الأمثل تلطيخ سلبي: بروتوكول عالية الإنتاجية للدراسة صغيرة وغير المتناظر هيكل البروتين بواسطة المجهر الإلكتروني

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير بروتين صغير وغير متماثل باستخدام بروتوكول مُحسَّن عالي الإنتاجية للمجهر الإلكتروني بالصبغ السلبي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحضين البروتين في محطة تحضين مُجهزة أثناء تجهيز محطة عمل الصبغ السلبي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في غسل العينة بسرعة على ثلاث قطرات من الماء بشكل متتابع.

تتمثل الخطوة الثالثة في صبغ العينة بعناية باستخدام ثلاث قطرات صبغ بالتتابع. والخطوة النهائية هي إزالة المحلول الزائد عن طريق التجفيف بالتربيت من الجانب الخلفي لشبكة EM، ثم التجفيف بلطف تحت غاز النيتروجين. وفي النهاية، يمكن أن تظهر النتائج صوراً عالية الدقة لبروتينات صغيرة من خلال تصوير TEM تحت حالة defocus منخفضة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمجهر الإلكتروني المبرد في إمكانية إجراء فحص عالي الإنتاجية وتصوير عالي التباين للبنى البروتينية الصغيرة وغير المتماثلة، مع تقليل الشوائب البنيوية الناتجة عن الصبغ السلبي التقليدي. وبالرغم من ذلك، يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية معمقة حول الأساس البنيوي لآليات عمل البروتينات الصغيرة مثل بروتين نقل استر الكوليسترول.

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على بروتينات أخرى مثل جسم مضاد IgG واحد، والبروتين الدهني عالي الكثافة، والبروتيزوم، والتي تختلف بشكل كبير في الحجم. ويُعد التوضيح المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الغسيل والتلوين يصعب تعلمها بسبب التفاوت في التوقيت، كما أن مجرد تجفيف العينة قد يؤدي إلى تأثيرات جذرية على البروتين المصبوغ النهائي. لذا، سيتم تقديم عرض توضيحي لهذا الإجراء لزميل أبحاث Z.A من مختبري. وعند التحضير لهذا البروتوكول، من الضروري تحضير محلول 1%urinal form eight مع إيلاء أقصى درجات الاهتمام لتقليل تعرضه للضوء.

يتضمن ذلك تغليف أجزاء مرشح السرنجة بمسامية 0.2 micron بورق القصدير عند البدء في ترشيح المحلول لأول مرة. وبعد الترشيح، تُخزن حصص من المحلول بحجم 2 mL في قوارير مغلفة بورق القصدير عند درجة حرارة 80- °C في يوم التجربة. يتم إذابة حصة واحدة في حمام مائي بدرجة حرارة الغرفة حتى تذوب تماماً.

قم بترشيحه مرة أخرى باستخدام مرشح بمسامية 0.02 micron مع تغليف الأجزاء برقائق الألومنيوم. يجب أيضاً تغليف أنبوبة التجميع برقائق الألومنيوم. انقل صبغة التلوين السلبي إلى صندوق ثلجي حتى وقت استخدامها.

قم بتصنيع ورقة تثبيت القطيرات عن طريق ضغط قطعة من البارافين بطول ثماني بوصات على مسند رؤوس الماصات. سيؤدي ذلك إلى تكوين تجاويف طولية تعمل كآبار بقطر 5 mm. بعد تكوين ستة صفوف من الآبار، قم بتسوية الثلج على سطح صينية من البوليسترين، ثم ضع الورقة فوق الثلج.

بعد ذلك، أضف 35 µL من الماء منزوع الأيونات (DI water) في الآبار الثلاثة الأولى من الورقة على الجانب الأيسر. ثم املأ الآبار الثلاثة اليمنى في الورقة بـ 35 µL من محلول الصبغ السلبي المُحضّر. غطِّ الصينية لتقليل تعرض المحلول للضوء.

ستعمل هذه المنطقة كمحطة صبغ. والآن قم بتجهيز محطة تحضين لشبكات المجهر الإلكتروني (EM grid) باستخدام صندوق رؤوس ماصات فارغ مع ملحق يمكن تثبيت الملاقط عليه. املأ الصندوق إلى منتصفه بالثلج بحيث يكون سطح الثلج قريباً من طرف الملاقط عند تثبيتها.

أولاً، قم بإجراء تفريغ توهجي لشبكات النحاس EM ذات المسامات 300 والمغطاة بطبقة رقيقة من الكربون لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. بعد ذلك، التقط شبكة باستخدام ملاقط تثبت في محطة تحضين شبكات EM. قم بتعليق الملاقط مع الشبكة، بحيث تكون الشبكة مائلة بزاوية 45 درجة على ارتفاع نصف بوصة فوق الجليد.

الآن قم بتخفيف عينة البروتين في محلول DPBS بحيث يكون تركيز البروتين من 50 إلى 100 micrograms لكل milliliter من المحلول. ضع فوراً حوالي four microliters من التخفيف على شبكة EM. اترك العينة لتحضن لمدة دقيقة واحدة تقريباً.

بعد مرور دقيقة واحدة، جفف الشبكة بسرعة باستخدام ورق ترشيح لإزالة المحلول الزائد. ثم عند محطة الصبغ، لامس الشبكة بقطرة الماء الأولى الموجودة على فيلم البارافين (para film). كرر عملية تجفيف المرشح وترطيبه بالقطرة التالية بسرعة.

استخدم ثلاث قطرات من الماء إجمالاً، وقم بذلك بأسرع ما يمكن. يجب غسل الشبكة بالماء بسرعة لتجنب التأثير السلبي لتغيير المحلول المنظم على البروتين. بعد تجفيف آخر غسلة في غضون ثلاث ثوانٍ، ابدأ بوضع الشبكة طافية فوق القطرة الأولى من محلول الصبغ السلبي.

اتركها تطفو هناك لمدة 10 ثوانٍ. وفي هذه الأثناء، نظف الملقط بالضغط على أطرافه في ورق ترشيح. بعد مرور العشر ثوانٍ من الطفو بمرات قليلة، جفف المحلول باستخدام ورق ترشيح وابدأ عملية طفو أخرى في قطرة الصبغة التالية لمدة ثانيتين.

نظف الملاقط خلال ثانيتين. بعد ذلك، جفف الشبكة بالتربيت ثم ضعها فوق القطرة الثالثة. قم بتغطية محطة التلوين لمدة دقيقة كاملة خلال هذه الخطوة.

يجب إزالة الصبغة عن طريق ملامسة الجانب الخلفي لشبكة EM لمدة زمنية محددة لضمان جفاف الشبكة بشكل متساوٍ. إذا لامست ورقة الترشيح الصبغة لفترة طويلة جدًا، فقد يتم إزالة كمية زائدة من الصبغة، مما يؤدي إلى رداءة التصوير. بعد ذلك، انتقل إلى تجفيف الشبكة.

أولاً، قم بملامسة الجانب غير الكربوني بالكامل إلى ورق الترشيح حتى ينتقل المحلول بعيداً. ثانياً، وجه تياراً لطيفاً من غاز النيتروجين. الآن، انقل الشبكة إلى طبق مبطن بورق الترشيح وقم بتغطية الطبق جزئياً.

اترك الشبكة لتجف في الطبق لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبدلاً من ذلك، يمكن تجفيف العينات التي تحتوي على دهون في فرن عند درجة حرارة 40 °C لمدة ساعة. وبمجرد جفافها تماماً، انقل شبكة EM إلى صندوق تخزين شبكات EM قبل البدء أولاً بمحاذاة TEM.

تحقق من دقة أعلى حلقة إذابة مرئية باستخدام طيف القدرة لمنطقة غشاء الكربون في الشبكة المصبوغة سلبياً، والتي يجب أن تكون أفضل من الدقة المستهدفة. بعد ذلك، ولضبط المحاذاة، افحص بعناية طيف القدرة في منطقة غشاء الكربون للعينة. في حالة المحاذاة الصحيحة، يمكن رؤية أكثر من 20 حلقة Thaw، وهو ما يتوافق مع رؤية تتجاوز خمسة أنجستروم.

تَمّ إنشاء الحلقات بواسطة تحويل فوريه لصورة كربون غير متبلور تحت إزاحة بؤرية قدرها 1.6 microns وجرعة قدرها 20.4 electrons per square.Angstrom. الآن، أعد البؤرة إلى حالة تركيز شيرتزر (Scherzer focus) تقريباً عند حوالي 0.1 micrometers لتصوير البروتينات الصغيرة أثناء فحص شبكة المجهر الإلكتروني (EM grid). ومن الناحية المثالية، تتواجد المناطق المصبوغة عادةً بالقرب من حواف المناطق السحابية المصبوغة الأكثر سمكاً عند التكبير المنخفض.

تم فحص بنية عينات البروتينات الدهنية باستخدام OPNS. وتشمل الأمثلة على ذلك HDL المؤتلف، وبلازما الإنسان، وLDL، وIDL من بلازما الإنسان، وVLDL من بلازما الإنسان. كما تم فحص بنيات أصغر مثل CETP بوزن 53 kilodalton.

يُعد هذا أحد أصغر البروتينات التي تم تصويرها بنجاح بواسطة eem. ويتطابق تراكب البنية البلورية لـ CETP مع الصورة بشكل جيد جداً وبديناميكية عالية. كما تم فحص بروتينات غير متجانسة في أجسام مضادة من نوع immunoglobulin G بكتلة 160 kilodalton.

كانت ثلاثة نطاقات فرعية مرئية بوضوح. وعند فحص جسم مضاد من نوع IgG1 بدقة أكبر، استُخدم لإجراء مقارنة ببنيته البلورية. وتتطابق البنية البلورية للجسم المضاد IgG1 مع عرض المجهر الإلكتروني لهذه الأجسام المضادة من عدة نواحٍ، مثل مواقع النطاقات وأشكالها.

تضمنت الجزيئات الأخرى التي تم فحصها البروتين الدهني A-I الخالي من الدهون بوزن 28 kilodalton، وEL، والبروتيزومات. وبشكل أساسي، تساهم طريقة OPNS في دفع حدود التصوير بالمجهر الإلكتروني (EM) للهياكل الصغيرة غير المتماثلة، بالإضافة إلى الدراسات الميكانيكية المرتبطة بها. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تقليل تعرض كاشف الصبغة للضوء قدر الإمكان، وغسل العينة بسرعة، واستخدام بؤرة التركيز القريبة من القمة (near treasure focus) للتصوير بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل التصوير المقطعي الإلكتروني للإجابة على أسئلة إضافية، مثل بنيات الجزيئات المنفردة بدقة النانومتر والتغيرات التشكيلية فيما بينها. وبعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا البنيوية لاستكشاف آليات انتقال إستر الكوليسترول بين البروتينات الدهنية في البلازما البشرية.