الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

الهدف العام من هذا الإجراء هو الكشف عن جينوم فيروس الهربس البسيط، النوع الأول في مقاطع من العقد الثلاثية التوائم من الفئران المصابة بالعدوى الكامنة عن طريق التهجين الموضعي المتألق. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح الفيروس في شفة الحيوان، تليها فترة حضانة مدتها 28 يوماً يستقر خلالها الفيروس في العقد الثلاثية التوائم. بعد ذلك، يتم استئصال العقد الثلاثية التوائم، وتضمينها، وتقطيعها بالتجميد.

تخضع المقاطع لعدة معالجات تحضيرية، بما في ذلك الخطوة الرئيسية المتمثلة في تسخينها في محلول منظم من سترات الصوديوم. وأخيرًا، يتم إجراء التهجين الموضعي المتألق باستخدام مسابير فلورية متخصصة لفيروس الهربس. وفي النهاية، يمكن للنتائج أن تظهر موضع الجينوم الفيروسي داخل نواة العصبونات المصابة بشكل فردي من خلال استخدام المجهر البؤري.

في كثير من الحالات، تتطلب دراسة دورات حياة متنوعة استخدام نماذج حيوانية. وتتمثل الفائدة الرئيسية للتقنية المعروضة هنا في أنها توفر بيانات على مستوى الخلية الواحدة باستخدام نهج تسييل مؤسسي. ويعيد نموذج القاتل الملكي لعدوى HS إنتاج معظم جوانب التاريخ الطبيعي لعدوى HSV one في البشر.

هذا هو العائل الطبيعي للفيروس. تحدث العدوى الأولية في الأنسجة الفموية، ثم ينتقل الفيروس من الشفاه إلى العقدة العصبية الثلاثية التوائم. هذا هو الموقع الرئيسي لكمون HSV في البشر، وذلك بالجمع بين الكيمياء النسيجية المناعية والتلوين.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية تتعلق بكمون فيروس الهربس، مثل كيفية تفاعل الفيروس مع المكونات النووية، وكيفية تأثير هذه التفاعلات على الحفاظ على حالة الكمون ومن ثم إعادة تنشيط الفيروس. للبدء، يجب توفير فأر مخدّر ومحلول مخزون من فيروس HSV one، معيد التعليق في وسط خالٍ من الفينول الأحمر.

باستخدام مجهر ستيريوسكوبي ثنائي العينين، أدخل الإبرة في الطبقة تحت الظهارية للشفة العليا اليسرى عند الحدود المخاطية الجلدية. احقن 0.5 µL من محلول الفيروس على مدار خمس ثوانٍ، ثم قم بعمل حقنة ثانية من الفيروس في الموقع نفسه. انقل الفأر إلى حضانة بدرجة حرارة 37 °C أو على وسادة تدفئة حتى يستيقظ.

بعد ذلك، ضع الحيوان في قفصه المخصص لفترة التعافي المطلوبة قبل إجراء التثبيت بالتنقيط (perfu fixing) وفقاً للبروتوكول المذكور. قم بالقص على كل جانب من الفك السفلي، ثم قص طرف الأنف خلف القواطع مباشرة للكشف عن تجويف الأنف.

اقطع الحنك إلى نصفين باستخدام المقص، ثم ضعه جانباً. تقع العقد الثلاثية التوائم أسفل الحنك، وهي عبارة عن كتل بيضاء مستطيلة الشكل، يتراوح طولها بين 2 إلى 3 mm وتكون متصلة بالعصب ثلاثي التوائم.

اقطع فروع العصب ثلاثي التوائم على كل جانب من العقد العصبية لتحريرها من جذع الدماغ. وباستخدام ملاقط جراحية، قم بإزالة العقد العصبية ونقلها إلى محلول 20%Sucrose في PBS واتركها لتحضن لمدة 24 ساعة. وفي اليوم التالي وفي درجة حرارة الغرفة، قم بطمر كل من العقدتين ثلاثيتي التوائم في قالب واحد للتقطيع بالتجميد.

وسط التضمين، يتم تجميد الكتلة عند درجة حرارة -80 °C حتى يتم تقطيعها باستخدام الميكروتوم المجمد (cryostat). تُقطع العقد الثلاثية التوائم طولياً إلى مقاطع بسمك 10 micron وتُجمع على شرائح super frost مسخنة إلى 30 °C. يمكن وضع أربعة إلى خمسة مقاطع على الشريحة الواحدة.

يمكن أن يكون وضع تسميات لسلاسل متعددة على الشريحة أمراً مفيداً. إذا كانت هناك عدة تطبيقات لاحقة مخططة، اترك المقاطع لتجف لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق قبل تخزينها في درجة حرارة 80- درجة مئوية. في هذا البروتوكول، يتم تحضير المسبار عن طريق وسم cosmids تحتوي على أجزاء بطول 30 kilobase من جينوم HSV1 باستخدام SI 3D CTP عبر عملية NIC translation.

يتم ترسيبه وتعليقه في شكل فورماميد منزوع الأيونات ويجب أن يظهر باللون الوردي بسبب دمج S SI three في اليوم الأول. ضع الشرائح على حامل شرائح في درجة حرارة الغرفة واترك المقاطع تجف لمدة 10 دقائق. بعد ذلك، أعد ترطيب المقاطع في 1xPBS لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، قم بنفاذ الأنسجة في 0.5%Triton X 100 في one XPBS لمدة 20 دقيقة. ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل غسلة باستخدام two XSS واحفظها في two XSSC حتى يتم تسخين محلول إزالة القناع. ولإزالة القناع، قم بتسخين محلول citrate المنظم مسبقاً في الميكروويف حتى يصل المحلول إلى درجة الغليان.

يتم ذلك بملء صينية شرائح زجاجية بـ 200 milliliters من المحلول المنظم. توضع الصينية في وعاء أكبر مملوء بـ 500 milliliters من الماء المقطر ويُسخن المحلول المنظم مسبقاً حتى الغليان. بعد ذلك، تُنقل الشرائح إلى الصينية.

تحقق من أن الشرائح مغطاة بالكامل بالمحلول المنظم داخل الميكروويف. قم بتسخين الشرائح في المحلول المنظم لمدة 20 ثانية تقريباً حتى يصل المحلول المنظم إلى درجة الغليان. احذر من ترك المحلول المنظم يغلي ويفيض خارج الوعاء.

بعد ذلك، يتم تبريد الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين وتكرار دورة التسخين ست مرات أخرى. من الضروري تحديد عدد ومدد دورات التسخين تجريبياً لضمان إمكانية تكرار خطوة إزالة القناع. فرن الميكروويف، والصينية، والوعاء، وحجم المنظم في الصينية.

يجب الحفاظ على حجم الماء في الوعاء متماثلاً عند انتهاء التسخين. انقل الشرائح إلى محلول XSSC ثانٍ لمدة خمس دقائق تحت خزانة استخلاص الأبخرة، ثم حضن الشرائح في محلول يتكون من الميثانول وحمض الأسيتيك وPBS بنسبة 3:1:4 لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، حضن الشرائح في خليط مُحضّر حديثاً من الميثانول وحمض الأسيتيك بنسبة 3:1 لمدة 15 دقيقة.

الآن، قم بإزالة الماء من المقاطع عبر تحضين متتابع لمدة 10 دقائق في ethanol بتركيز 70%، يليه تحضينان لمدة 10 دقائق في ethanol نقي. اترك الشرائح لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتجهيزها للمسبار. ضع 80 µL من محلول المسبار على المقاطع المجففة قطرة بقطرة، ثم غطِّها بغطاء شريحة.

تحقق من انتشار محلول السبر فوق السطح الكامل لغطاء الشريحة وعدم وجود فقاعات. ثم قم بإغلاق غطاء الشريحة باستخدام غراء المطاط واتركه ليجف. باشر بعملية المسخ عن طريق تحضين الشرائح عند 80 °C لمدة خمس دقائق.

بعد ذلك، انقل الشرائح بسرعة إلى صينية معدنية موضوعة على الثلج لمدة خمس دقائق. يتبع ذلك إجراء عملية تهجين ليلة كاملة عند درجة حرارة 37 °C في اليوم التالي. ثم قم بإزالة الغراء المطاطي باستخدام الملاقط بينما تكون الشرائح موضوعة على كتلة تسخين عند درجة حرارة 37 °C.

أزل غطاء الشريحة برفق باستخدام طرف شفرة المشرط. بعد ذلك، اغسل القطاعات بشكل متكرر بمحلول SSC. الآن، صبغ العينات لمدة 10 دقائق باستخدام الصبغة المناسبة مثل DAPI أو hooks 3 3 3 4 2 بتركيز 0.5 micrograms per milliliter في محلول one XPBS.

ثم اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام XPBS لمدة 10 دقائق لكل غسلة. وبعد الغسلة الثالثة، قم بتصريف أكبر قدر ممكن من السائل من الشريحة. ثم عند طرف كل شريحة، ضع 80 microliters من وسط التثبيت الذي يحتوي على عامل مضاد للتلاشي.

غَطِّ الوسط ببطء باستخدام غطاء شريحة عالي الجودة البصرية، مع تجنب تكون الفقاعات. بعد ذلك، أحكم إغلاق الشريحة باستخدام طلاء الأظافر واحفظها في الظلام عند درجة حرارة 4 °C. وأثناء تطوير هذا البروتوكول، تم اختبار عدة محاليل منظمة ملحية لعملية إزالة القناع.

بينما كانت محاليل EDTA المنظمة تميل إلى إتلاف النسيج، تبين أن سترات الصوديوم وتريس وHCl والماء المقطر كانت مناسبة للكشف عن HSV one للتحقق من فاعلية البروتوكول مع المسابر التجارية. تم إجراء الكشف عن الجينوم الكامن لـ HSV one باستخدام مسبار PAN HSV one مبيوتني (biotinylated) تم الحصول عليه من Enzo Biochem، حيث أمكن الكشف عن أنماط بقع مفردة ومتعددة لجينوم HSV one.

علاوة على ذلك، تم اختبار بروتوكول تهجين الحمض النووي المفلور (DNA fish) على فئران وأرانب مصابة بثلاث سلالات شائعة الاستخدام من فيروس HSV one. وفي جميع الحالات، أظهرت جينومات HSV one إشارة منقطة ذات سطوع وكثافة متفاوتة. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار مدى قابلية تطبيق البروتوكول في الدورة التضاعفية لفيروس HSV one عن طريق إجراء تهجين DNA fish على أنسجة من فئران تعاني من عدوى هرپس عامة.

في هذه الحيوانات، تم اكتشاف تجمعات كبيرة وساطعة من جينومات HSV one في أنسجة مختلفة، بما في ذلك العقد الجذرية الظهرية (DRG) والعينين والدماغ. ويتميز بروتوكول DNA fish بمرونة عالية، حيث يسمح بالكشف المشترك عن جينوم HSV one وبالتزامن مع الحمض النووي الريبوزي (RNAs) الفيروسي أو الخلوي والبروتينات.

على سبيل المثال، يمكن الكشف المشترك عن جينوم HSV one بالتزامن مع RNA lat الخاص بـ HSV one. كما استُخدم الكشف المشترك عن جينوم HSV one مع البروتينات الخلوية مثل بروتين Centro MERIC CE NPA A، وكذلك الكشف المشترك عن HSV one مع الكروماتين والأجسام النووية PML. وقد تم تصوير البروتين المرتبط A TRX باستخدام صبغة ثلاثية أظهرت HSV 1D NA باللون الأحمر، وناتجه من RNA وهو lat باللون الأزرق، و A TRX باللون الأخضر.

بمجرد إعداد عملية إزالة القناع، يصبح إجراء الـ DNA fish قويًا للغاية. حيث يمكن تنفيذه في أقل من 24 ساعة في مجموعات تضم 20 شريحة أو أكثر. سيتيح تطوير هذه التقنية للباحثين الذين يدرسون فيروسات الهربس والفيروسات المستمرة الأخرى استكشاف كيفية تأثير المكونات الخلوية والبنية النووية على بيولوجيا هذه الفيروسات على مستوى الخلية الواحدة.