صدمة الموجة التطبيق إلى الخلية الثقافات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجنب التأثيرات الفيزيائية المشتتة أثناء العلاج بالموجات الصدمية في المختبر (in vitro) من أجل تحقيق نتائج قابلة للتكرار. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق ملء قارورة زراعة الخلايا تماماً بوسط الزراعة، ثم وضع القارورة في حمام مائي ساخن. وتتمثل الخطوة الثانية في استخدام كمية وفيرة من جل الموجات فوق الصوتية عند ربط الجهاز المطبق بحمام الماء.

بعد ذلك، يتم وضع المطبق مقابل غشاء الحمام المائي بطريقة أفقية. وتتمثل الخطوة النهائية في التأكد من أن مصدر الموجات الصدمية يقع على استقامة واحدة مع مركز قارورة زراعة الخلايا لضمان وضع الخلايا ضمن بؤرة الموجة. وفي الختام، يمكن إجراء تحليل للخلايا كما في هذا المثال باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real-time PCR) ومصفوفة السيتوكينات لإظهار حدوث تغير في الجينات والسيتوكينات المستهدفة.

لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذا النموذج عندما لاحظنا أن الطرق الحالية لتطبيق الموجات القصيرة مباشرة على المزارع الخلوية لا تأخذ في الاعتبار تأثير انعكاس الموجات عند الانتقال من وسط الزرع إلى الهواء المحيط. سيقوم الدكتور Chante، طالب الدكتوراه من مجموعتي البحثية، بشرح الإجراء. للبدء، قم بتسخين 3.5 liters من ماء الصنبور إلى 37 °C.

بعد ذلك، انقل الماء المُسخن إلى الحمام المائي. يجب أن يكون مستوى الماء أقل بثلاثة سنتيمترات من حافة الحمام المائي، ويجب أن يغطي الغشاء بالكامل. بعد ذلك، قم بتوصيل مستشعر درجة الحرارة بمصدر الطاقة وضع المستشعر في الفتحة المخصصة في الجدار الخلفي للحمام المائي.

ثم أثناء تحريك الماء، قم بتوصيل السخان بمصدر الطاقة باستمرار وسخن الماء حتى يصل إلى درجة حرارة ثابتة تبلغ 37 degrees Celsius. تحت ظروف معقمة، قم بزراعة الخلايا في دوارق زراعة T 25.

وبذلك ستصل نسبة التلاقي إلى 90% بعد التحضين طوال الليل. ثم توضع الدوارق بشكل رأسي وتُملأ بوسط الزرع وصولاً إلى أسفل عنق الدورق لتجنب التلوث. يجب عدم السماح للوسط بملامسة عنق الدورق أو غطاء الإغلاق.

بعد ذلك، أغلق الدوارق بغطاء صلب بدون مرشح لمنع التلوث من المياه الموجودة في الحمام. ثم أحكم إغلاق الأغطية باستخدام البارافورم. وبعد إغلاق الدوارق، ثبتها في حامل باستخدام المشابك.

بعد ذلك، أدخل الدوارق المثبتة في الحمام المائي وقم بمحاذاة منتصف دورق زراعة الخلايا. وباستخدام مركز غشاء أداة تطبيق الموجات الصدمية، ضع كميات وافرة من هلام نقل الموجات فوق الصوتية على أداة تطبيق الموجات الصدمية وعلى غشاء الحمام المائي. ثم قم بتوصيل أداة التطبيق بالغشاء مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء بينهما.

بعد ذلك، أمسك بمطبق الموجات الصدمية في مركز الغشاء وتأكد من محاذاته أفقياً وعمودياً مع قارورة زراعة الخلايا لضمان معالجة منطقة نمو الخلايا بأكملها. ثم أجرِ تجربة استطلاعية لتحديد المسافة المثالية بين مطبق الموجات الصدمية وقارورة الزراعة، وكذلك لتحديد معلمات المعالجة الصحيحة. تأكد من الحفاظ على ثبات وضعية قارورة الزراعة والمطبق أثناء تفعيل جهاز الموجات الصدمية.

بمجرد تحديد المسافة المثالية، يتم إجراء التجربة وفقاً لمعايير معالجة الموجات الصدمية المطلوبة. وبعد اكتمال معالجة الموجات الصدمية، تُخرج قارورة زراعة الخلايا من الحمام المائي، وتُجفف باستخدام مناشف ورقية، ثم يُطهر السطح الخارجي للقارورة. بعد ذلك، يُنقل الوسط من القارورة إلى أنبوب طرد مركزي.

يتم تجميع الخلايا في شكل كرة (Pellet) باستخدام معايير الطرد المركزي المعتادة. ثم تُعاد معلقة كرة الخلايا في 2 mL من وسط زراعة الخلايا، وبعد ذلك تُنقل معلقة الخلايا مرة أخرى إلى الدورق الذي يحتوي على 5 mL من وسط زراعة الخلايا، وتُترك الخلايا لتنمو حتى تصل إلى درجة التلاقي (confluency) المطلوبة لتجارب تحليل الخلايا. وقد كشف تحليل Real time PCR للخلايا البطانية لوريد السرة البشري عن زيادة في تنظيم مستويات mRNA لـ tie2 بعد العلاج بالموجات التصادمية.

يشير هذا إلى أن العلاج بالموجات الصدمية أدى إلى زيادة تكاثر الخلايا البطانية وتكون الأوعية الدموية. كما تم قياس مستويات السيتوكينات في الوريد السري، حيث تم تقدير كمية الخلايا البطانية باستخدام مصفوفة السيتوكينات.

وُجد أيضاً أن السيتوكينات الالتهابية IL six وIL eight قد ارتفعت بشكل ملحوظ، وكلاهما يشارك في الالتهاب المصاحب لعملية تكون الأوعية الدموية بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للعديد من الباحثين في مجال العلوم الأساسية للموجات الصدمية لاستكشاف التأثيرات على نوع واحد من الخلايا في تجارب in vitro. ونأمل في إقناع المزيد من الباحثين باستخدام هذا النموذج من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار والمقارنة في علم الموجات الصدمية.