الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية
يناير 23, 2014
أنشأنا فلوري التهجين الموضع البروتوكول في للكشف عن فيروس الحمض النووي الجينوم المستمرة داخل أقسام الأنسجة من النماذج الحيوانية. هذا البروتوكول يتيح دراسة عملية العدوى عن طريق codetection من الجينوم الفيروسي، والمنتجات RNA لها، والبروتينات الفيروسية أو الخلوية داخل الخلايا واحد.
الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن جينوم فيروس الهربس البسيط ، النوع الأول في أقسام من العقد ثلاثية التوائم من الفئران المصابة كامنة عن طريق التهجين الفلوري في الموقع. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلقيح الفيروس أولا في شفة ، تليها فترة حضانة مدتها 28 يوما يتم خلالها ترسيخ الفيروس في العقد ثلاثية التوائم. بعد ذلك ، يتم حصاد العقد ثلاثية التوائم وتضمينها وتقسيمها بالتبريد.
تخضع الأقسام لعدة علاجات تحضيرية ، بما في ذلك الخطوة الرئيسية المتمثلة في تسخينها في مخزن مؤقت لسترات الصوديوم. أخيرا ، يتم إجراء التهجين الفلوري في الموقع باستخدام أردية فلورية خاصة بالهربس. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج وضع الجينوم الفيروسي داخل نواة الخلايا العصبية المصابة بشكل فردي من خلال استخدام الفحص المجهري متحد البؤر.
في كثير من الحالات ، تتطلب دراسة دورة حياة مختلفة استخدام نماذج حيوانية. الفائدة الرئيسية لهذه التقنية التي تمثل هنا هي أنها توفر بيانات على مستوى الخلية الواحدة باستخدام نهج الطلاقة في المعهد. يعيد النموذج القاتل الملكي لعدوى HS إنتاج معظم جوانب التاريخ الطبيعي لعدوى فيروس الهربس البسيط في البشر.
هذا هو المضيف الطبيعي للفيروس. يتم إجراء العدوى الأولية في أنسجة الفم ، ثم يتطور الفيروس من الشفاه إلى العقدتين. هذا هو الجانب الرئيسي من زمن انتقال HS V في البشر الجمع بين اثنين من المناعة والتلوين.
يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بزمن انتقال فيروس الهربس ، مثل كيفية تفاعل الفيروس مع المكونات النووية ، وكيف ستؤثر هذه التفاعلات على الحفاظ على زمن الوصول وإعادة تنشيط الفيروس في النهاية. للبدء ، احصل على فأر مخدر ومحلول مخزون فيروس HSV واحد. معلق في وسط خال من الفينول الأحمر.
باستخدام منظار مجهر ، أدخل الإبرة في الطبقة تحت الظهارية للشفة العليا اليسرى عند الحدود المخاطية الجلدية. حقن 0.5 ميكرولتر من محلول الفيروس على مدى خمس ثوان ، ثم قم بعمل حقنة ثانية من الفيروس في نفس الموقع. انقل الماوس إلى حاضنة 37 درجة مئوية أو وسادة تسخين حتى يستيقظ.
ثم ضعه في قفص منزله لوقت الاسترداد المطلوب قبل إصلاحه وفقا لبروتوكول النص. قطع على كل جانب من الفك السفلي. ثم اقطع طرف الأنف خلف القواطع مباشرة للكشف عن تجويف الأنف.
نقطع الحنك إلى نصفين بالمقص ، ثم نضعه على الجانب. العقد ثلاثية التوائم تحت الحنك. إنها كتل مستطيلة بيضاء ، طولها من ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات ومتصلة بالعصب ثلاثي التوائم.
قطع الفروع العصبية ثلاثية التوائم على كل جانب من العقد لتحريرها من جذع الدماغ. باستخدام كماشة جراحية ، قم بإزالة العقد ونقلها إلى 20٪ من السكروز في PBS للسماح لها بالحضانة لمدة 24 ساعة. في درجة حرارة الغرفة في اليوم التالي ، قم بتضمين كلتا العقدين ثلاثي التوائم في كتلة واحدة من التقطيع بالتبريد.
قمبتضمين الوسط ، وقم بتجميد الكتلة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى يتم تقسيمها على ناظم البرد. قم بتقطيع العقد ثلاثية التوائم بالطول إلى أقسام 10 ميكرون وجمعها على شرائح فائقة الصقيع دافئة إلى 30 درجة مئوية. يمكن أن تتناسب أربعة إلى خمسة أقسام مع شريحة واحدة.
يمكن أن يكون إعطاء الشريحة تسميات سلاسل متعددة مفيدا. إذا تم التخطيط لعدة تطبيقات نهائية ، اترك الشرائح تجف لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بالنسبة لهذا البروتوكول ، يتم تحضير المسبار عن طريق وضع العلامات على الكون الذي يحتوي على 30 جزءا من جينوم HSV واحد مع SI 3D CTP عن طريق ترجمة NIC.
يتم ترسيبه وتعليقه في شكل أميد منزوع الأيونات ويجب أن يظهر باللون الوردي بسبب دمج S SI الثالث في اليوم الأول. ضع الشرائح على حامل الشرائح في درجة حرارة الغرفة واترك الأقسام تجف لمدة 10 دقائق. ثم أعد ترطيب الأقسام في XPBS واحد لمدة 10 دقائق.
بعد ذلك ، قم بتجشير الأنسجة في 0.5٪ Triton X 100 في XPBS واحد لمدة 20 دقيقة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة باستخدام XSS واحتفظ بها في قسمين من XSSC حتى يتم تسخين المخزن المؤقت لكشف القناع. لكشف القناع ، قم بتسخين مخزن السترات في الميكروويف حتى يغلي المخزن المؤقت.
يتم ذلك عن طريق ملء صينية منزلقة زجاجية ب 200 مل من المخزن المؤقت. ضع الصينية في وعاء أكبر مملوء ب 500 مل من الماء المقطر وقم بتسخين المخزن المؤقت حتى الغليان. ثم انقل الشرائح إلى الدرج.
تحقق من تغطيتها بالكامل بمخزن مؤقت في الميكروويف. سخني الشرائح في المخزن المؤقت لمدة 20 ثانية تقريبا حتى يصل المخزن المؤقت إلى درجة الغليان. لا تدع المخزن المؤقت يغلي.
ثم قم بتبريد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين وكرر دورة التسخين ست مرات أخرى. من الأهمية بمكان تحديد عدد ومدة دورات الأكل تجريبيا لقابلية تكرار خطوة الكشف عن القناع. فرن الميكروويف ، الصينية ، الحاوية ، حجم المخزن المؤقت في الصينية.
يجب أن يظل حجم الماء في الحاوية متطابقا عند الانتهاء من التسخين. انقل الشرائح إلى اثنين من XSSC لمدة خمس دقائق تحت غطاء الدخان ، واحتضن الشرائح في محلول من ثلاثة إلى واحد إلى أربعة من الميثانول وحمض الأسيتيك و PBS لمدة 15 دقيقة. ثم احتضن الشرائح في مزيج من الميثانول إلى حمض الأسيتيك الطازج لمدة 15 دقيقة.
الآن قم بتجفيف الأقسام من خلال حضانات متتالية لمدة 10 دقائق في 70٪ من الإيثانول ، تليها حضانان لمدة 10 دقائق في الإيثانول النقي. اترك الشرائح تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتحضيرها للمسبار. ضع 80 ميكرولترا من محلول الفحص على الأقسام المجففة بالتنقيط وقم بتغطيتها بقلة غطاء.
تأكد من أن محلول الفحص ينتشر على كامل سطح زلة الغطاء وعدم وجود فقاعات. ثم أغلق زلة الغطاء بالأسمنت المطاطي واتركها تجف. استمر في التمسخ عن طريق احتضان الشرائح عند 80 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
ثم انقل الشرائح بسرعة إلى صينية معدنية على الثلج لمدة خمس دقائق. اتبع ذلك مع تهجين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في اليوم التالي. قم بإزالة الأسمنت المطاطي بالملقط مع الشرائح على كتلة حرارية 37 درجة مئوية.
قم بإزالة زلة الغطاء برفق بطرف شفرة مشرط. بعد ذلك ، اغسل الأقسام بشكل متكرر باستخدام SSC. الآن ، قم بتلطيخ العينات لمدة 10 دقائق بالصبغة المناسبة مثل DAPI أو الخطافات 3 3 3 4 2 بمعدل 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر في XPBS واحد.
ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام XPBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة. بعد الغسيل الثالث ، قم بتصريف أكبر قدر ممكن من السوائل من الشريحة. ثم في نهاية كل شريحة ، ضع 80 ميكرولترا من وسط التركيب باستخدام عامل مضاد للبهتان.
قم بتغطية الوسيط ببطء بقلة غطاء عالية الجودة ، وتجنب تكوين الفقاعات. ثم أغلق الشريحة بطلاء الأظافر واحفظها في الظلام عند أربع درجات مئوية. عند تطوير هذا البروتوكول ، تم اختبار العديد من مخازن الملح لكشف القناع.
بينما تميل المخازن المؤقتة EDTA إلى إتلاف الأنسجة. كانت سترات الصوديوم ثلاثية ، حمض الهيدروكلوريك والماء المقطر مناسبة لاكتشاف فيروس الهربس البسيط للتحقق من أن البروتوكول سيعمل مع المجسات التجارية. تم إجراء الكشف عن الجينوم الكامن لواحد HSV باستخدام مسبار بيوتينيل واحد من PAN HSV تم الحصول عليه من Enzo Biochem ، ويمكن اكتشاف كل من أنماط البقع المفردة والمتعددة لجينوم واحد لفيروس الهربس البسيط.
علاوة على ذلك ، تم اختبار بروتوكول أسماك الحمض النووي على الفئران والأرانب المصابة بثلاث سلالات شائعة الاستخدام لفيروس الهربس البسيط البسيط. في جميع الحالات ، أظهر جينوم HSV واحد إشارة متقطعة مع سطوع وشدة متغيرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار قابلية تطبيق البروتوكول في الدورة التكاثرية لفيروس الهربس البسيط عن طريق إجراء أسماك الحمض النووي على أنسجة الفئران التي تخضع لعدوى الهربس العامة.
في هذه ، تم اكتشاف مجاميع كبيرة ومشرقة من جينومات فيروس الهربس البسيط في أنسجة مختلفة ، بما في ذلك عيون DRG والدماغ. بروتوكول أسماك الحمض النووي متعدد الاستخدامات. يسمح بالكشف المشترك عن فيروس الهربس البسيط والجينوم الواحد والحمض النووي الريبي والبروتينات الفيروسية أو الخلوية.
على سبيل المثال ، يعد الكشف المشترك عن جينوم واحد لفيروس الهربس البسيط مع HSV واحد من الحمض النووي الريبي أمرا ممكنا ، حيث تم الكشف المشترك عن جينوم واحد لفيروس الهربس البسيط مع البروتينات الخلوية مثل بروتين Centro MERIC CE NPA A تم استخدامه في الكشف المشترك عن فيروس الهربس البسيط مع الأجسام النووية الكروماتين و PML. تم تصور البروتين المرتبط A TRX بصبغة ثلاثية تظهر HSV 1D NA باللون الأحمر. منتج الحمض النووي الريبي الخاص بها باللون الأزرق و TRX باللون الأخضر.
بمجرد إعداد الكشف عن القناع ، يكون إجراء أسماك الحمض النووي قويا للغاية. يمكن القيام بذلك في أقل من 24 ساعة على دفعات من 20 شريحة أو أكثر. سيمكن تطوير هذه التقنية الباحثين الذين يحققون في فيروسات الهربس والفيروسات الثابتة الأخرى من استكشاف مستوى الخلية الواحدة ، كيف يمكن للمكونات الخلوية والهندسة النووية أن تؤثر على بيولوجيا هذه الفيروسات.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يقدم هذا المقال بروتوكولًا للتهجين الموضعي الملون المصمّم لكشف جينوم فيروس الهربس البسيط من النوع الأول في مقاطع العقد ثلاثية التوائم من الفئران المصابة بشكل كامن. تتيح هذه الطريقة تصور جينوم الفيروس ومنتجاته من الحمض النووي الريبي داخل الخلايا العصبية الفردية، مما يوفر رؤى حول عملية العدوى.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الفيروسات
- بيولوجيا الخلية
الخلفية
- يمكن لفيروس الهربس البسيط من النوع الأول أن يؤسس طور الكمون في العقد ثلاثية التوائم.
- فهم وضع جينوم الفيروس أمر بالغ الأهمية لدراسة آليات العدوى الخاصة به.
- يعد التهجين الموضعي الملون أداة قوية لتصور الأحماض النووية في مقاطع الأنسجة.
- تسمح الميكروسكوبية المجسمة بالتصور المفصل للخلايا الفردية.
هدف الدراسة
- تطوير بروتوكول لكشف جينوم فيروس الهربس البسيط في مقاطع الأنسجة.
- تصور جينوم الفيروس ومنتجاته من الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية المصابة.
- تعزيز فهم عملية العدوى على المستوى الخلوي.
الطرق المستخدمة
- حقن الفيروس في شفاه الحيوان.
- فترة حضانة لمدة 28 يومًا لتأسيس الفيروس في العقد ثلاثية التوائم.
- حصاد وتثبيت وتقطيع الأنسجة المبرد لعقد ثلاثية التوائم.
- التهجين الموضعي الملون باستخدام مجسات فلورية خاصة بالهربس.
النتائج الرئيسية
- الكشف الناجح عن جينوم فيروس الهربس البسيط في مقاطع الأنسجة.
- تصور وضع جينوم الفيروس داخل نواة الخلايا العصبية المصابة.
- إظهار فعالية الطريقة من خلال الميكروسكوبية المجسمة.
- رؤى حول عملية العدوى على مستوى الخلية الواحدة.
الاستنتاجات
- البروتوكول المطور فعال لدراسة كمون فيروس الهربس البسيط.
- يوفر التهجين الموضعي الملون معلومات قيّمة حول ديناميات العدوى الفيروسية.
- يمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسات فيروسية أخرى في علم الأعصاب.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method enables single-cell detection of persistent viral genomes in neuronal tissues, addressing a critical gap in virology research where low-copy viral reservoirs are difficult to visualize. By combining DNA-FISH with RNA-FISH and immunostaining, it provides mechanistic insights into virus-host interactions that inform target validation and antiviral screening strategies. The approach supports preclinical de-risking by clarifying viral latency mechanisms in relevant animal models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral genome positioning relative to nuclear components to assess mechanisms of latency maintenance.
- Scientific Value: Supports functional validation of viral and host targets by co-detecting genomes, transcripts, and proteins in individual neurons.
- Scientific Value: Facilitates hypothesis testing about viral reactivation triggers through spatial correlation of viral and cellular signals.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Produces low-background, high-resolution signals compatible with confocal and wide-field microscopy for reliable readouts.
- Operational Value: Works with both custom and commercially available probes, enabling assay flexibility and reagent standardization.
- Operational Value: Accommodates a wide range of antibodies, supporting multiplexed screening of viral and cellular markers.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Uses a clinically relevant HSV-1 latency model in mice that mirrors human neuronal infection patterns.
- Translational Value: Enables longitudinal assessment of viral reservoir dynamics in tissues, informing predictive confidence in reactivation risk.
- Translational Value: Supports biomarker discovery by linking viral genome localization to cellular regulatory proteins.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, particularly for neurotropic viruses where tissue-specific reservoir analysis is essential.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by revealing how viral genomes interact with nuclear architecture during latency.
- Screening: Generates quantitative spatial data on viral genome copies per cell, enabling compound effect assessment in infection models.
- Analytics: Delivers multiplexed readouts (DNA, RNA, protein) that allow correlation of viral gene expression with host responses.
- Translational Research: Connects findings in rodent ganglia to human-relevant neuropathogenesis, supporting cross-species extrapolation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other persistent DNA viruses and tissue types, promoting platform reuse across virology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in viral persistence studies through direct visualization of viral nucleic acids.
- Operational Value: Enables reproducible tissue processing with heat-based unmasking that works across antibody and probe types.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying reservoir biology that influences reactivation-driven pathogenesis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral candidates based on latency-relevant mechanism data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, tissue sectioning, and nucleic acid hybridization techniques.
- Dependent on access to cryostat, hybridization oven, and confocal or wide-field fluorescence imaging systems.
- Necessitates standardization of unmasking cycles and probe concentration across labs for consistent signal-to-noise ratios.
- Adaptation to new tissue types may require optimization of permeabilization and antigen retrieval steps.
- Protocol duration of 2.5 days necessitates batch processing planning for high-throughput applications.
