفلترة بغاز ثاني أكسيد الكربون. اجمع الإناث المنفصلة وقم بتخديرها في هذه المياه.انقل أنثى واحدة إلى طبق آبار زجاجي يحتوي على مياه بحر اصطناعية مفلترة مع ثاني أكسيد الكربون، وبمساعدة مجهر تشريحي، أمسك الصفائح الوركية على جانب واحد من الجسم باستخدام ملقط. تكون الأجنة مرئية داخل جيب الحضانة. أدخل أداة التشريح السلكية في الطرف الخلفي من جيب الحضانة وارفع السلك برفق باتجاه الطرف الأمامي لفصل غطاء جيب الحضانة، مما يؤدي إلى فتح الجيب وكشف الأجنة.استخدم ماصة باستير لدفع الماء عبر جريب الحضنة المفتوح، وذلك لإخراج الأجنة. ثم انقل الأنثى إلى مياه بحر اصطناعية مفلترة خالية من ثاني أكسيد الكربون للسماح لها بالتعافي قبل إعادتها إلى المزرعة الرئيسية.انقل الأجنة إلى طبق بتري يحتوي على مياه بحر اصطناعية مُفلترة وافحصها تحت المجهر لتحديد مرحلتها العمرية. ونظراً لصعوبة تحديد مرحلة الأجنة غالباً قبل إخراجها من الأنثى، فإننا نحتاج عادةً إلى جمع الأجنة من عدة إناث لضمان الحصول على عدد كافٍ من الأجنة في المرحلة الصحيحة. وغالباً ما تكون أسهل طريقة للحصول على أجنة في مرحلة الخلايا الثماني هي جمع أجنة في مراحل مبكرة والانتظار حتى تنضج وتصل إلى المرحلة المطلوبة.بالإضافة إلى الأجنة التي جمعناها بالفعل لإجراء عملية الاستئصال، سنحتاج إلى ملقط ماصة رعوية، ومياه بحر اصطناعية مفلترة، وطبق بتري يحتوي على طبقة من الأجار، وإبرة مصنوعة من شعيرة زجاجية مسحوبة، وماصة فموية بفتحة صغيرة، وأطباق بتري نظيفة، ومياه بحر اصطناعية مفلترة تحتوي على amphotericin وpenicillin streptomycin لتنظيف طرف الماصة الفموية. اسحب طرف ماصة رعوية طويلة فوق لهب ثم اكسر طرف النهاية الصغيرة وأدخلها في نهاية الماصة الفموية. يعد هذا الطرف بالحجم المثالي لهذا الإجراء.يجب أن تكون الإبرة الزجاجية، التي ستُستخدم لثقب G أثناء عملية الاستئصال، ذات سن دقيق، ولكنها متينة بما يكفي لضمان عدم انكسارها عند دفعها مقابل الغشاء المكيّسي (corion). يظهر هنا أحد الأشكال الشائعة المستخدمة في مختبرنا. بالنسبة لعملية الاستئصال، يجب علينا أولاً تحديد أي خلية تمثل G؛ حيث يظهر الجنين الموجود على اليسار وهو يحدد G بخط أسود، وسنتعلم في القسم التالي كيفية تمييز G عن المرايا الدقيقة الأخرى.يظهر الجنين الموجود على اليمين النتيجة المتوقعة للاستئصال الناجح. في هذا الجنين، تم استئصال G كما هو موضح بالدائرة السوداء، ولم يتبق سوى ثلاث micro meres باستخدام الملقط. قم بتدوير الجنين برفق لمعاينة الخلايا ومقارنتها.يمكن تحديد G على أنها أصغر ميكرومير (micromere) تقع فوق أصغر ماكرومير (macromere). ويمكن تحديد MAV على أنها أصغر ماكرومير عن طريق تدوير الجنين. بالإضافة إلى ذلك، فإن G لا تلمس الخلية EN، وهي الميكرومير المقابلة لها. وبما أن الخلايا el و er في هذا الجنين تتشاركان حدوداً بين G و EN، يمكننا أن نرى أن أصغر ميكرومير تقع على اليسار، ونلاحظ أنها لا تلمس الميكرومير المقابلة لها.من خلال تدوير الجنين، يمكننا التأكد من أن هذه المرآة المجهرية (micro mirror) تستقر فوق أصغر مرآة عيانية (macro mirror). والآن، وبما أنها تقع في الجزء السفلي الأيسر من الجنين، يمكننا تسميتها بثقة G والانتقال إلى عملية الاستئصال. باختصار.في هذا الإجراء، سنقوم بتثبيت الجنين باستخدام الملقط بينما نقوم بثقب G باستخدام إبرة زجاجية مسحوبة. بعد ذلك، سنطبق ضغطاً خفيفاً على الجنين بواسطة الملقط، مما يؤدي إلى خروج محتويات G من الجنين عبر الثقب الذي أحدثناه. نستخدم ماصة الفم لإزالة محتويات G بعد خروجها من الجنين حتى نتمكن من معرفة متى تم إزالة G بالكامل.للانتقال الآن إلى التفاصيل، املأ لوحة حماية الحرير بطبقة ضحلة من مياه البحر الاصطناعية المفلترة. انقل جنيناً في مرحلة الثماني خلايا إلى اللوحة باستخدام ماصة باستور مع ملاقط. باليد اليسرى، وجه الجنين بحيث يكون G إلى اليمين وأمسك الجنين برفق لتثبيته باستخدام إبرة زجاجية مسحوبة، ثم اثقب G برفق؛ لا تدفع الإبرة بعمق شديد لمنع دفعها إلى داخل المرايا الكبيرة الموجودة أسفل G، واستبدل الإبرة في يدك اليمنى بماصة فموية مزودة بطرف ماصة باستور مسحوب.أمسك بطرف الماصة بالقرب من الثقب الموجود في G وقم بتطبيق سحب خفيف جداً. اضغط برفق على الجنين باستخدام الملقط بينما تندفع محتويات G خارج الغشاء الكوريوني. ثم اسحبه إلى داخل الماصة الفموية للسماح برؤية واضحة للجنين دون أي عوائق.راقب الجنين بعناية. عند إزالة G، ستتراجع حدود G نحو الفتحة الموجودة في الغشاء الكوريوني (corion)، مما يجعل تقاطع الخلايا الموجودة تحتها مرئياً. استمر في الضغط حتى تتم إزالة G بالكامل، واستخدم الملقط لتدوير الجنين والتأكد بصرياً من إزالة G بالكامل.باستخدام ماصة باستور، انقل الجنين إلى مياه بحر اصطناعية مفلترة مضاف إليها الأمفوتيريسين والبنسلين والستربتومايسين. قم بتغيير نصف كمية المياه الموجودة حول الجنين يومياً لمنع حدوث عدوى. يظهر هنا جنين قبل الاستئصال وبعده.كما تلاحظون، هناك مساحة فارغة حيث كان يتواجد G سابقاً. عندما يتم الإجراء بدقة وبإعطاء الأجنة رعاية جيدة بعد العملية، تنجو نسبة كبيرة منها حتى مرحلة الفقس. في مختبرنا، يبلغ متوسط معدل البقاء على قيد الحياة ما يزيد قليلاً عن 50%

ablation-single-cell-from-eight-cell-embryos-amphipod-crustacean

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويمكن أن يتأثر مصير خلية جنينية عن طريق الجزيئات الفردية الموروثة و / أو عن طريق إشارات من الخلايا المجاورة. استخدام الخرائط مصير الجنين مرحلة الانقسام القيطم، يمكن تحديد blastomeres واحدة للثقافة في عزلة لتقييم مساهمات جزيئات الخلية الموروثة مقابل خلية التفاعلات.

إإكسبلنتس قسيم أرومي لاختبار الالتزام مصير الخلايا أثناء التطور الجنيني

يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل C. ايليجانس الأريمية من الأجنة المبكرة. الخلايا الناتجة مناسبة لزراعة الخلايا أو تجارب خارج الجسم الحي.

ج. ايليجانس تشريح الأريمة: طريقة لإزالة قشر البيض وفصل الخلايا الجنينية

يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا المفردة من أجنة الزرد ، وإثراء الخلايا ذات الأهمية ، والتقاط خلايا الزرد في أنظمة تعدد الإرسال أحادية الخلية القائمة على الموائع الدقيقة ، وتقييم التعبير الجيني من الخلايا المفردة.

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

يوفر هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة حول كيفية توليد أجنة الزرد البارابايتيك من خلفيات وراثية مختلفة. عند دمجها مع قدرات التصوير التي لا مثيل لها لجنين الزرد ، توفر هذه الطريقة وسيلة قوية فريدة للتحقيق في الوظائف المستقلة للخلية مقابل الوظائف غير المستقلة للخلايا للجينات المرشحة ذات الأهمية.

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

الاستفادة من Cas9 ستنشئ ribonucleoprotein المعقدة (رنب) وسيلة قوية لتحرير الجينوم الدقيقة، وتتسم بالكفاءة. هنا، نسلط الضوء على فائدتها عبر مجموعة واسعة نطاق من الخلايا والكائنات الحية، بما في ذلك الخلايا البشرية الأساسية والكلاسيكية على حد سواء والناشئة نموذج الكائنات الحية.

تعزيز الجينوم التحرير مع ريبونوكليوبروتين Cas9 في مختلف الخلايا والكائنات الحية

والهدف من هذا البروتوكول هو النمط الجيني لداء النعمان البحر نيماتوستيلا vectensis أثناء التطفل دون التضحية بالجنين.

الكتابة الجينية لعنابة النعمان البحرية خلال التنمية المبكرة

تعقيدات الانسجه من أنظمه متعددة الخلايا العثور علي تحديد العلاقة السببية بين العظة خارج الخلية والسلوكيات الخلوية الفردية. هنا ، نقدم طريقه لدراسة الصلة المباشرة بين الإشارات التي تعتمد علي الاتصال ومحاور القسمة باستخدام الكريات البدائية الجنينية c. والخرز البوليسترين لاصقه.

في المختبر أعاده تشكيل الخلية المكانية أنماط الاتصال مع المعزولة Caenorhabditis الاجنه البدائية والخرز البوليسترين لاصقه

تعد التلاعبات الجنينية مثل استئصال الخلايا وزرعها أدوات مهمة لدراسة التطور المبكر. يصف هذا البروتوكول جهاز زرع بسيط وفعال لإجراء هذه التلاعبات في أجنة حمار وحشي.

جهاز زرع بسيط وفعال لأجنة حمار وحشي

يتم إنشاء النباتات الخارجية blastoderm حمار وحشي عن طريق عزل الخلايا الجنينية من مراكز الإشارات الذاتية داخل الجنين المبكر، وإنتاج مجموعات الخلايا السذاجة نسبيا التلاعب بسهولة ومثقفة ex vivo. توفر هذه المقالة تعليمات لجعل مثل هذه explants ويوضح فائدتها عن طريق استجواب الأدوار للإشارات العقدية أثناء gastrulation.

جيل من الساذج Blastoderm Explants من أجنة زيبرافيش

يتطلب التطور الجنيني تنسيقا واسع النطاق لحركة الخلية. يسمح الإثارة ثنائية الفوتونيز بالاجتثاث بالليزر بوساطة الاستئصال ثلاثي الأبعاد الذي يتم التحكم فيه مكانيا لمجموعات كبيرة من الخلايا العميقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه التقنية التحقيق في رد فعل الخلايا المهاجرة بشكل جماعي في الجسم الحي للاضطرابات في بيئتها الميكانيكية.

عمليات الاستئصال العميقة والتحكم المكانية في الحجم باستخدام مجهر فوتونين في زيبرافيش غاسترولا

تعلم تقنية الاستئصال اليدوي لخلايا البلاستومير من أجنة Parhyale hawaiensis في مراحل الانقسام المبكرة. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة الأحياء الجنينية للقشريات والتطور التطوري.

الاجتثاث من خلية واحدة من خلايا الأجنة ثمانية من القشريات Amphipod

استكشف المزيد من الفيديوهات