الفصل الآلي لل C. ايليجانس المستعمرة بنسب مختلفة من قبل الممرض الجرثومي

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم مساهمات الاستعمار والأضرار المرتبطة به في بدء الاستجابات المناعية الفطرية في أناقة البحر. يتم تحقيق ذلك من خلال تعريض مجموعة متزامنة من أناقة البحر البالغة للشباب الكاذب الذي يعبر عن بروتين الفلورسنت الأخضر أو GFP ، والذي ينتج مجموعة من الديدان المستعمرة بشكل مختلف بواسطة العامل الممرض. بعد الغسيل التفاضلي ، يتم فصل مجموعات الديدان المستعمرة إلى مجموعات نقية مع التركيز على طرفي الديدان المستعمرة بالكامل وغير المستعمرة.

بعد ذلك ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي من هذه المجموعات السكانية ويتم تقييم التعبير الجيني المناعي مقارنة بالديدان المزروعة على القولونية الإلكترونية غير المسببة للأمراض. من أجل فحص العلاقة بين الاستجابة المناعية والاستعمار ، يتم الحصول على نتائج لإظهار أن الاستجابة المناعية الفطرية لأناقة البحر ل p arosa يمكن فصلها عن استعمار مسببات الأمراض. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الأخرى لدراسة بدء الاستجابة المناعية في أناقة البحر هي أنها تعالج التباين في العدوى في السكان الدافئين ، مما يسمح لنا بفصل الجوانب المختلفة لعملية العدوى.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في أناقة البحر والمناعة الفطرية مثل ما هو أساس بدء الاستجابات المناعية الفطرية وبطريقة عالية الإنتاجية. ما هو تأثير التلاعب الجيني أو البيئي المختلف على القدرة على مقاومة استعمار مسببات الأمراض؟ للبدء في زراعة الديدان على العديد من الديدان الخيطية أو وسط النمو أو صفائح NGM المصنفة ببكتيريا الإشريكية القولونية حتى تصل العديد من الديدان إلى مرحلة الخطورة.

ثم عالج القبور بمحلول تحضير البيض للحصول على ثقافة متزامنة. اللوحة التالية. البيض على عدة ألواح NGM مقاس 60 ملم بذرة بالبكتيريا بكثافة تتراوح من 150 إلى 200 بيضة تقريبا لكل طبق.

ستكون هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 15 إلى 20 لوحة للحصول على عدة آلاف من الديدان. بالنسبة لتجربة الفرز ، يجب على المستخدمين التوسع باستخدام ألواح ذات قطر أكبر تحتوي على المزيد من البيض لكل طبق إذا كانت هناك حاجة إلى أعداد أكبر من الديدان. احتضان الصفائح عند 20 درجة مئوية لمدة يومين حتى تصل الديدان إلى المرحلة الأربعة أو مرحلة الشباب.

في اليوم التالي من تحضير البيض ، قم بتلقيح A GFP الذي يعبر عن ثقافة POSA ، PA 14 GFP ، في ملليلترين من Kings B.Medium الذي يحتوي على مضاد حيوي. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية مع التحريض بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بوضع ثقافة PA 14 GFP على أكبر عدد ممكن من ألواح القتل البطيئة حسب الحاجة للفحص على كل طبق بتري 150 ملم.

ماصة 75 إلى 100 ميكرولتر من الثقافة المشبعة وتنتشر بالتساوي. باستخدام مفرشة زجاجية معقمة ، احتضن الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 20 إلى 24 ساعة. قم بإزالة الألواح التي تحتوي على PA 14 GFP من الحاضنة واتركها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

في هذه الأثناء ، لجمع الديدان المزروعة على ألواح NGM ، أضف كمية صغيرة من M تسعة عازلة كافية لتغطية اللوحة. قم بتدوير اللوحة برفق وانقل السائل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اسمح للديدان بالاستقرار في القاع وإزالة السوائل الزائدة قبل نقل الديدان إلى ألواح PA 14 GFP في الحد الأدنى من السائل ، عند استخدام ألواح 150 ملم ، يمكن وضع عدة مئات من الديدان على طبق واحد.

احتضان الصفائح عند 25 درجة مئوية لمدة 18 إلى 21 ساعة للديدان الشابة المعرضة للأروسا. هذه هي النافذة الزمنية التي تعرض التوزيع الأمثل للحيوانات المستعمرة مقابل غير المستعمرة قبل إجراء فرز العينة ، وتأكد من أن الماكينة تعمل بشكل صحيح. يتم توضيح الخطوات الأساسية هنا ويمكن الحصول على التفاصيل عبر الإنترنت.

اضبط ضغط صمام الغلاف على ما يقرب من خمسة رطل لكل بوصة مربعة للتحقق من أن معدل تدفق سائل الغمد مناسب. ضع أنبوبا مخروطي سعة 15 مليلتر أسفل الموزع. قم بتشغيل صمام الغلاف وإيقاف تشغيل صمام الفرز.

امسك الأنبوب أسفل الموزع لمدة 60 ثانية. يجب أن يكون الحجم في الأنبوب من تسعة إلى 10 ملليلتر. إذا كان خارج هذا النطاق.

اضبط ضغط صمام الغمد وفقا لذلك للتأكد من أن معدل تدفق سائل الغمد سيسمح بالفرز الدقيق. اختبر معدل الفرز عن طريق إيقاف تشغيل صمام الغلاف أولا. ثم أضف حوالي 25 مل من محلول جزيئات التحكم إلى الخزان.

قم بتشغيل صمام الغلاف وصمام العينة على برنامج الكمبيوتر. انتقل إلى وضع جسيمات التحكم وانقر فوق اكتساب. تأكد من أن معدل تدفق الجسيمات يقارب خمسة إلى ثمانية جسيمات في الثانية مع وقت الرحلة الذي يقارب عرض الجسيم البالغ 40 ميكرومتر.

سيضمن ذلك مرور جسم واحد فقط بحجم 40 ميكرون في المرة الواحدة. إذا كانت القيم خارج هذا النطاق، فاضبط الإعدادات وفقا لذلك. باستخدام M تسعة عازلة تغسل الديدان في أنابيب مخروطية سعة 15 مليلتر ، اسمح للديدان البالغة بالغ في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية وإزالة المادة الطافية.

املأ الأنبوب بمخزن مؤقت M nine طازج. كرر هذه العملية ثلاث إلى أربع مرات. هذا يزيل نسبة كبيرة من اليرقات وكذلك البكتيريا الزائدة ويستغرق حوالي 10 دقائق.

أضف الديدان إلى خزان فارز الديدان الذي يحتوي على قضيب تقليب صغير للخلط برفق. اضبط كسب الإشارة الأولية عن طريق ضبط أنبوب المضاعف الضوئي الأخضر على 600 وأنبوب المضاعف الضوئي باللونين الأحمر والأصفر على 200. ابدأ في الحصول على البيانات لضبط الإعدادات.

استهدف معدل فرز من 25 إلى 30 حدثا أو ديدانا في الثانية. إذا كان معدل العدد مرتفعا جدا ، فقم بتخفيف الديدان في الخزان باستخدام M تسعة. عازلة وفقا لذلك.

إذا كان المعدل منخفضا جدا ، أضف المزيد من الديدان بحجم صغير من M تسعة. إذا كانت التجربة تتطلب فصلا صارما للغاية بين الديدان المستعمرة مقابل الديدان غير المستعمرة ، فقم بتعيين فحص الصدفة على نقي. يضمن ذلك أنه في حالة حدوث كائنين قريبين جدا من بعضهما البعض أو في نفس القطرة ، فإن الجهاز يرفض السقوط.

بدلا من جمعها لفرز السكان المهتمين ، ارسم بوابات حول المحور تشير إلى الحجم وشدة التألق. يجب تحديد قيم بوابات الفلورسنت تجريبيا. بعد ذلك ، ضع طبقا متعدد الآبار أو طبق بتري أسفل الموزع لجمع الديدان.

ثم افتح صمام الفرز لبدء فرز الديدان. اجمع مجموعة صغيرة من للتحقق تحت المجهر من أن السكان الذين تم فرزهم هم السكان المعنيون. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاضبط معلمات البوابة وفقا لذلك وتابع جمع العينات.

عندما يتطابق العمر ، فإن أناقة البحر المتطابقة وراثيا التي تتعرض ل GFP التي تعبر عن posa تؤدي إلى توزيع واسع في مستويات الاستعمار ، وتم تحقيق الفصل الفعال للديدان غير المستعمرة عن الديدان المستعمرة باستخدام فارز الديدان. على عكس الديدان غير المستعمرة ، تظهر الديدان المستعمرة علامات علنية مثل الخمول وتقليل التغوط. قد يكون هذا الأخير سببا يجعل الديدان المستعمرة بواسطة P arosa تواجه صعوبة في التخلص من العدوى.

تم تحفيز أربعة جينات بشكل مشابه للتعرض ل P arosa بغض النظر عن حالة استعمار الديدان وتم استخدام R-T-P-C-R الكمي لقياس التعبير عن الجينات. من المعروف أن الجينات الأربعة جزء من الاستجابة المناعية ل CL egan. يقوم Lys two بتشفير الليزوزيم ، وهما جينان غير مميزين يستجيبان على وجه التحديد للعدوى ، ويساهم أحدهما أيضا في مقاومة العدوى ، ويستجيب PGP خمسة للعدوى وكذلك لإجهاد المعادن الثقيلة.

النتائج النتائج المنشورة سابقا والتي تشير إلى أن الاستعمار والأضرار المرتبطة به غير مطلوبة للاستجابة المناعية. بدلا من ذلك ، يشير إلى الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض كبيانات إشارة تظهر أن PGP five يتم إحداثه في غير المستعمرة ، والتي لا يتوقع أن تتعرض لها. يشير الضرر الواسع النطاق إلى وجود تداخل في البرامج التنظيمية ، والتحكم في الاستجابات المناعية واستجابات الإجهاد العامة في أناقة البحر.

يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى جديدة حول بدء الاستجابات المناعية في أناقة البحر ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على أسئلة أخرى مثل تأثيرات الظروف البيئية أو التلاعب الجيني على الاستعمار أو المنافسة بين مسببات الأمراض المختلفة إلى جانب عمليات العدوى. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لمتابعة التفاعلات الأخرى للديدان مع بيئتها مثل ابتلاع أو عزل المستقلبات أو المواد الكيميائية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن استخدام المجموعات السكانية المصنفة ذات الأهمية لمجموعة متنوعة من الأغراض التي تتجاوز التعبير الجيني.

وتشمل هذه جمع الحية لمقايسات العدوى أو البقاء على قيد الحياة اللاحقة أو التجارب السلوكية. توفر هذه التقنية وسيلة مفيدة لدراسة آثار التعرض لمسببات الأمراض والاستعمار على المناعة الفطرية وأناقة البحر.