التصوير خلية غشاء من الإصابات والعمليات التحت خلوية المشاركة في اصلاح

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة تأثير العلاجات المرغوبة على إصلاح الخلايا المصابة ودراسة العمليات تحت الخلوية التي تساعد في إصلاح الخلايا المصابة. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة الخلايا في وجود أصباغ فلورية لا يمكنها عبور أغشية الخلايا السليمة لتقييم حركية الخلايا المصابة وقدرتها على منع دخول هذه الأصباغ. كخطوة ثانية ، نراقب ظهور البروتينات داخل الخلايا في غشاء الخلية المصاب ، والذي يحدد قدرة الحجرة الخلوية ذات الأهمية على المشاركة في الإصلاح عن طريق الاندماج في غشاء الخلية المصاب.

بعد ذلك ، نراقب اندماج المقصورات الخلوية ذات الأهمية مع غشاء الخلية المصاب من أجل مراقبة حركية الإصابة. يتم الحصول على نتائج الاندماج الناجم عن هذه المقصورة التي تظهر أن إصلاح إصابة غشاء الخلية يرتبط بإفراز الخلايا الليزوزومية بناء على زيادة ظهور بروتين الغشاء المرتبط بالليزوسوم ، واحد على سطح الخلية المصابة والتصوير الحي لإفراز المحتوى الليزوزومي بواسطة الخلايا المصابة. يمكن أن تساعد هذه الطرق في معالجة الأسئلة المهمة في إصابة الخلايا وإصلاحها.

على سبيل المثال ، يمكن استخدامها لتحديد البروتينات والأجزاء الخلوية التي تستجيب للإصابات البؤرية في غشاء الخلية ثم تقييم حركية الاستجابة. وسيكون عرض الإجراء أوريليا دي فور وهما سترا اثنان من زملاء ما بعد الدكتوراه من مختبري. لتمييز الخلايا المصابة التي تلتئم وتلك التي تفشل في الشفاء.

قم بزرع الخلايا على زلات غطاء معقمة للظروف التجريبية الثلاثة. قم بزراعة الخلايا حتى تصل إلى أكثر من 50٪ من التقاء ، ثم اغسل C واحد و C اثنين مرتين باستخدام CIM عند 37 درجة مئوية. اغسل C3 باستخدام PBS عند 37 درجة مئوية.

ثم انقل زلات الغطاء على حلقات O المصنوعة من السيليكون. أضف 100 ميكرولتر من محلول ديكستران فيتزي الدافئ في المخزن المؤقت المناسب. قم بإصابة غشاء البلازما على C one و C3 عن طريق إضافة 40 ملليغرام من الخرز الزجاجي فوق زلة الغطاء في درجة حرارة الغرفة وإمالة الغطاء يدويا.

ينزلق ذهابا وإيابا من ست إلى ثماني مرات بزاوية 30 درجة للإصابة الخفيفة. تأكد من انتشار الخرز الزجاجي بشكل موحد ، وبالتالي تقليل الإصابات المتكررة لتحسين قابلية تكرار الإصابة بين العينات. في نفس الوقت قم بتنفيذ إصابة الخرزة الزجاجية للعينات المختلفة المراد مقارنتها ، وتجنب المزيد من دحرجة الخرز.

انقل جميع زلات الغطاء إلى حاضنة 37 درجة مئوية عند ثاني أكسيد الكربون المحيط واترك الإصلاح يستمر لمدة خمس دقائق دون ترك الخرزات تتدحرج. قم بإزالة الخرز الزجاجي و fitzy dextran عن طريق الغسيل باستخدام المخزن المؤقت أو PBS. الآن ضع زلات الغطاء مرة أخرى على الحلقة O وأضف 100 ميكرولتر من اللايسين الدافئ.

محلول trissy dextrann القابل للإصلاح احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق عند ثاني أكسيد الكربون المحيط. اغسل الغطاء مرتين باستخدام CIM الدافئ وثبته باستخدام 4٪ PFA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد غسلتين من PBS. احتضن لمدة دقيقتين في صبغة هيرش وبعد غسلتين من PBS ، قم بتركيب العينة على شريحة باستخدام وسائط التثبيت.

بعد ذلك ، قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر مضان epi من عينة C الثانية. تحديد شدة تلطيخ الخلفية باللونين الأحمر والأخضر. ثم استخدم هذه القيمة لتحديد عتبة القناتين الحمراء والخضراء لجميع العينات.

سجل إجمالي عدد الخلايا الخضراء. قم أيضا بتسجيل الخلايا ذات اللون الأحمر أو الأحمر والأخضر في عينتي C one و C3. الآن عد أكثر من 100 خلية خضراء مصابة لكل حالة وعبر عن جزء الخلايا التي فشلت في الإصلاح كنسبة مئوية من جميع الخلايا المصابة.

اغسل الخلايا التي نمت إلى أكثر من 50٪ التقاء باستخدام CIM التحذير المسبق وقم بتركيب زلة الغطاء في CIM بصبغة FM. في حامل في الحاضنة العلوية للمرحلة تم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية. حدد منطقة من غشاء الخلية باستخدام الطاقة المثلى التي تسمح بإصابة متسقة ولكن غير مميتة.

قم بإشعاع العينة لمدة تقل عن 10 مللي ثانية باستخدام الليزر النبضي لتحقيق ذلك. قم بتخفيف طاقة الليزر من خلال البرنامج إلى 40 إلى 50٪ من ذروة الطاقة من أجل مراقبة الصور وإصلاحها والحصول عليها كل ثانيتين إلى 10 ثانية في epi ، والتألق ، والمجال الساطع بدءا من الإصابة والاستمرار لمدة ثلاث إلى خمس دقائق بعد الإصابة. لتحديد حركية الإصلاح ، قم بقياس مضان صبغة FM الخلوية.

احسب التغير في الشدة أثناء التصوير. متوسط البيانات لأكثر من 10 خلايا في كل حالة ورسمها كمتوسط أو قيمة خلايا فردية. اغسل زلات الغطاء من C واحد و C اثنين.

مستحضرات الاستزراع مع CIM عند 37 درجة مئوية وغسل C3 مع PBS عند 37 درجة مئوية. ثم انقل العينات على حلقات السيليكون. أضف 100 ميكرولتر من اللايسين القابل للتثبيت مسبقا.

إصابة غشاء البلازما على C one و C3 كما هو موضح سابقا. ثم تجنب المزيد من دحرجة الخرز. انقل جميع زلات الغطاء إلى حاضنة 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون المحيط واسمح للإصلاح بالاستمرار لمدة خمس دقائق.

الآن لإزالة الخرزات الزجاجية و Trixie dextaren ، اغسل الغطاء في وسط النمو البارد ، مما يضمن عدم تدحرج الخرز الزجاجي على الخلايا. اشطف زلات الغطاء مرتين باستخدام وسط النمو البارد وانقله إلى الحلقات O إلى C one و C3. أضف 100 ميكرولتر من مصباح الفئران المضاد للولايات المتحدة جسما مضادا واحدا في وسائط النمو الكامل الباردة وأضف وسائط النمو الكاملة الباردة إلى C اثنين للسماح بربط الجسم المضاد. احتضان زلات الغطاء لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية بعد ثلاث غسلات باستخدام CIM البارد.

قم بإصلاح جميع زلات الغطاء باستخدام 4٪ PFA لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطفها ثلاث مرات باستخدام CIM. بعد ذلك ، احتضان جميع زلات الغطاء في 100 ميكرولتر محلول مانع لمدة 15 دقيقة ، متبوعا ب 100 ميكرولتر ofor ، 4 88 جسم مضاد مضاد للفئران لمدة 15 دقيقة.

اغسلها مرتين باستخدام PBS واحتضنها في البقعة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة بعد غسلتين من PBS. قم بتركيب العينات على شريحة ، ثم قم بتصوير العينات باستخدام مجهر مضان epi باستخدام صور خليتين C. حدد تلطيخ الخلفية غير المحدد في القناتين الحمراء والخضراء.

استخدم قيم تلطيخ الخلفية هذه لتحديد عتبة القناتين الحمراء والخضراء لجميع العينات. استخدم أكثر من 100 خلية ذات علامات حمراء من C one و C3 لقياس شدة تلطيخ المصباح الأول في الخلايا المصابة. في تجربة ناجحة ، سيكون المصباح الأول الذي يلطخ الخلايا من C3 أقل بكثير مما هو عليه في الخلايا من C واحد لوضع العلامات على الجسيمات الحالة بصبغة الفلورسنت تحتضن الخلايا المزروعة إلى التقاء 50٪ في وسط النمو الذي يحتوي على فيتزي ديكستران.

اسمح للديكستران بأن يكون خلوي لمدة ساعتين في حاضنة زراعة الخلايا. اغسل الخلايا بوسائط النمو الدافئة واحتضانها لمدة ساعتين في حاضنة CO2 للسماح لكل ديكستران الخلوي بالتراكم في الليزوزوم قبل التصوير. اشطف زلة الغطاء في Prewarm CIM وقم بتثبيتها في CIM على حامل انزلاق الغطاء في الحاضنة العلوية على المسرح عند 37 درجة مئوية.

اختر الخلايا التي لا تحتوي على فيتزي ديكستران مزدحم يسمى الجسيمات الحالة للتصوير. حركة وخروج الخلايا للجسيمات الحالة الفردية. الحصول على صور مجال واسع لحركة الليزوزوم في جميع أنحاء الخلية.

بالتناوب الحصول على صور العشب للحركة على سطح الخلية ومراقبة إفراز الخلايا. إصابة غشاء الخلية عن طريق التشعيع كما هو موضح سابقا لمراقبة استجابة الليزوزوم لخلايا صورة إصابة الخلايا بمعدل أربعة إلى ستة إطارات في الثانية لمدة دقيقتين على الأقل أو أكثر اعتمادا على ديناميكيات إفراز الخلايا في الخلايا ذات الاهتمام. في هذا الفحص المجمع ، يتم تمييز جميع الخلايا المصابة ويتم تحديد تلك التي فشلت في إصلاحها بينما تظل الخلايا غير المصابة غير مصنفة.

تصنيف الخلايا المصابة بالخرز الزجاجي في وجود فيتزي ديكستران باللون الأخضر عندما يسمح للخلايا بالإصلاح في وجود الكالسيوم. تمكنت معظم الخلايا المصابة من الإصلاح ولا يتم تمييزها ب trissy dextrann عندما يسمح للخلايا بالإصلاح. في حالة عدم وجود الكالسيوم ، يتم أيضا تصنيف معظم الخلايا المصابة باللون الأحمر بواسطة ديكستران التريازي.

هذه التجربة بتقييم حركية إصلاح غشاء الخلية من خلال مراقبة دخول صبغة FM في الخلية. عند تحضينها في FM ، تظهر الخلايا السليمة القليل من التلوين داخل الخلايا. بعد إصابة الليزر الموضعية لغشاء الخلية ، يبدأ FM D في دخول الخلية وربط الأغشية الداخلية ، مما يتسبب في زيادة مفاجئة في مضان صبغة FM حيث تعتمد قدرة غشاء الخلية على الإصلاح بعد إصابة الليزر على الكالسيوم.

الخلية المصابة في وجود الكالسيوم قادرة على الإصلاح ، مما يؤدي إلى توقف دخول صبغة FM في غضون دقيقة بعد الإصابة. على العكس من ذلك ، فإن الخلية المسموح لها بالإصلاح في حالة عدم وجود الكالسيوم تفشل في الإصلاح ، مما يؤدي إلى دخول الصبغة المستمر وبالتالي الزيادة المستمرة في مضان FM d حتى بعد أربع دقائق من الإصابة. وبالتالي ، يؤدي إصلاح غشاء الخلية إلى استقرار تلطيخ صبغة FM.

بينما يؤدي نقص إصلاح غشاء الخلية إلى دخول الصبغة المستمر الذي يفشل في الاستقرار. يمكن استخدام نهج إصابة الخرزة الزجاجية السائبة لمراقبة نقل سطح الخلية للحويصلات والبروتينات استجابة للإصابة. هنا ، تصاب الخلايا في وجود trissy dextran.

وبالتالي ، في حين أن الخلايا غير المصابة لا يتم تصنيفها باللون الأحمر ، فإن جميع الخلايا المصابة مصنفة باللون الأحمر. لاحظ أن الخلايا غير المصابة التي لم يتم علاجها بالأجسام المضادة الأولية تظهر ملصقات على مستوى الخلفية لمصباح سطح الخلية الأول. ومع ذلك ، عندما تصاب الخلايا ويسمح لها بالشفاء في وجود الكالسيوم ، تخضع الجسيمات الحالة لإفراز الخلايا وبالتالي يكون هناك مستوى متزايد من تلطيخ المصباح على سطح الخلايا المصابة.

هذه الزيادة في مصباح سطح الخلية أقل بكثير في الخلايا التي يسمح لها بالشفاء في حالة عدم وجود الكالسيوم. وبالتالي ، فإن تحديد عدد الخلايا ذات المصباح السطحي للخلية العالية تلطيخ واحد ، وكذلك قياس مستوى مصباح سطح الخلية. واحد. يوفر تلطيخ الخلايا المصابة الفردية مقاييس لقدرة الخلية على الخضوع للإصابة التي تسببت في إفراز الخلايا الليزوزومي.

تراقب هذه التجربة بشكل مباشر حركية وطبيعة وموقع اندماج الليزوزوم الفردي. استجابة لإصابة غشاء الخلية ، تصاب الخلايا بالليزر النبضي ويتم تصوير الجسيمات الحالة لسطح الخلية عن طريق تصوير العشب ، مما يسمح بمراقبة الإصابة التي تسببت في إفراز الجسيمات الحالة في الخلايا الفردية. يوضح هذا الشكل خلية يتم تصورها عن طريق تصوير تباين الطور في اللوحة اليسرى وبواسطة المجهر العشب في اللوحة الوسطى.

تعرض اللوحة اليمنى صورة العشب لنفس الخلية بعد 105 ثوان من الإصابة. هنا ، تسببت الإصابة في تجنيد الليزوزوم في غشاء الخلية ، متبوعا بإفراز الخلايا. هذا الليزوزوم غير مرئي في صورة العشب قبل الإصابة ، ولكن بعد الإصابة ، يصل الليزوزوم إلى غشاء الخلية ويصبح قابلا للاكتشاف.

عندما تقترب الحويصلة من غشاء الخلية ، فإنها تتحمس بشكل أفضل لإضاءة العشب مما يتسبب في وصول مضان خيط dex الأحجار الكريمة إلى أقصى قيمة. عندما يفتح صب الانصهار ، يؤدي ذلك إلى تحييد درجة الحموضة الليزوزومية وبالتالي إزالة تبريد مضان حبلا DExT fitzy. بعد ذلك ، يتم تفريغ حبلا DExT من الحويصلة إلى السطح الخارجي للخلية ، مما يتسبب في انتشار مضان ZI بشكل جانبي ويمكن قياس التألق الحويصلي تدريجيا للاستجابات المختلفة التي تسببت في الإصابة من الجسيمات الحالة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مراقبة قدرة الخلايا على الإصلاح من الإصابات البؤرية الكبيرة ومراقبة المقصورات والبروتينات تحت الخلايا التي تستجيب لعملية الإصلاح وتساعد فيها. يمكن إجراء مزيد من التجارب باستخدام العلامات الحيوية المختلفة أو المقصورات أو البروتين من أجل مراقبة الاستجابة للإصابة والمشاركة في إصلاح خلايا IND.