الأمثل تلطيخ سلبي: بروتوكول عالية الإنتاجية للدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني

أكثر من نصف البروتينات هي بروتينات صغيرة (الكتلة الجزيئية <200 كيلو دالتون) التي تم تحدي لكل من الإلكترون التصوير المجهر وإعادة بناء ثلاثية الأبعاد. الأمثل تلطيخ السلبية هو بروتوكول قوية وعالية الإنتاجية للحصول على صور عالية التباين والبروتينات غير المتماثلة الصغيرة أو المجمعات تحت الظروف الفسيولوجية المختلفة مرتفعة نسبيا القرار (~ 1 نانومتر).

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير البروتين الصغير وغير المتماثل باستخدام بروتوكول محسن عالي الإنتاجية للفحص المجهري الإلكتروني للتلطيخ السلبي. يتم تحقيق ذلك عن طريق احتضان البروتين أولا في محطة حضانة معدة أثناء تحضير محطة عمل تلطيخ سلبية. الخطوة الثانية من الإجراء هي غسل العينة بسرعة على ثلاث قطرات ماء بالتتابع.

الخطوة الثالثة هي تلطيخ العينة بعناية على ثلاث قطرات بقع بالتتابع. الخطوة الأخيرة هي إزالة المحلول الزائد عن طريق النشاف من الجزء الخلفي من شبكة EM ثم التجفيف برفق تحت غاز النيتروجين. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج صورا عالية الدقة للبروتينات الصغيرة من خلال تصوير TEM في ظل ظروف إلغاء التركيز البؤري المنخفضة.

تعيين الميزة الرئيسية لهذه التقنية على المجهرية الكهربائية. يمكن أن يسمح بفحص الإنتاجية العالية والتصوير عالي التباين لهياكل البروتين الصغيرة وغير المتماثلة مع تقليل القطع الأثرية للهيكل من التلوين السلبي التقليدي. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة على الأساس الهيكلي لآليات البروتين الصغيرة مثل بروتين نقل إستر الكوليسترول.

يمكن تطبيقه أيضا على بروتينات أخرى مثل IgG والبروتين الدهني عالي الكثافة والبروتيازوم ، والتي تختلف اختلافا كبيرا في الحجم. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات الغسيل والتلوين بسبب الاختلاف في التوقيت وحتى نشاف العينة يمكن أن يسبب تأثيرات كبيرة في البروتين الملون النهائي ، وسيتم تفويت توضيح الإجراء بين زميل باحث Z.A من مختبري. عند التحضير لهذا البروتوكول ، من الضروري عمل محلول 1٪ من شكل ثمانية مع إيلاء أقصى قدر من الاهتمام لتقليل تعرضها للضوء.

يتضمن ذلك لف أجزاء مرشح المحقنة N 0.2 ميكرون في رقائق معدنية عندما يحين وقت تصفية المحلول أولا. بعد التصفية ، قم بتخزين اثنين من رقائق الألومنيوم ملفوفة بملليلتر عند سالب 80 درجة مئوية في يوم التجربة. قم بإذابة كمية في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة بمجرد إذابتها تماما.

قم بتصفيته مرة أخرى من خلال مرشح 0.02 ميكرون مع أجزاء ملفوفة بورق الألمنيوم. يجب أيضا لف قارورة التجميع بورق الألمنيوم. انقل البقعة السالبة إلى صندوق ثلج حتى يتم استخدامها.

اصنع ورقة تثبيت قطرات عن طريق الضغط على بطول ثمانية بوصات من المعلمة على دعامة طرف الماصة. هذا يجعل المسافات البادئة للطريق تعمل كآبار قطرها خمسة ملليمترات. بعد عمل ستة صفوف من الآبار ، قم بتسطيح الجليد على سطح صينية الستايروفوم ، ثم ضع الصفيحة على الجليد.

بعد ذلك ، أضف 35 ميكرولترا من ماء DI إلى الآبار الثلاثة الأولى من الورقة على الجانب الأيسر. ثم قم بتحميل الآبار الثلاثة اليمنى في الورقة ب 35 ميكرولتر من محلول البقع السلبية المحضر. قم بتغطية الدرج لتقليل التعرض للضوء للمحلول.

سيكون هذا بمثابة محطة تلطيخ. الآن قم بإعداد محطة حضانة شبكة EM من صندوق طرف ماصة فارغ مع ملحق يمكن تركيب الملقط عليه. املأ الصندوق حتى منتصفه بالثلج بحيث يكون سطح الجليد قريبا من طرف الملقط عند تركيبه.

أول توهج تفريغ الرقيق المطلي بالكربون 300 شبكة من النحاس EM لمدة 10 ثوان تقريبا. بعد ذلك ، التقط شبكة بها ملاقط تتصل بمحطة حضانة شبكة EM. قم بتعليق الملقط بالشبكة ، بحيث تكون الشبكة عند إمالة 45 درجة نصف بوصة فوق الجليد.

الآن قم بتخفيف عينة البروتين في DPBS عند 50 إلى 100 ميكروغرام من البروتين لكل مليلتر من المحلول. ضع على الفور حوالي أربعة ميكرولترات من التخفيف على شبكة EM. اترك العينة تحتضن لمدة دقيقة تقريبا.

بعد دقيقة واحدة ، ربت الشبكة بسرعة بورق الترشيح لإزالة المحلول الزائد. ثم في محطة التلوين ، المس الشبكة بأول قطرة ماء على فيلم para. كرر بسرعة عملية تجفيف الفلتر وتصحيحه بالقطرة التالية.

استخدم ما مجموعه ثلاث قطرات ماء وافعل ذلك في أسرع وقت ممكن. يجب أن يتم غسل الشبكة بالماء بسرعة لتجنب التأثير السلبي لتغيير المخزن المؤقت للبروتين. بعد التخلص من الغسيل الأخير في غضون ثلاث ثوان ، ابدأ في تعويم الشبكة على أول قطرة من محلول التلوين السلبي.

دعها تطفو هناك لمدة 10 ثوان. في هذه الأثناء ، نظف الملقط بالضغط على الأطراف في ورق الترشيح. عدة مرات بعد الطفو لمدة عشر ثوان ، امسح المحلول بورق الترشيح وابدأ تعويما آخر في قطرة البقعة التالية لمدة ثانيتين.

نظف الملقط خلال ثانيتين. بعد ذلك ، جفف الشبكة وضعها على القطرة الثالثة. لمدة دقيقة كاملة قم بتغطية محطة التلوين خلال هذه الخطوة.

يجب أن تتم إزالة البقعة عن طريق لمس الجانب الخلفي من شبكة EM لفترة زمنية محددة لضمان تجفيف الشبكة بالتساوي. إذا لامس ورق الترشيح البقعة لفترة طويلة جدا ، فيمكن إزالة الكثير من البقعة مما يؤدي إلى ضعف التصوير. بعد ذلك ، تابع تجفيف الشبكة.

أولا، المس الجانب غير الكربوني بالكامل بورق الترشيح حتى يتحرك المحلول. ثانيا ، ضع تيارا لطيفا من غاز النيتروجين. الآن انقل الشبكة إلى طبق مبطن بورق الترشيح وقم بتغطية الطبق جزئيا.

اترك الشبكة تجف في الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بدلا من ذلك ، يمكن خبز العينات المحتوية على الدهون عند 40 درجة مئوية لمدة ساعة. بمجرد أن تجف بالكامل ، انقل شبكة EM إلى صندوق تخزين شبكة EM قبل البدء أولا ، قم بمحاذاة TEM.

تحقق من دقة أعلى حلقة ذوبان مرئية مع طيف الطاقة لمنطقة فيلم الكربون للشبكة الملطخة سالبا ، والتي يجب أن تكون أفضل من الدقة المستهدفة. ثم لضبط المحاذاة ، تحقق بعناية من طيف الطاقة في منطقة فيلم الكربون للعينة. في ظل حالة محاذاة بشكل صحيح ، يمكن تصور أكثر من 20 حلقة T ، وهو ما يتوافق مع التصور بشكل أفضل من خمسة أنجستروم.

تم صنع الحلقات عن طريق نقل فروي لصورة كربونية غير متبلورة تحت إلغاء التركيز البؤري 1.6 ميكرون وجرعة 20.4 إلكترون لكل مربع. انجستروم. الآن أعد التركيز إلى حالة تركيز شيرزر القريبة من حوالي 0.1 ميكرومتر لتصوير البروتينات الصغيرة أثناء فحص شبكة EM. من الناحية المثالية ، عادة ما تكون المناطق الملطخة بالقرب من حافة المناطق الملطخة السميكة ذات التكبير المنخفض.

تم عرض بنية عينات البروتين الدهني باستخدام OPNS. تشمل الأمثلة HDL المؤتلف ، والبلازما البشرية ، و LDL ، و IDL البلازما البشرية ، و VLDL البلازما البشرية. كما شوهدت هياكل أصغر مثل 53 كيلودالتون ، CETP.

هذا هو واحد من أصغر البروتينات التي تم تصويرها بنجاح بواسطة eem. يتطابق الفرض الفائق للهيكل البلوري CETP مع الصورة بشكل جيد للغاية وديناميكي للغاية. كما شوهدت البروتينات غير المتجانسة في 160 أجساما مضادة للجلوبولين المناعي G كيلودالتون.

كانت ثلاثة مجالات فرعية مرئية بوضوح. تم استخدام فحص دقيق للجسم المضاد IgG لإجراء مقارنة بتركيبته البلورية. يتطابق التركيب البلوري للجسم المضاد IgG واحد مع عرض EM لهذه الأجسام المضادة بعدة طرق ، مثل مواضع المجال وأشكالها.

تشمل الجزيئات الأخرى المعروضة 28 كيلودالتون ، والبروتين الدهني الخالي من الدهون ، والبروتيازومات. بشكل أساسي ، تعمل طريقة OPNS على تطوير حدود التصوير الكهرومغناطيسي بشكل كبير للهياكل الصغيرة غير المتماثلة بالإضافة إلى الدراسات الميكانيكية المرتبطة بها أثناء محاولة الإجراء. من المهم تقليل التعرض للضوء لكاشف البقعة قدر الإمكان لغسل العينة بسرعة واستخدام تركيز الكنز القريب للتصوير باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير المقطعي الإلكتروني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل هياكل دقة النانومتر للجزيئات المفردة والتغيرات التأكيدية بينها. بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا الهيكلية لاستكشاف مغناطيس نقل الإستر العنقودي بين البروتينات الدهنية في البلازما البشرية.