من السهل قياس إنتشار معاملات EGFP الموسومة البروتينات عن طريق غشاء البلازما ك الفضاء صورة الارتباط الطيفي

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس معاملات الانتشار لبروتينات الغشاء في الخلايا الحية. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية خلايا تعبر عن البروتين الموُسم بـ GFP، ثم الحصول على تسلسل صور بنظام الفاصل الزمني باستخدام مجهر القرص الدوار مع ضبط التركيز على الغشاء البلازمي. وتتمثل الخطوة الثانية في اختيار منطقة قص من مجموعة الصور التي يكون فيها الغشاء مسطحاً مع خلوها من العضيات المتحركة.

بعد ذلك، يتم تحليل الجزء المقتطع باستخدام برنامج مطيافية الارتباط الصوري القائم على الحالات. وتتمثل الخطوة النهائية في حساب متوسط مخططات الانتشار باستخدام برنامج Excel. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الخلوي الحي مدمجاً مع تقنية kicks لقياس معامل انتشار بروتين غشائي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الفيزياء الحيوية للأغشية، مثل إيجاد معاملات الانتشار لبروتينات الغشاء تحت ظروف مختلفة. عند استخدام كود kicks للمرة الأولى، افتح برنامج MATLAB وانقر فوق الملف (file)، ثم قم بتعيين المسار (set path)، ثم انقر فوق "إضافة مع المجلدات الفرعية" (add with sub folders) وابحث عن المجلد الموجود على الكمبيوتر والذي يحتوي على كود kicks.

انقر موافق. قبل حفظ وإغلاق برنامج MATLAB أثناء عملية الاستحواذ، من المهم الحفاظ على تركيز الغشاء طوال مدة التصوير. حدد منطقة اهتمام مستطيلة أو ROI في الجزء المسطح من الغشاء حيث يتوزع الفلورسنت بشكل منتظم.

استبعد عضيات الخلية المتحركة ومناطق الغشاء البارزة. يتم اختيار حجم القص بحيث يتم توليد إحصائيات كافية للحصول على مخططات K squared جيدة. قم بقص المنطقة وحفظ الجزء المقصوص بتنسيق tiff.

احفظ الملف في مجلد مناسب. إذا كانت هناك عدة لقطات من الفيلم نفسه، استخدم ترقيماً تسلسلياً مثل stack one crop, do tiff، ثم stack one, crop two, tif، وهكذا. لإجراء التحليل، افتح برنامج mat lab أولاً واكتب ICS gooey في نافذة الأوامر ثم اضغط enter ICS.

تعد GUI الاسم التنفيذي لبرنامج واجهة المستخدم الرسومية الخاص بمطيافية ارتباط الصور في ICS Gooey. انقر فوق علامة التبويب kicks. ابحث عن المجلد الذي يحمل اسم MATLAB code.

قم بالتمرير إلى الملف الذي يحمل اسم scripts، وافتحه بالنقر المزدوج عليه. يُسمى هذا الملف editor. في المحرر.

قم بالتمرير لتحميل مجموعات بيانات الركلات. ثم انسخ أو اكتب اسم الملف وموقع المجلد في سطر الأوامر. في سطر الأوامر أدناه موقع المجلد.

حدد عدد الإطارات المراد تحليلها. استخدم نفس الإعدادات لجميع المقاطع المصورة المتتالية في سلسلة البيانات. في حالة حدوث انزياح في التركيز في الإطارات اللاحقة.

يجب استبعاد هذه العناصر من التحليل في المحرر. انقر على "حفظ" (save)، ثم انقر على "تقييم" (evaluate). لقد تم الآن تحميل مجموعة البيانات في برنامج التحليل ضمن نافذة تحليل الـ kicks في واجهة المستخدم الرسومية (gui).

أدخل إعدادات التحليل من خلال إلغاء تحديد مربعات T-cell أولاً. ثم أدخل عدد الفترات الزمنية الفاصلة (timelag) المراد تحليلها. أدخل القيمة القصوى لـ K squared.

عادةً ما تكون القيمة بين 20 و50 في البداية. يجب تكرار التحليل حتى يتم تحديد أفضل القيم، ومن ثم يُستخدم هذا الإعداد لجميع الأفلام المتتالية في سلسلة البيانات. تحقق دائمًا من أن الإعدادات المختارة تعطي ملاءمة جيدة للبيانات، كما يتضح من مخططات مربع الحالة الجيدة ومخطط الانتشار الخطي.

بعد ذلك، انقر على إعدادات التخزين (store settings) ثم تابع. بعد ذلك، انقر على "نعم" لإظهار جميع الرسوم البيانية. انقر على تحميل سلسلة الصور (load image series)، ثم انقر على مساحة العمل (workspace).

حدد قص سلسلة الصور قبل النقر على استيراد من مساحة العمل. الآن أدخل إعدادات تجميع نظام التصوير في مربع حجم البكسل. أدخل حجم البكسل المسقط لنظام التصوير الذي تم الحصول على مجموعات الصور من خلاله.

انقر فوق تحديد مناطق الاهتمام (ROIs) وأدخل منطقة واحدة. ثم انقر فوق موافق واستخدم الصورة كاملة. انقر فوق إجراء تحليل الركلات وانقر فوق نعم لإجراء تصفية العناصر غير المتحركة.

ستفتح النتائج تلقائياً كصور. قم بتصغير نافذة الإعدادات، ونافذة معلومات الخلية، ونافذة الفيزياء الضوئية في نافذة الديناميكيات. تحقق من أن مخطط الديناميكيات يُظهر ملاءمة خطية للبيانات لتتماشى مع ميل سلبي، مما يعني وجود ارتباط بين نقاط البيانات وإمكانية افتراض الانتشار الحر.

سجل معامل الانتشار الخاص بإعدادات التأخير الزمني وK squared المحددة. يجب أن تتجمع نقاط البيانات في مخططات K squared حول الخط الخاص بالزمن المعطى. حدد مربع اختيار Lags، ثم اختر حفظ الأشكال المفتوحة كصور، وبعد ذلك انقر فوق حفظ الأشكال المفتوحة كصور لحفظ ملفات النتائج.

احفظ البيانات في مجلد جديد، ثم انقر فوق "مسح البيانات الحالية" (clear current data) وتابع تحليل المحصول التالي. باستخدام أسماء المحاصيل التي تم تحديدها مسبقاً، أدخل معاملات الانتشار الفردية لكل منطقة اهتمام (ROI) في جدول بيانات، واحرص على تدوين عدد الفوارق الزمنية (time lags) وقيم K squared. احسب متوسط معامل الانتشار والانحراف المعياري باستخدام برنامج جداول البيانات.

أجرِ اختبار MOV Smirnoff أو اختبار T-test لتقييم الفروق الإحصائية. وباستخدام مستوى دلالة 5%، يمكن إجراء مقارنات كمية بين الخلايا بشكل مفتوح. أما نسخة جدول البيانات من مخططات الانتشار، فقد تم إنشاؤها بواسطة برنامج التحليل لكل محصول مع حساب متوسط البيانات لكل حالة لكل فاصل زمني.

قم بإنشاء مخطط انتشار متوسط جديد للعرض في الأوراق البحثية أو العروض التقديمية. النتائج المعروضة هنا هي تسلسل صور بفاصل زمني لبروتين Aquaporin three الموسوم بـ EGFP. تم التصوير في خلايا MDCK الحية، وهي خلايا ظهارية كلوية، باستخدام مجهر القرص الدوار مع ضبط التركيز على الغشاء البلازمي.

تظهر هنا صورة للخلية مع تحديد أمثلة لمناطق الاهتمام (ROI) المقتطعة داخل مستطيلات لاختيار العينات المقتطعة. من المهم إجراء الاقتطاع عند محيط الخلية حيث يكون الغشاء منتظماً ومسطحاً، لضمان تصور الانتشار ثنائي الأبعاد فقط. يجب تجنب العضيات الخلوية والحويصلات والبروزات الغشائية، ومن الضروري لأغراض التحليل عدم وجود أي انزياح أثناء التصوير الزمني.

تم استبعاد هذه العينة الممثلة من التحليل ومن عملية الـ kicks نظراً لوجود حويصلات متحركة، والتي يمكن أن تساهم في معامل الانتشار. ويظهر هنا مثال آخر لعينة مستبعدة تحتوي على ثقب في الغشاء. ويُعرض هنا مخطط الانتشار لعينة واحدة تم إنشاؤها باستخدام الـ kicks.

يمكن استخدام هذه الطريقة لإيجاد معامل الانتشار لبروتين مُوسوم ببروتين فلوري، أو صبغة، أو نقاط كمية. يمثل ميل المنحنى في مخطط الانتشار ببساطة القيمة السالبة لمعامل الانتشار؛ الموضح هنا لبروتين Aquaporin three المُوسوم بـ EGFP هو مخطط انتشار محسوب يحتوي على فترات زمنية فاصلة كثيرة جداً. في هذه الحالة، أُعيد إجراء التحليل، ولكن باستخدام فترات زمنية فاصلة أقل ليكون مخطط الانتشار خطياً.

يُعرض هنا مخطط مربع حالة نموذجي. هذا هو منحنى الارتباط الذي تم حسابه عبر المتوسط الشعاعي والتحويل اللوغاريتمي لفترة تأخير زمني مختارة من مخططات K المربعة هذه. يتم رسم الميل مقابل فترات التأخير الزمني، والنتيجة هي مخطط الانتشار الموضح سابقاً.

عند فحص مخططات K squared، من المهم تقييم جودة الملاءمة من خلال مخطط K squared هذا. ويمكن استنتاج أن الجزء المقطوع صغير جداً ولا يمكن تحليله، حيث ينبغي أن يكون له ميل سالب وأن يتلاشى خطياً وصولاً إلى مستوى الضجيج. يتطلب مخطط K squared هذا إعادة التحليل مع تقليل القيمة القصوى لـ K squared، نظراً لأن الملاءمة لم تعد جيدة بناءً على زيادة البواقي عند قيم K squared الأكبر.

في هذه الحالة، يجب تشغيل التحليل مرة أخرى، مع إدخال قيمة قصوى أقل لـ K squared. يظهر هنا مخطط انتشار متوسط تم حسابه عبر 10 عينات. تم استخراج مخطط الانتشار من ملف Excel الخاص بالتحليل.

يتم حساب معامل انتشار البروتين AQUAPORIN three EGFP باتباع هذا الإجراء. ويمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل قياس معامل انتشار بروتينات الغشاء بعد إضافة عقاقير مختلفة، وذلك للإجابة على تساؤلات إضافية مثل مدى تغير معامل الانتشار بعد العلاج بالعقاقير، وما إذا كان من المحتمل حدوث تغيرات في البيئات الدهنية و/أو التفاعلات البروتينية-البروتينية في الغشاء.