Name: دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: استكشف طريقة كمية لدراسة هجرة الخلايا في بيئة محصورة أحادية البعد باستخدام قنوات مصنعة بتقنية التصغير الدقيق. تتيح هذه التقنية فحص ديناميكيات الهجرة الخلوية وسرعتها في ظروف مراقبة بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

المؤلفين نعترف كثيرا من منصة PICT IBiSA في معهد كوري (CNRS UMR144). وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من: مجلس البحوث الأوروبي AM.LD (Strapacemi 243103)، والرابطة الوطنية لأجل الديمقراطية بحوث (ANR-09-0027-بيري-PCVI)، ومؤسسة InnaBiosanté (Micemico) الى النائب وAM. LD وERC Strapacemi منحة المحقق الشباب لAM.LD.

ملاحظة هامة: يفترض هذا البروتوكول الذي القالب الذي يحتوي على شكل لو microchannels المطلوب أحرز بالفعل. مزيد من المعلومات حول إعداد القالب تم نشره بالفعل 10. يفترض هذا البروتوكول أيضا أن الثقافة البلدان النامية نخاع العظم هو معروف. 1. رقاقة تلفيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج النفط PDMS وكيل علاج في نسبة الوزن 10:01 في كوب من البلاستيك. خلط كل من المركبات بدقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي المزيج فوق و microchannels تحمل العفن. يجب أن يكون الارتفاع الكلي بين 0.5-1 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة فقاعات الهواء في جرس جرة الفراغ خلال 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PDMS تتصلب في القالب عن طريق وضع هذا الأخير في الفرن لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في PDMS هو في درجة حرارة الغرفة، وقطع قطعة كبيرة حول هيكل بشفرة الجراحية وقشر تشغيله من القالب (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفر ثقوب حيث سيتم حقن الخلايا (عادة 2 ملم) وتغيير حجم PDMSمع شفرة جراحية لتناسب حجم الأطباق الزجاجية القاع التي سيتم تقييم الهجرة (الشكل 1B). قبل المتابعة، وإزالة الغبار المتبقي من الطبق باستخدام عدسة تنظيف الورق. هذا تفضل ملزمة من PDMS على الزجاج هو موضح في الخطوة 1.10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف رقاقة PDMS حجمها تحتوي على القنوات عن طريق الالتزام وتقشير شريط لاصق على الجانبين الهيكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن القطع PDMS 30 ثانية في 70٪ من الإيثانول لإزالة الغبار والجسيمات الصغيرة PDMS. تجفيفها بسرعة بعد ذلك من قبل تهب الهواء النقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل PDMS (هياكل صعودا) والأطباق الثقافة عن طريق الجو (أو الأكسجين) العلاج البلازما خلال 30 ثانية في 300 mTorr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كل السطوح تفعيلها على اتصال دائم التمسك PDMS إلى الركيزة. إذا لزم الأمر، واستخدام ملقط معدني للضغط قليلا على الجزء العلوي من PDMS لإجبار الاتصال بين البوليمر والزجاج من الطبق (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شريحة في الفرن عند 65 درجة مئوية FOص 1 ساعة إلى تعزيز ملزمة. </li></ol> 2. طلاء Microchannels <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل الهيكل كله من قبل البلازما الجوية في 300 mTorr لمدة 1 دقيقة. وهذا تشجيع دخول السائل في القنوات في الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الثقوب بسرعة دخول رقاقة مع فبرونيكتين في 10 ميكروغرام / مل في الماء. ركائز أخرى مثل PEG يمكن أن تستخدم لتعديل الالتزام الخلية إلى جدران القناة. الانتباه إلى أن السائل ينتشر في جميع أنحاء هيكل كامل. هذا ويمكن التحقق بسهولة من خلال العين تحت ضوء العادية أو باستخدام مجهر حقل مشرق العادية. ملاحظة: في هياكل صغيرة جدا، والذي نشر هو أصعب، يمكن أن يجبر دخول السائل في القنوات عن طريق وضع هيكل في جرس جرة فراغ خلال 15 دقيقة على الأقل. للتحقق من كفاءة الطلاء ركائز الفلورسنت يمكن استخدامها (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح الامتزاز من فبرونيكتين أو أي SUBST طلاء أخرىمعدل لجدران القنوات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الهياكل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني لإزالة الركيزة nonbound. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل، والمضي قدما في البروتوكول 3 أو تخزين رقاقة في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا (24 ساعة كحد أقصى). </li></ol> 3. خلية تحميل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني من لوحة وملء مع الميكروسيستم المتوسطة الخلية. دعونا احتضان لمدة 1 ساعة لتشبع قنوات مع المتوسط. ملاحظة: للحصول على التجارب التي تنطوي على المخدرات مثل مثبطات جزيء، وينصح ليحضن مسبقا القنوات مع المتوسط ​​تحتوي على المخدرات في تركيز الحق. علاوة على ذلك، بعض الأدوية تميل إلى ذوبان في هيكل PDMS مما يقلل من التركيز الفعال. وقد اقترحت بعض الحلول لمواجهة هذه القضية 11-12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العائمة البلدان النامية واستعادة الخلايا شبه ملتصقة بواسطة بيغ مع الثقافة المتوسطة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. ملاحظة: للحصول على التصوير النواة، يمكن تحقيق هويشت 33342 تلطيخ مسبقا من قبل فيcubating 2 × 10 6 خلايا خلال 30 دقيقة مع الصبغة في 200 نانوغرام / مل في المتوسط ​​كاملة. يغسل مرتين بواسطة الطرد المركزي لإزالة الزائدة من الصبغة قبل مواصلة البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق (الوقت والسرعة يمكن أن تكون مختلفة اعتمادا على نوع من الخلايا) وتجاهل المتوسطة. تمييع بيليه للوصول إلى تركيز 20 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الزائدة متوسطة من لوحة وتفريغ الثقوب دخول في هيكل PDMS باستخدام micropipette. ملء الإدخالات مع 5 ميكرولتر من حل الخلية لتصل إلى مبلغ 1 × 10 5 خلايا في كل ثقب الدخول. ملاحظة: مطلوب كثافة الخلايا عالية لصالح الاتصال من الخلايا التي تحتوي على القنوات. قد يؤدي انخفاض كثافة الخلايا في انخفاض عدد خلايا داخل القنوات وفشل التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان رقاقة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. إضافة 2 مل من المتوسط ​​كاملة على طبق التجربة. ملاحظة: هيكل PDMS كله يجب به مغطاة من أجل تجنب جفاف الخلايا أثناء التجربة. إذا 2 مل ليست كافية، إضافة المزيد من المتوسطة لتغطية كامل هيكل PDMS. </li></ol> 4. التصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف السطح السفلي الخارجي من الأطباق مع الأنسجة تنظيف العدسة قبل وضع لوحات تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الهجرة في عدد كبير من الخلايا، استخدم 10X التكبير وإضاءة حقل واسع في CO 2 ودرجة الحرارة مجهزة الفيديو المجهر (الشكل 3). لتسهيل تتبع الخلية، هويشت تلطيخ والأشعة فوق البنفسجية يمكن استخدام ضوء (انظر الخطوة 3.2). الهجرة يمكن أن يكون تحليلها أيضا باستخدام متحد البؤر المجهري من أجل الحصول على دقة أعلى من الهياكل الخلوية أثناء الترحيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري الوقت الفاصل في 10X، واختيار تردد وقت وفقا لسرعة خلية المتوقع (عادة 2 دقيقة للخلايا الجذعية المهاجرة مع سرعة من 5 ميكرون / دقيقة). ملاحظة: بروتوكول الموصوفة هنا لا نبعد التمديد تشمل تحليل المعلمات هجرة الخلية. وفيما يلي بعض النقاط في المناقشة لتقديم المشورة للقراء بشأن كيفية المضي قدما لانتزاع معلومات من الأفلام الفاصل الزمني. </li></ol>

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li>
<li>Lämmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Schor, S. L., Allen, T. D., Harrison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+through+three-dimensional+gels+of+native+collagen+fibres%3A+collagenolytic+activity+is+not+required+for+the+migration+of+two+permanent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell migration through three-dimensional gels of native collagen fibres: collagenolytic activity is not required for the migration of two permanent cell lines.</a> J. Cell. Sci. 41, 159-175 (1980).</li>
<li>Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decisions+about+dendritic+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decisions about dendritic cells: past, present, and future.</a> Annu. Rev. Immunol. 30, 1-22 (2012).</li>
<li>Faure-André, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+by+CD74%2C+the+MHC+class+II-associated+invariant+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration by CD74, the MHC class II-associated invariant chain.</a> Science. 322 (5908), 1705-1710 (2008).</li>
<li>Renkawitz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+force+transmission+in+amoeboid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptive force transmission in amoeboid cell migration.</a> Nat. Cell Biol. 11 (12), 1438-1443 (2008).</li>
<li>Jacobelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confinement-optimized+three-dimensional+T+cell+amoeboid+motility+is+modulated+via+myosin+IIA-regulated+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confinement-optimized three-dimensional T cell amoeboid motility is modulated via myosin IIA-regulated adhesions.</a> Nat. Immunol. 11 (10), 953-961 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchinson, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (12), 1783-1790 (2007).</li>
<li>Moreau, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).</li>
<li>Heuzé, M. L., Collin, O., Terriac, E., Lennon-Duménil, A. M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+confinement%3A+a+micro-channel-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in confinement: a micro-channel-based assay.</a> Methods Mol. Biol. 769, 415-434 (2011).</li>
<li>Ren, K., Zhao, Y., Su, J., Ryan, D., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+method+for+modifying+poly%28dimethylsiloxane%29+to+be+airtight+and+resistive+against+absorption+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Convenient method for modifying poly(dimethylsiloxane) to be airtight and resistive against absorption of small molecules.</a> Anal. Chem. 82 (14), 5965-5971 (2010).</li>
<li>Ren, K., Dai, W., Zhou, J., Su, J., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Teflon+microfluidic+chips%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Whole-Teflon microfluidic chips.</a> PNAS. 108 (20), 8162-8166 (2011).</li>
<li>Maiuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+World+Cell+Race%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The first World Cell Race.</a> Curr Biol. 22 (17), 673-675 (2012).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن هنا وصف الجهاز يتكون من microchannels كوسيلة لدراسة خصائص المهاجرة من عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام التجريبي يحاكي القيود البيئية تقتصر جدت في أنسجة الخلايا المهاجرة الذاتية. ومع ذلك، من خلال إجبار الهجرة في بعد واحد، فإنه يسهل تتبع خلية الآلي واستخراج قياسه (الشكل 5). وتبين لنا أيضا أن لدينا جهاز متوافق مع مضان المجهري، وبالتالي يمكن تكييفها لدراسة عضية المواقع خلال مراحل مختلفة من حركية الخلية (الشكل 4). <p class="jove_co...

الهجرة هي وظيفة الخلوية المعقدة وهذا أمر مهم لكثير من العمليات الفسيولوجية في الكائنات متعددة الخلايا، بما في ذلك التنمية، الاستجابات المناعية، وتجديد الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، بعض الحالات المرضية مثل غزو الورم والانبثاث تعتمد على خلية حركية 1. لهذه الأسباب، فقد أصبحت الهجرة الخلية حقل رئيسي للدراسة في سياق البحوث الأساسية ومتعدية على حد سواء. في الجسم الحي، وتتميز معظم الأنسجة عن طريق مصفوفة خارج الخلية الغنية وكثافة الخلايا عالية. الهجرة الخلية وبالتالي، في ظل الظروف الفسيولوجية، ويحدث في بيئة محصورة المعقدة. كلاسيكيا، وقد درس الهجرة الخلية على الأرجح لأسباب تاريخية وحدود التقنية في أنظمة 2D المسطحة التي لا تتكاثر العديد من خصائص البيئة جدت في الأنسجة، مثل الحبس. علاوة على ذلك، عوامل مثل التصاق الخلية، التي تعتبر ضرورية لحركية في 2D، وقد أظهرت مؤخرا أن لا يكون necessaمطلوب rily للهجرة في الجسم الحي أو داخل المواد الهلامية، مما يوحي بأن الآليات التي تحكم تحرك خلية في 2D و في بيئات أخرى تختلف 2. وقد تم تطوير عدة أنظمة لمحاكاة خصائص معقدة من الأنسجة، والمواد الهلامية يجري الكولاجين الأكثر شهرة، والتي تهدف إلى تلخيص خصائص تكوين المصفوفة خارج الخلية 3. ونحن هنا نقترح microchannels كوسيلة مكملة بسيط هو أن يسمح للهجرة الخلية الدراسة في بعد واحد تحت بيئة محصورة. في هذا النظام تهاجر الخلايا جنبا إلى جنب في microchannels التي يدخلون من تلقاء أنفسهم. الخلايا المهاجرة ثم الحصول على شكل قنوات، واعتماد هندسة أنبوبي أن يعزز على الأرجح قطبية بهم. حركة خطية من الخلايا في قنوات يسمح تتبع خلية الآلي واستخراج المعلمات كمية من التجارب. من الناحية الفنية، وهذا النظام هو سهلة ومرنة. وcoatinغرام من جدران القناة ويمكن التلاعب بها، وحجم وشكل القنوات يمكن تكييفها، ويمكن تحليل عدد كبير من الخلايا في تجارب واحد. هذا النظام يمكن زيادتها المتابعة أيضا لإجراء تحليل الشاشة متوسطة المدى من الجزيئات المشاركة في حركية الخلية. بروتوكول الموصوفة هنا كانت موحدة باستخدام الخلايا الجذعية (DC) كنموذج الخلوية. هذه الخلايا هي المفتاح لجهاز المناعة كما أنها تشارك في بدء وصيانة الاستجابات المناعية محددة 4. في المختبر، وقد تبين أن البلدان النامية إلى الهجرة بشكل عفوي في البيئات المحصورة وبالتالي فهي نموذجا جيدا لدراسة حركية خلية في microchannels 5،6 . الأهم من ذلك، هذا النظام يمكن تمديدها لتحليل الهجرة إلى أي نوع من الخلايا متحركة أخرى اللمفاويات التائية، العدلات، أو الخلايا السرطانية 7-9.

<table><tbody><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS) GE</td> <td>Silicones</td><td>RTV615</td><td>عبوة من قاعدة سيليكون 90٪ وعامل معالجة 10٪</td></tr><tr><td>قاطع العينة الأساسية</td><td>Ted Pella Int.</td><td>Harris Uni-Core</td><td>Diameter 2.5 مم</td></tr><tr><td>طبق زجاجي</td><td>القاع WPI</td><td>Fluorodish FD 35-100</td><td></td></tr><tr><td>منظف بالموجات فوق الصوتية</td><td>برانسون بالموجات</td> فوق الصوتية <td>برانسون 200</td><td></td></tr><tr><td>منظف بلازما</td><td>هاريك بلازما</td><td>PDC 32 جم</td><td>للعينات الصغيرة (35 طبقا). يتوفر أيضا إصدار أكبر</td></tr><tr><td>من Fibronectin من بلازما البقر</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>PolyLysine المطعمة PEG (Pll-g-PEG)</td> <td>Susos</td><td>PLL (20) -g [3.5] -PEG (5) Hoechst</td><td></td></tr> <tr><td>33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>TOCRIS</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

دراسة الهجرة خلية في القنوات microfabricated

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

الطريقة الموضحة هنا يسمح دراسة الهجرة الخلية تحت الحبس في بعد واحد. لأنه يقوم على استخدام القنوات microfabricated، التي تفرض النمط الظاهري الاستقطاب إلى الخلايا عن طريق القيود المادية. مرة واحدة داخل القنوات، وخلايا لديها سوى احتمالين: التحرك إلى الأمام أو الخلف. هذه الهجرة مبسطة الذي يقتصر الاتجاهية يسهل التتبع التلقائي للخلايا واستخراج المعلمات الكمي لوصف حركة الخلية. وتشمل هذه مؤشرات قوة الاندفاع الخلية، والتغيرات في الاتجاه، وتوقف أثناء الحركة. Microchannels هي أيضا متوافقة مع استخدام علامات الفلورسنت، وبالتالي فهي مناسبة لدراسة توطين عضيات داخل الخلايا والهياكل أثناء الهجرة الخلية بدقة عالية. أخيرا، والسطح من القنوات يمكن بين functionalized مع ركائز مختلفة، والسماح للسيطرة على خصائص لاصقة من القنوات أو دراسة haptotaxis. وباختصار، فإن نظام حيحرث صفها يهدف إلى تحليل هجرة أعداد الخلايا الكبيرة في الظروف التي يتم التحكم كلا من الهندسة والطبيعة والكيمياء الحيوية للبيئة، وتسهيل تطبيع واستنساخ تجارب مستقلة.

في كل تجربة وهي مغلفة سطح PDMS مع جزيء تكييفها لمصلحة الدراسة. ويبين الشكل 2 القنوات المغلفة مع جزيء نيون، PLL-G-PEG، قبل وبعد غسل (الخطوة 2.4). هذه التجربة تسمح للسيطرة على تجانس الطلاء في القنوات. بعد تحميل الخلية، المجهري الفيديو لا يمكن أن يؤديها لمتابعة الهجرة الخلية. ويبين الشكل 3A مثال على العاصمة المهاجرة في microchannels في مناطق ذات كثافة مناسبة لتتبع الخلايا. كلا، الطو...

يوصف الأسلوب الكمي لدراسة الهجرة عفوية من الخلايا في المكروية يقتصر ذات بعد واحد. هذا الأسلوب يستفيد من القنوات microfabricated، ويمكن استخدامها لدراسة هجرة عدد كبير من الخلايا تحت ظروف مختلفة في التجارب واحد.

دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

الهدف العام من التجربة التالية هو تحضير قنوات مصنعة دقيقة لدراسة الهجرة الخلوية المحصورة التلقائية. ويتحقق ذلك أولاً من خلال تحضير شريحة البولي ميثيل SUBOXANE أو PDMS التي تحتوي على القنوات. وكخطوة ثانية، يتم طلاء القنوات بالفبرونكتين أو أي ركيزة طلاء أخرى، مما يسمح بتفعيل الجهاز وظيفياً.بعد عدة عمليات غسل، يتم تحميل الخلايا التغصنية في النظام الدقيق لدراسة هجرة الخلايا. ويتم الحصول على نتائج تظهر اختلافات في السرعة لأنواع مختلفة من الخلايا أو المعالجات بناءً على الفحص المجهري وتحليل الصور. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل هجرة الخلايا التقليدية ثنائية الأبعاد، في قدرتنا على مواجهة الهندسة الفراغية وحصر الخلايا.بشكل عام، قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب الدقة المطلوبة لإتمام كل خطوة. للبدء، اخلط زيت PDMS وعامل المعالجة بنسبة وزنية تبلغ 10 إلى 1 في كوب خلط بلاستيكي، مع خلط كلا المركبين جيداً، ثم صب الخليط فوق القالب الذي يحتوي على القنوات الدقيقة. يجب أن يتراوح الارتفاع الإجمالي بين 0.5 و 1 cm.قم بإزالة أي فقاعات هوائية في وعاء جرس مفرغ من الهواء لمدة ساعة واحدة، ثم قم بتصلب الـ PDMS في القالب بوضعه في فرن لمدة ساعتين عند 65 درجة مئوية. بعد أن يبرد الـ PDMS إلى درجة حرارة الغرفة، اقطع قطعة كبيرة حول الهيكل باستخدام شفرة جراحية وقم بتقشيرها من القالب. بعد ذلك، قم بحفر ثقوب في المواضع التي سيتم حقن الخلايا فيها، ثم أعد ضبط حجم الـ PDMS باستخدام شفرة جراحية ليتناسب مع أطباق ذات قاع زجاجي والتي سيتم فيها تقييم الهجرة. قم بالتنظيف.بعد تغيير حجم شريحة PDMS التي تحتوي على القنوات عن طريق لصق ونزع الشريط اللاصق على جوانب الهيكل، يتم تعريض قطع PDMS للموجات فوق الصوتية لمدة 30 ثانية في ethanol بتركيز 70% لإزالة الغبار وجزيئات PDMS الصغيرة قبل المتابعة. أزل الغبار المتبقي من الطبق باستخدام ورق تنظيف العدسات.قم بتنشيط الـ PDMS وأطباق الزرع عن طريق المعالجة ببلازما الهواء لمدة 30 ثانية عند 300 Milit، وضع كلا السطحين المنشطين في تلامس لإلصاق الـ PDMS بالركيزة بشكل دائم إذا لزم الأمر. استخدم ملقطاً معدنياً للضغط بخفة على الجزء العلوي من الـ PDMS لفرض التلامس بين البوليمر وزجاج الطبق. قم بتحضين الشريحة في الفرن عند 65 degrees Celsius لمدة ساعة واحدة.لتعزيز الارتباط، قم بتنشيط الهيكل بأكمله باستخدام بلازما الهواء عند 300 millitorr لمدة دقيقة واحدة. سيؤدي ذلك إلى تسهيل دخول السائل إلى القنوات في الخطوة التالية. بعد ذلك، املأ فتحات الدخول في الشريحة بسرعة ببروتين fibronectin بتركيز 10 µg/mL في الماء.يمكن استخدام ركائز أخرى، مثل polyethylene glycol لتعديل التصاق الخلايا بجدران القناة. يجب التأكد من انتشار السائل في جميع أنحاء الهيكل بالكامل. يمكن التحقق من ذلك بسهولة بالعين المجردة تحت الضوء العادي، أو باستخدام مجهر المجال المضيء (brightfield microscope) الاعتيادي.بعد ذلك، تُحضن البنية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة للسماح بامتصاص الفبرونكتين أو أي مادة طلاء أخرى في جدران القنوات. وأخيراً، تُغسل البنى لإزالة المادة غير المرتبطة عن طريق إزالة جميع السوائل من القنوات والطبق قبل النقع في محلول ملحي منظم بالفوسفات أو PBS طازج لمدة خمس دقائق. يتم إزالة PBS من الطبق وملء النظام الدقيق بوسط زراعة الخلايا.اترك اللوح في الحاضنة لمدة ساعة واحدة لإشباع القنوات بالوسط الغذائي لجمع الخلايا من أجل التصوير. تخلص من الخلايا الشجرية العائمة واستعد الخلايا شبه الملتصقة عن طريق غسل اللوح بوسط استزراع. وذلك قبل القيام بعد الخلايا.باستخدام مقياس كرات الدم، يتم طرد الخلايا مركزياً عند 300 ×g لمدة خمس دقائق والتخلص من الوسط. يتم تخفيف الراسب للوصول إلى تركيز 20 مليون خلية لكل ملليلتر. يتم إزالة الوسط الزائد من الطبق وتفريغ فتحات الدخول في هيكل PDMS.باستخدام ماصة دقيقة، يتم ملء الفتحات بـ 5 µL من محلول الخلايا للوصول إلى كمية تبلغ 1 × 10⁵ خلية في كل فتحة. بعد تحضين الشريحة الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 °C في الحاضنة، يُضاف 2 mL من الوسط الكامل إلى طبق التجربة لغرض التصوير.أولاً، قم بتنظيف السطح السفلي الخارجي للأطباق باستخدام مناديل تنظيف العدسات قبل وضع الأطباق تحت المجهر. ولتحليل الهجرة في عدد كبير من الخلايا، استخدم تكبيراً بمقدار 10x وإضاءة واسعة المجال في مجهر فيديو مجهز بنظام للتحكم في درجة الحرارة وCO2 لتسهيل تتبع الخلايا. ويمكن استخدام صبغ هيرش (Hirsch staining) والضوء فوق البنفسجي (UV light) كما هو موضح في البروتوكول النصي للمجهر بنظام الفاصل الزمني (time lapse microscopy) بتكبير 10x.اختر تردداً زمنياً وفقاً لسرعة الخلايا المتوقعة. وعادة ما يكون ذلك دقيقتين للخلايا الشجرية التي تهاجر بسرعة 5 microns per minute. في كل تجربة، يتم طلاء سطح PDMS بجزيء يتناسب مع الغرض من الدراسة.في هذا الشكل، تكون القنوات مغطاة بجزيء فلوري. بولي ليسين مطعم بـ بولي إيثيلين جلايكول قبل الغسيل وبعده. تسمح مثل هذه التجربة بالتحكم في تجانس الطلاء داخل القنوات بعد تحميل الخلايا، كما يمكن إجراء المجهر الفيديو ل تتبع هجرة الخلايا.إليك مثال لخلايا شجيرية تهاجر في قنوات دقيقة بكثافة مناسبة لتتبع الخلايا. ويمكن استخدام كل من تباين الطور وصبغة hersch لهذا الغرض. كما تتوافق هذه التقنية مع المجهر البؤري الفلوري بدقة أعلى، ويمكن استخدامها لتتبع العضيات أو التراكيب الخلوية كما هو موضح في ديناميكيات الأكتين المبلمر في الخلايا الشجيرية المهاجرة التي تعبر عن life act GFP.يظهر هنا مثال على قياس حركية الخلايا التي تم تحليلها في الخلايا الشجرية المهاجرة. تظهر القوة الناتجة عن الخلايا الشجرية من النوع البري أو تلك المعالجة بـ Y 27 632 dihydrochloride أن العقار هو مثبط معروف جيداً لتقلص الخلايا وهجرتها، وقد استُخدم للتحقق من قدرة النظام على اكتشاف التغيرات في السرعة. يمكن تحليل الـ kog بشكل أكبر لاستخراج موقع وحجم الخلايا كدالة في الزمن، مما يسمح بدراسة معاملات مختلفة لوصف هجرة الخلايا.تم تتبع سرعة الهجرة من خلال تصوير موقع النواة باستخدام برنامج مصمم محلياً. تمتلك الخلايا الشجيرية متوسط سرعة يقارب 6 microns per minute. ويؤدي العلاج بالدواء إلى خفض سرعتها بشكل ملحوظ.يوضح هذا المثال قوة هذه التقنية، التي تتيح التقدير الكمي لأعداد كبيرة من الخلايا في تجارب فردية، وفائدة النظام في الكشف عن الاختلافات الناتجة عن العلاجات الدوائية. وبمجرد إتقانها، يمكن تنفيذ التقنية الموضحة هنا في غضون ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد مرحلة تطويرها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الهجرة لدراسة الحركة الخلوية في بيئات محصورة ومحكومة.

study-of-cell-migration-in-microfabricated-channels

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

ووصف الجهاز ميكروفلويديك compartmentalizing للتحقيق في الهجرة سرطان الخلايا الجذعية. هذه الرواية يخلق منصة قابلة للحياة المكروية الخلوية ويتيح التصور المجهرية للتنقل الخلية الحية. متحركة عالية يتم عزل الخلايا السرطانية لدراسة الآليات الجزيئية للتسلل العدوانية، مما قد يؤدي إلى المزيد من العلاجات الفعالة في المستقبل.

تقييم الخلية الجذعية السرطانية الهجرة عن طريق أجهزة ميكروفلويديك Compartmentalizing والتصوير لايف الخليوي

يُعد اختبار مسار الحركة البلعومية طريقة تُستخدم لتقييم حركة الخلايا. وبشكل محدد، يقيس هذا الاختبار الحركة الكيميائية (حركية الخلايا العشوائية) بمرور الوقت بطريقة كمية. ويستفيد الاختبار من قدرة الخلايا على تكوين مسار قابل للقياس لحركتها على شرائح تغطية مطلية بالذهب الغروي.

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

يوصف أسلوب لتجميع تدرجات لاصقة وقابل للذوبان في غرفة الفحص المجهري لدراسات الهجرة حية الخلية. هندسيا يجمع بين البيئة والسطوح المانعة لاصقة المسارات مع التدرجات الحل وبالتالي يسمح احد لتحديد الأهمية النسبية للمنبهات التوجيه.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

تعد هجرة الخلايا جزءا مهما من التنمية البشرية والحياة. من أجل فهم الآليات التي يمكن أن تغير هجرة الخلايا ، نقدم نظام انتشار متدرج مستو للتحقيق في الانجذاب الكيميائي في مصفوفة الكولاجين ثلاثية الأبعاد ، والتي تسمح للمرء بالتغلب على قيود غرفة الانتشار الحديثة للمقايسات الحالية.

مستو التدرج نظام إنتشار المعنية بالتحقيق في الانجذاب الكيميائي في الكولاجين مصفوفة 3D

تم تطوير العديد من أجهزة الموائع الدقيقة لاستخدامها في دراسة التاكسير الكهربائي. ومع ذلك ، لا تسمح أي من هذه الرقائق بالدراسة الفعالة للتأثيرات المتزامنة للمجال الكيميائي والمجال الكهربائي (EF) على الخلايا. لقد طورنا جهازا قائما على بولي ميثيل ميثاكريلات يوفر تعايشا متعايشا بشكل أفضل وتحفيزا كيميائيا لاستخدامه في أبحاث التاكسي الكهربائي.

الدراسات انجذاب كهربي من الرئة خلايا سرطان باستخدام القنوات المتعددة ثنائي الكهربائية الميدان ميكروفلويديك رقاقة

تفاصيل هذا البروتوكول طريقة تخصيص لقياس الهجرة الخلية ردا على chemoattractants التي يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد معدل انتشار المخدرات من البوليمر.

للدائرة للتخصيص لقياس الهجرة الخلية

يعد التحكم في التدرجات الكيميائية والأكسجين أمرا ضروريا لمزارع الخلايا. تشير هذه الورقة إلى جهاز موائع دقيقة بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان بولي كربونات (PDMS-PC) قادر على توليد مجموعات موثوقة من التدرجات الكيميائية والأكسجين لدراسات هجرة الخلايا ، والتي يمكن استخدامها عمليا في المختبرات البيولوجية بدون أجهزة متطورة.

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

وغالبا ما تسترشد هجره الخلايا الجماعية في التنمية ، والتئام الجروح ، وورم خبيث السرطان من التدرجات من عوامل النمو أو الجزيئات الإشارات. وصف هنا هو نظام تجريبي الجمع بين المجهر الجر مع نظام ميكروفلويدريك ودليلا علي كيفيه قياس أليات الهجرة الجماعية تحت التدرج البيوكيميائية.

المجهر الجر المتكاملة مع ميكروفلويديكس للهجرة الجماعية الكيميائية

في هذا البروتوكول ، يتم استخدام فحص الموائع الدقيقة المحاكاة الحيوية ، والتي يمكن أن تعيد إنتاج بيئة الأوعية الدموية الدقيقة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية وإعادة إنتاج سلسلة التصاق / هجرة الكريات البيض بأكملها ، لدراسة تفاعلات الخلايا البطانية الكروية البيض في الأمراض الالتهابية.

نظام فسيولوجي دقيق لدراسة تفاعل الخلايا البطانية الكروية البيض أثناء الالتهاب

يتم هنا تقديم بروتوكول للتقييم الكمي لهجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد داخل وداخل واجهة الهلاميات المائية الحبيبية.

تحديد هجرة الخلايا ثلاثية الأبعاد داخل وإلى المواد الحيوية هيدروجيل الحبيبية

استكشف طريقة كمية لدراسة هجرة الخلايا في بيئة محصورة أحادية البعد باستخدام قنوات مصنعة بتقنية التصغير الدقيق. تتيح هذه التقنية فحص ديناميكيات الهجرة الخلوية وسرعتها في ظروف مراقبة بدقة.

دراسة الهجرة خلية في القنوات Microfabricated

استكشف المزيد من الفيديوهات