تحديد التعديلات بعد متعدية من النباتات بروتين المجمعات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تعديلات ما بعد الترجمة للبروتينات المشاركة في المعقدات البروتينية النباتية، والتي تم التعبير عنها أولاً بشكل عابر أو مستقر في النباتات باستخدام وسوم لبروتين الدراسة. بعد ذلك، يتم استخلاص البروتينات الكلية من أنسجة النبات، ثم إجراء ترسيب مناعي لبروتين الدراسة. تلي ذلك خطوة فصل البروتينات المترسبة مناعياً على هلام أكريلاميد، ثم استخلاص وهضم البروتينات من نطاق الهلام المطلوب.

قم الآن بتقديم عينات البروتين لتحليل طيف الكتلة. في نهاية المطاف، يمكن لنتائج تحليل طيف الكتلة الكشف عن التغيرات الديناميكية في تعديلات ما بعد الترجمة مثل الفسفرة. وبخلاف الطرق البديلة مثل الحضانة المختبرية للكيناز مع الركيزة، فإن هذه الطريقة تعبر عن البروتينات في planter.

وبذلك، لا يتعين عليك معرفة الكيناز المسؤول عن عملية الفسفرة. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال بيولوجيا النبات، مثل كيفية نقل الإشارات استجابةً للإجهاد، أو التغيرات البيئية، أو التعرف على المسببات المرضية. وبالإضافة إلى تحديد مواقع الفسفرة في مجمعات بروتينات المقاومة المنشطة، يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع على أي تعديل ما بعد الترجمة لأي مجمع بروتيني نباتي.

بشكل عام، سيواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأنهم غير معتادين على التعامل مع كميات كبيرة من المستخلص وتنفيذ المزيد من خطوات البروتوكول في يوم واحد. بالنسبة للتعبير العابر، يتم تنمية سلالات agrobacterium tohin حتى تصل إلى طور الثبات. ثم تُجمع بكتيريا agro عن طريق الطرد المركزي عند 3000 Gs لمدة خمس دقائق.

أعد تعليق الكريات في محلول التغلغل المنظم. الآن، قم بتغلغل بكتيريا agro bacteria في نباتات NCOA hamana بعمر أربعة أسابيع يدويًا باستخدام حقنة سعة 1 mL بدون إبرة، أو عن طريق التفريغ مع استخدام مادة خافضة للتوتر السطحي بتركيز 0.02%، وذلك بعد يومين إلى خمسة أيام من عملية التغلغل.

احصد الأوراق التي تم إيصال المادة إليها، وجمدها في النيتروجين السائل ثم خزنها عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. بعد ذلك، اطحن 20 grams من أنسجة النبات والنيتروجين السائل باستخدام الهاون والمدقة، وأضف 80 milliliters من المنظم C البارد إلى الـ 20 grams. اخلط جيداً وأذب المزيج على الثلج.

قم الآن بالتجانس باستخدام ثلاث نبضات مدة كل منها 10 ثوانٍ بالسرعة القصوى. قم بترشيح ناتج التجانس ثم استدِره بجهاز الطرد المركزي عند 30,000 Gs لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية. وفي هذه الأثناء، أضف 500 ميكرولتر من محلول الحجب المنظم D البارد إلى 100 ميكرولتر من مصفوفة تقارب مناسبة لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية، ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام 1 ملليلتر من المحلول المنظم D البارد. بعد ذلك، قم بإزالة السائل العلوي لمستخلص الأوراق وتمريره عبر حقنة بمرشح 0.45 ميكرومتر.

قم بالترشيح في أنبوب جديد على الثلج. قم بتقسيم المستخلص الخام إلى حصص متساوية لاستخدامه في تحليل البصمة المناعية.

أضف خمسة من محلول تحميل الصفحة XSDS واستخدم جهاز المرج (vortex) ثم قم بغلي العينات لإتمام عملية المسخ. أضف 50 µL من مصفوفة الألفة، المعلقة في المحلول المنظم D، إلى كل أنبوب. يتم التحضين مع تدوير لطيف لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C، ثم يتم إجراء الطرد المركزي لترسيب مصفوفة الألفة.

بعد ذلك، خذ جزءاً من المستخلص غير المرتبط لإجراء تحليل لطخة مناعية (immuno blot). تخلص من بقية السائل، مع ترك حوالي 500 µL في قاع الأنبوب. ثم أعد تعليق المحلول الروبوي باستخدام رأس ماصة واسع الفتحة.

اجمع محلول الملاط المختلط من كلا الأنبوبين في أنبوب واحد سعة 1.5 milliliter. قم بإجراء عملية طرد مركزي نبضية ثلاث مرات لمدة خمس ثوانٍ باستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي لترسيب مصفوفة الألفة، ثم تخلص من السائل الطافي بعد إجراء من ثلاث إلى خمس غسلات باستخدام 1 milliliter من المنظم D البارد. قم بإزالة الفائض من المنظم D باستخدام إبرة حقنة، ثم قم بعملية الاستخلاص باستخدام 200 microliters من منظم الاستخلاص المناسب مع الرج المستمر. اجمع الثلاثة EITs في أنبوب واحد.

بعد ذلك، قم بتركيز البروتينات باستخدام 30 µL من راتنج الامتصاص مع الرج باستخدام جهاز الفورتيكس. اترك المزيج لمدة خمس دقائق لترسيب الراتنج، ثم تخلص من الطافي. أضف 50 µL من منظم تحميل SDS-PAGE بتركيز 1X إلى مصفوفة الألفة المترسبة أو راتنج الامتصاص المرجج، ثم قم بالغلي لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة تتراوح بين 80 و100 °C في جهاز تسخين (heat block) بجهاز الطرد المركزي.

يتم غلي مصفوفة الألفة الراتنجية لمدة دقيقتين عند 10,000. يتم سحب عينة قدرها 5 µL من السائل الطافي من أجل الحجب المناعي، ثم يتم تشغيلها مع الكسور الأخرى على هلام SDS-PAGE بطول 10 cm للفصل وتحديد البروتينات المفسفرة عن طريق مطيافية الكتلة.

قم بتحميل الـ 45 µL المتبقية على هلام SDS page للتلوين. ثم قم بتلوين هلام SDS page باستخدام colloidal kamasi brilliance blue. بعد ذلك، قم بإزالة اللون من الهلام عن طريق الغسل الوفير بالماء، ويفضل أن يتم ذلك طوال الليل.

الآن باستخدام مشرط نظيف، استأصل الحزمة المطلوبة من الهلام، ثم قطع شريحة الهلام إلى مكعبات يتراوح حجمها بين 2 إلى 4 مليمتر وانقل العينة إلى أنبوب. اغسل قطع الهلام بـ 50% acetonitrile و 50 millimolar من بيكربونات الأمونيوم حتى يزول اللون. بعد ذلك، قم بسحب المحلول باستخدام الماصة.

مع الحرص على عدم إزالة قطع الهلام. يتم تجفيف العينة باستخدام 100%aceto nitrile لمدة خمس دقائق، ثم يُزال السائل الحر. بعد ذلك، لتقليل روابط ثنائي كبريتيد البروتين، يُضاف 10 millimolar DTT ويُحضن لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة عند 56 درجة Celsius مع الرج، ثم يُزال السائل الحر من أجل ألكلة بقايا السيستين.

أضف 55 millimolar من chloro Acetamide لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. تخلص من السائل الحر، ثم اغسل قطع الهلام مرتين باستخدام 50%Aceto nitrile لمدة 10 دقائق. تخلص من السائل الحر.

قم الآن بتجفيف قطع الهلام باستخدام 100%aceto nitrile لمدة خمس دقائق، وأزل السائل الحر من أجل Triptych Digest. وبإضافة 40 µL من محلول التريبسين العامل، اترك قطع الهلام لترتوي لمدة 10 دقائق في كمية كافية من محلول الهضم المنظم لتغطية قطع الهلام. قم بالتحضين عند 37 °C طوال الليل، ولإيقاف عملية الهضم واستخلاص الببتيدات من قطع الهلام استخدم 5%formic acid مع المعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 دقائق.

ثم يتم نقل الطافي إلى أنبوب جديد، وتجفيف الببتيدات عن طريق التجفيد أو باستخدام مكثف تفريغي، وتُخزن العينات عند درجة حرارة -20 °C. تعمل هذه التجربة على تنقية معقد P-R-F-P-T-O kinase من nacoa hamana؛ حيث تم تحويل NACOA hamana المعدلة وراثياً والتي تعبر عن 35 SPTO بشكل عابر باستخدام 35 SPRF flag، وتم ترسيب المعقد مناعياً باستخدام Anti-Flag M two aros. وتوضح لطخات المناعة الترسيب المناعي الفعال لبروتين PRF المستهدف، كما تم تنقية كل من PTO والبروتين المؤثر المتفاعل بشكل مشترك مع PRF، كما هو موضح من خلال الكشف بالأجسام المضادة وتحليل قياس الطيف الكتلي.

هنا، كانت الاستراتيجية تهدف إلى استهداف بروتين PTO باستخدام Anti-Flag. وقد تم تغيير الاستراتيجية من أجل تحديد مواقع فسفرة بروتين PTO.

تم ترسيب الكمية الإجمالية لبروتين PTO، والتي تشمل كلاً من معقد PRF والشكل الحر، مناعياً باستخدام أجسام مضادة من نوع Anti-Flag M two، ثم أُخضعت لعملية تجزيء باستخدام SDS page، وهضم تريبتيكي داخل الهلام، وتحليل مطيافية الكتلة، مما أدى إلى الحصول على ببتيدات PTO تغطي ما يقرب من 80% من تسلسله. ومن المثير للاهتمام تحديد مجموعة من مواقع الفسفرة المفردة لببتيدات PTO. يلاحظ أن مواقع الفسفرة المزدوجة تم تحديدها فقط في وجود أي من البروتينات المؤثرة.

من المهم الحصول على كميات كافية من البروتين النباتي من أجل تحديد مكونات المعقد البروتيني وأيضاً الكشف عن التعديلات ما بعد الترجمة للبروتين المستهدف. تذكر أن رسم خرائط التعديلات مثل phosphorylation يتطلب كمية معقولة من البروتين لتحليلها بواسطة mass spectrometry، لذا يجب أن تظهر حزمة باهتة على الأقل في الهلام (gel) بعد اتباع هذا الإجراء. يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل تحديد مكونات المعقد، للإجابة على أسئلة إضافية مثل كيفيةما يؤدي تنشيط المعقد المناعي إلى مناعة وظيفية.

لا تنسَ أن العمل مع المحاليل المنظمة العضوية، والبكتيريا، وشفرات BBL يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا اتخذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر.