عينة تصحيح الانجراف بعد 4D متحد البؤر التصوير الوقت الفاصل

يسمح TimeLapse Microscopy بتصور عمليات نمو التطوير ، أو انجراف العينة التي تحدث فوق هذه الصورة. يمكن أن يؤدي الاستحواذ إلى عدم القدرة على متابعة أو تتبع حركات الخلايا ، البروتوكول التالي. نحن نستخدم برنامج معالجة التصوير مفتوح المصدر لتصحيح الانجراف ثلاثي الأبعاد بمرور الوقت.

التقاط سلسلة من الأقسام البصرية في مستويات بؤرية مختلفة بإنشاء نموذج ثلاثي الأبعاد للعينة. يمكن توسيع هذا إلى أربعة أبعاد عن طريق إنشاء سلسلة بفاصل زمني من مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد. في تجارب الفاصل الزمني طويلة المدى ، من الشائع ملاحظة حركة العينة.

يمكن أن يحدث هذا بسبب انزلاق الدقة في مرحلة التحكم في الأجهزة ، والمواقف البؤرية ، بينما في حالات أخرى يكون الانجراف نتيجة للحركات الناجمة عن نمو العينة أو المرونة داخل طرق الوسائط المتصاعدة موجودة للتعويض عن الحد من هذه الحركات مع العديد من التحسينات على أنظمة تركيز الأجهزة وزيادة صلابة وسيط التركيب. ومع ذلك ، لا يمكن تطبيق هذه الأساليب في كثير من الحالات بسبب إعداد التصوير المطلوب لتوفير الظروف المناسبة لصيانة العينات ونموها لتصحيحها. بالنسبة لانجراف العينة ، قمنا بتطوير مكون إضافي للاستفادة من منصة معالجة التصوير مفتوحة المصدر في فيجي.

إن المكون الإضافي الصحيح للانجراف ثلاثي الأبعاد قادر على تشكيل تسجيل ارتباط الطور لتصحيح الحركة التي تحدث كدور أو انجراف عينة في تجارب الفاصل الزمني ثلاثية الأبعاد في تجارب متعددة القنوات. يستخدم المكون الإضافي 3D Drift الصحيح قناة واحدة لتحديد التصحيح المطلوب. ثم يتم تطبيق هذا التصحيح على أي قنوات إضافية تؤدي إلى تسجيل مجموعة بيانات الأربعة D.

حزمة الويب المجانية مفتوحة المصدر. فيجي عبارة عن شوكة توزيع ، برنامج Image J ، الذي يحتوي على مكونات إضافية مثبتة مسبقا لإجراء العديد من العمليات على البيانات التي تم جمعها من تجارب الفحص المجهري. توفر فيجي بنية مكون إضافي أسهل وتتضمن التثبيت الافتراضي.

نسخة من المكون الإضافي الثلاثة الصحيح EG ، والذي سنستخدمه لهذا التحليل عند اكتمال التثبيت Open Fiji. تدعم فيجي استيراد مجموعة واسعة من تنسيقات صور الفحص المجهري الخاصة. يمكن تحقيق ذلك من خلال السحب والإفلات أو من خلال المستخدمين ، بيئة الفحص المجهري المفتوحة.

التنسيقات الحيوية استيراد البرنامج المساعد. إذا كانت مجموعة البيانات تتجاوز حجم الذاكرة المثبتة على نظامك، فافتح ملف الصورة كمكدس افتراضي وخيار إدارة الذاكرة. تم إنشاء مجموعة البيانات التي سنستخدمها في هذا التحليل من تجربة سلسلة زمنية ثلاثية الأبعاد لأسماك الزرد المعدلة وراثيا GFP والتي يتم فيها التعبير عن GFP في عضلة الهيكل العظمي.

لتصور النوى ، تم حقن هذا الخط المعدل وراثيا بالنواة التي تقوم بتوطين الكرز M لتمثيل أرضيات الفلور هذه بشكل أفضل ، ويمكننا تغيير جداول البحث لكل قناة من هذه القنوات ضمن أداة قناة اللون. على مدار السلسلة الزمنية التي تم جمعها ، يبدو أن عينة الأسماك بسحاب انجرفت في مجال الرؤية. قامت بتصحيح هذا الانجراف ، وفتحت المكون الإضافي الانجراف ثلاثي الأبعاد الصحيح في القائمة الفرعية للتسجيل للمكونات الإضافية المثبتة في فيجي.

علامات البائع التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع داخل عينة أو لا تشارك في أحداث التسويق أثناء الحصول على الصور أفضل مصدر لتصحيح الانجراف. في هذا المثال ، أكتا واحد ، مضان GFP في القناة الأولى. إذا كانت الذاكرة محدودة على نظامك ، فحدد خيار المكدس الظاهري واسمح بتشغيل المكون الإضافي الانجراف ثلاثي الأبعاد الصحيح.

سيكون لمجموعة البيانات المصححة حجم لوحة أكبر مقارنة بالأصل. استيعاب حركة العينة. يسمح إنشاء صور الإسقاط القصوى للأقسام البصرية بمقارنة الانجراف الذي تمت إزالته من العينة المصححة المراد إجراؤها.

يزيل الإسقاط الأقصى للكثافة البعد من مجموعة البيانات ، ولكن كطريقة مفيدة لفحص نتائج تصحيح الانجراف بسرعة. نرى هنا الحد الأقصى لصور الإسقاط لكل نقطة ربط في مجموعات البيانات المصححة وغير المصححة. عندما يتم عرض تجربة الفاصل الزمني هذه كصورة واحدة ، يكون مقدار الانجراف الذي يمكن أن يحدث حتى في تجربة الفاصل الزمني القصير واضحا.

يتم أيضا تطبيق التصحيحات التي تم إجراؤها عن طريق تسجيل انحراف قناة واحدة من عينتك على جميع القنوات الأخرى الموجودة في مكدس الصور هذا. تم تغيير إجراء تصحيح الانجراف إذا كانت الذاكرة محدودة على نظامك قليلا. حدد خيار المكدس الظاهري المستخدم في كل من تنسيق الشراء وقائمة الاستيراد وفي القائمة المنبثقة الصحيحة للمكون الإضافي 3D Drift.

عند تحديد هذا الخيار، سيطلب منك تحديد موقع يمكن للمكون الإضافي فيه تصدير ملفات صور فردية لكل شريحة قناة ونقطة زمنية لتجربة اللقطات المتتابعة. يحتوي المكدس الظاهري الذي تم إنشاؤه على نفس تصحيح الانجراف مثل مثالنا السابق. إذا فتحنا موقع الحفظ المحدد ، فسنرى ملفات تسلسل الصور الفردية الناتجة تم إنشاؤها.

لفتح هذه المجموعة من الملفات، استخدم أداة استيراد تسلسل الصور. لن يفصل الملف الناتج القنوات أو الأقسام البصرية أو النقاط الزمنية. لتصور هذه الميزات, تحويل المكدس إلى مكدس مفرط باستخدام البيانات من ملف السجل, أدخل في عدد القنوات, الشرائح البصرية ونقاط التعادل التي تم جمعها في, يمكننا مرة أخرى تغيير جداول البحث لضبط اللون المعروض من تجربتنا بفاصل زمني.

يصحح هذا البروتوكول الانجراف الذي يحدث بين النقاط الزمنية ، ولا يمكن تصحيح الانجراف الذي يحدث أثناء التقاط نقطة زمنية واحدة بواسطة هذا البروتوكول. نوصي بأن تقلل المعلمات المستخدمة للحصول على الصور من الوقت المستغرق لكل نقطة زمنية يتم التقاطها. تسمح القدرة على تصحيح الانجراف في برنامج ما بعد المعالجة بتحليل وقياس حركات الخلايا التي يمكن أن تكون مهارات من خلال انجراف العينة.