Name: قياسات المجهر بالفيديو داخل الحيوية لتدفق دم الشبكية في الفئران (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: تعلم قياس تدفق الدم الشبكي في الفئران باستخدام المجهر الضوئي بالفلورسنت والكريات الدقيقة المضيئة. هذه التقنية تتيح قياس أقطار الأوعية وسرعات الدم بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بتمويل من NIH EY017599 (NRH).

تمت مراجعة الإجراءات التي تنطوي على استخدام والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في LSUHSC-S وتم تنفيذها وفقا للمعايير التي حددتها المعاهد الوطنية للصحة.
1. تحضير حلول التروية
<ol>
	<li>Sonicate محلول مخزون 1٪ (بالوزن) من الكريات المجهرية بقطر 1.9 ميكرومتر.</li>
	<li>اسحب ~ 25-30 × 106 كريات فلورية خضراء (أي ~ 10 ميكرولتر من محلول المخزون) في حقنة 300 ميكرولتر. قم بتخفيف الكريات المجهرية عن طريق سحب 240 ميكرولتر إضافي من المحلول الملحي في المحقنة.</li>
	<li>تحضير محلول 50 ميكرولتر من 2 × 10 6 ديكستران فلوري ذو وزن جزيئي مذاب في محلول ملحي معقم ، مع جرعة محقونة في حدود 3-10 مجم / كجم. احتفظ بالديكستران مغطى بورق الألمنيوم حتى يحين وقت التسريب.</li>
</ol>
فئة 2. التخدير الحيواني وقنية الأوعية الدموية
<ol>
	<li>تخدير للإدخال الجراحي للقنيات الوعائية ولتحديد المواقع الثابتة تحت هدف المجهر. تتوفر العديد من خيارات بروتوكولات التخدير ، مع مزايا وعيوب مختلفة ، وتأثيرات محتملة على المعلمات الجهازية. من بين العديد من الخيارات المختلفة مزيج من الكيتامين (100-150 مجم / كغ) ، والزيلازين (10 مجم / كغ) ، وأسيبرومازين (2 مجم / كغ) ، أو مزيج من الكيتامين (50 مجم / كغ) والبنتوباربيتال (50 مجم / كغ). الإجراءات الموصوفة حادة وتنتهي بالقتل الرحيم الناجم عن جرعة زائدة من البنتوباربيتال (150 مجم / كغ) متبوعا ببضع الصدر. إدراج مسكن ليس ضروريا للإجراء النهائي.</li>
	<li>احتفظ بوسادة تدفئة أسفل لبقية التجربة.</li>
	<li>حافظ على رطوبة العينين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات أثناء عمليات الإدخال الجراحية اللاحقة للقنيات الوعائية.</li>
	<li>قم بإعداد قنية الأوعية الدموية للحقن اللاحقة لمتتبعات الفلورسنت. يتم وضع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم (على سبيل المثال ، 0.28 مم القطر الداخلي ؛ 0.61 مم القطر الخارجي) على طرف إبرة حقنة ، مع قطع الطرف الحاد للإبرة مسبقا عن طريق الانحناء ذهابا وإيابا باستخدام مرقئ.</li>
	<li>املأ حقنة وأنبوب بمحلول ملحي هيبارين (25 وحدة / مل).</li>
	<li>احلق جانبا واحدا من أسفل البطن وقم بعمل شق لكشف الوريد الفخذي.</li>
	<li>لتقنب الوريد الفخذي ، اربط الوعاء بخياطة 5.0 ، وقم بعمل شق جزئي في الوعاء (حوالي نصف قطر الوعاء) ، وأدخل الأنبوب في الوعاء ، وقم بتأمين الأنبوب مع خياطة مربوطة حول القسم المقن.</li>
</ol>
3. التحضير للفحص المجهري داخل الحيوية
<ol>
	<li>قم بتوسيع حدقة العين بقطرة من محلول تروبيكاميد للعيون 1٪ متبوعا بقطرة 2.5٪ محلول هيبروميلوز للعين.</li>
	<li>غطي العين بغطاء زجاجي مقاس 5 مم.</li>
	<li>ضع على لوح زجاجي ، والذي سيتم وضعه تحت هدف المجهر للمجهر المستقيم. ضع شاشا جراحيا بشكل استراتيجي أسفل الرأس للسماح بمحور مباشر عبر الهدف إلى الشبكية المركزية والقرص البصري.</li>
	<li>ركز من خلال المجهر على القرص البصري ، وابحث عن القرص بهدف 4X منخفض الطاقة واستخدم مرشح الفلورسين.</li>
</ol>
4. ضخ الكريات المجهرية الفلورية لقياس السرعات
<ol>
	<li>باستخدام هدف 4X ، ركز على شبكية العين مع وجود القرص البصري في وسط مجال الرؤية.</li>
	<li>قم بغرس محلول الكرة المجهرية الفلورية بمعدل 250 ميكرولتر / دقيقة / كجم.</li>
	<li>قم بتسجيل شبكية العين القابلة للعرض بالفيديو حول القرص البصري ، باستخدام وقت تعرض الكاميرا ~ 8 مللي ثانية.</li>
	<li>أوقف ضخ الكرة المجهرية عند تسجيل مدة كافية من الفيديو (1-2 دقيقة) ؛ من المحتمل أن يظل بعض محلول الكرة المجهرية غير مستخدم.</li>
</ol>
5. ضخ علامة البلازما الفلورية لقياس الأقطار
<ol>
	<li>باستخدام هدف 4X ، ركز على شبكية العين مع وجود القرص البصري في وسط مجال الرؤية.</li>
	قم <li>بغرس المحلول المحضر من ديكستران الفلورسنت في الوريد الفخذي كبلعة تزيد عن ~ 5 ثوان ، أثناء تسجيل الفيديو. سيساعد هذا الفيديو في تحديد هوية الشرايين مقابل الأوردة ، مع انتشار الشرايين أولا. قم بتنفيذ هذه الخطوة مع ضبط وقت التعرض للكاميرا على ~8 مللي ثانية، على الرغم من أن وقت التعريض الدقيق ليس حرجا.</li>
	<li>قم بالتبديل إلى هدف 10X ووقت تعريض ضوئي من 20 إلى 40 مللي ثانية لتحسين الدقة لفيديو كل من الشرايين 4-7 و4-7 وريد في شبكية العين السطحية. ركز على (وتسجيل الفيديو) ما يقرب من ربع واحد من شبكية العين القابلة للعرض في كل مرة ، مع وجود مركز القرص البصري في أحد أركان مجال الرؤية. يجب بذل محاولة لتقليل الوقت الذي يضيء فيه ضوء المجهر الأنسجة لتقليل احتمالية السمية الضوئية الناجمة عن الضوء /الصبغة 17.</li>
</ol>
6. تحليل الفيديو
<ol>
	<li>باستخدام مقياس ميكرومتر ، قم بمعايرة نظام الفيديو لتحويل ميكرومتر / بكسل.</li>
	<li>باستخدام برنامج معالجة الصور ، قم بتشغيل الفيديو المسجل.</li>
	<li>من فيديو ضخ بلعة ديكستران الفلورسنت ، حدد الشرايين مقابل الأوردة.</li>
	<li>لكل من 4-7 شرايين و 4-7 وريد مسجلة بهدف 10X ، قم بقياس الأقطار المملوءة بالفلورسنت ديكستران ، بمتوسط 5 مقاييس للقطر لكل وعاء على طول الطول القابل للعرض.</li>
	<li>لكل من الشرايين والأوردة نفسها ، قم بقياس طول خط الكريات المجهرية الفلورية ، باستخدام 10 خطوط كريية مجهرية متتالية في كل وعاء لتجنب تحيز الاختيار. اقسم أطوال الخطوط على وقت التعرض لحساب سرعة الكرة المجهرية ، على سبيل المثال ، 160 ميكرومتر / 8 مللي ثانية = 20 ميكرومتر / مللي ثانية = 2 سم / ثانية. متوسط 10 سرعات لكل سفينة.</li>
	<li>احسب معدل التدفق الحجمي لكل سفينة بالمعادلة التالية: التدفق = متوسط السرعة × π × القطر2/4.</li>
	<li>اجمع معدلات التدفق الشرياني ، وبشكل منفصل معدلات التدفق الوريدي ، للحصول على تدفق الدم الكلي للشبكية.</li>
</ol>

<ol><li>Wang, L., Fortune, B., Cull, G., McElwain, K. M., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microspheres+method+for+ocular+blood+flow+measurement+in+rats%3A+size+and+dose+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Microspheres method for ocular blood flow measurement in rats: size and dose optimization.</a> Exp. Eye Res. 84, 108-117 (2007).</li>
<li>Wang, L., Grant, C., Fortune, B., Cioffi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+and+choroidal+vasoreactivity+to+altered+PaCO2+in+rat+measured+with+a+modified+microsphere+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal and choroidal vasoreactivity to altered PaCO2 in rat measured with a modified microsphere technique.</a> Exp. Eye Res. 86, 908-913 (2008).</li>
<li>Pouliot, M., Hetu, S., Lahjouji, K., Couture, R., Vaucher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+retinal+blood+flow+by+kinin+B%281%29+receptor+in+Streptozotocin-diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of retinal blood flow by kinin B(1) receptor in Streptozotocin-diabetic rats.</a> Exp. Eye Res. 92, 482-489 (2011).</li>
<li>Pouliot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+regional+measurement+of+retinal+blood+flow+in+rats+using+N-isopropyl-p-%5B14C%5D-iodoamphetamine+%28%5B14C%5D-IMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative and regional measurement of retinal blood flow in rats using N-isopropyl-p-[14C]-iodoamphetamine ([14C]-IMP).</a> Exp. Eye Res. 89, 960-966 (2009).</li>
<li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+and+quantitative+imaging+of+retinal+blood+flow+in+rats+with+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric and quantitative imaging of retinal blood flow in rats with optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 2, 579-591 (2011).</li>
<li>Zhi, Z., Cepurna, W. O., Johnson, E. C., Morrison, J. C., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+intraocular+pressure+on+changes+of+blood+flow+in+the+retina%2C+choroid%2C+and+optic+nerve+head+in+rats+investigated+by+optical+microangiography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Opti.+Express%22%5BJournal%5D)">Impact of intraocular pressure on changes of blood flow in the retina, choroid, and optic nerve head in rats investigated by optical microangiography.</a> Biomed. Opti. Express. 3, 2220-2233 (2012).</li>
<li>Li, G., De La Garza, B., Shih, Y. Y., Muir, E. R., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+blood-flow+MRI+of+retinitis+pigmentosa+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Layer-specific blood-flow MRI of retinitis pigmentosa in RCS rats.</a> Exp. Eye Res. 101, 90-96 (2012).</li>
<li>Muir, E. R., Renteria, R. C., Duong, T. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+ocular+blood+flow+as+an+early+indicator+of+diabetic+retinopathy+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduced ocular blood flow as an early indicator of diabetic retinopathy in a mouse model of diabetes.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53, 6488-6494 (2012).</li>
<li>Wright, W. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+attenuates+early+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel attenuates early streptozotocin-induced constriction of arterioles in the mouse retina.</a> Exp. Eye Res. 86, 528-536 (2008).</li>
<li>Lee, S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Losartan+and+ozagrel+reverse+retinal+arteriolar+constriction+in+non-obese+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Losartan and ozagrel reverse retinal arteriolar constriction in non-obese diabetic mice.</a> Microcirculation. 15, 379-387 (2008).</li>
<li>Wright, W. S., Messina, J. E., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+diabetes-induced+retinal+vasoconstriction+by+a+thromboxane+receptor+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of diabetes-induced retinal vasoconstriction by a thromboxane receptor antagonist.</a> Exp. Eye Res. 88, 106-112 (2009).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+streptozotocin-induced+microvascular+changes+in+the+mouse+retina+with+the+endothelin+receptor+A+antagonist+atrasentan%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Attenuation of streptozotocin-induced microvascular changes in the mouse retina with the endothelin receptor A antagonist atrasentan.</a> Exp. Eye Res. 91, 670-675 (2010).</li>
<li>Yadav, A. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tempol+on+diabetes-induced+decreases+in+retinal+blood+flow+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of tempol on diabetes-induced decreases in retinal blood flow in the mouse.</a> Curr. Eye Res. 36, 456-461 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Yadav, A. S., Leskova, W., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+20-HETE+attenuates+diabetes-induced+decreases+in+retinal+hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of 20-HETE attenuates diabetes-induced decreases in retinal hemodynamics.</a> Exp. Eye Res. 93, 108-113 (2011).</li>
<li>Wright, W. S., Yadav, A. S., McElhatten, R. M., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+blood+flow+abnormalities+following+six+months+of+hyperglycemia+in+the+Ins2%28Akita%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal blood flow abnormalities following six months of hyperglycemia in the Ins2(Akita) mouse.</a> Exp. Eye Res. 98, 9-15 (2012).</li>
<li>Lee, S., Morgan, G. A., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozagrel+reverses+streptozotocin-induced+constriction+of+arterioles+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Ozagrel reverses streptozotocin-induced constriction of arterioles in rat retina.</a> Microvasc. Res. 76, 217-223 (2008).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Sial, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phototoxicity+of+fluorescent+dye-labeled+albumin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Differential phototoxicity of fluorescent dye-labeled albumin conjugates.</a> Microcirculation. 6, 205-213 (1999).</li>
<li>Tadayoni, R., Paques, M., Gaudric, A., Vicaut, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte+and+leukocyte+dynamics+in+the+retinal+capillaries+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte and leukocyte dynamics in the retinal capillaries of diabetic mice.</a> Exp. Eye Res. 77, 497-504 (2003).</li>
<li>Walsh, M. K., Quigley, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+fluorescence+imaging+of+individual+retinal+ganglion+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse fluorescence imaging of individual retinal ganglion cells in mice.</a> J. Neurosci. Methods. 169, 214-221 (2008).</li>
<li>Shahidi, M., Wanek, J., Blair, N. P., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+mapping+of+chorioretinal+vascular+oxygen+tension+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional mapping of chorioretinal vascular oxygen tension in the rat.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50, 820-825 (2009).</li>
<li>Hughes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the rat.</a> Vis. Res. 19, 569-588 (1979).</li>
<li>Remtulla, S., Hallett, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+schematic+eye+for+the+mouse%2C+and+comparisons+with+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">A schematic eye for the mouse, and comparisons with the rat.</a> Vis. Res. 25, 21-31 (1985).</li>
<li>Schmucker, C., Schaeffel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+biometry+in+the+mouse+eye+with+low+coherence+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo biometry in the mouse eye with low coherence interferometry.</a> Vis. Res. 44, 2445-2456 (2004).</li>
<li>Mulivor, A. W., Lipowsky, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-+and+ischemia-induced+shedding+of+venular+glycocalyx%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation- and ischemia-induced shedding of venular glycocalyx.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1672-1680 (2004).</li>
<li>Harris, N. R., Whatley, J. R., Carter, P. R., Specian, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venular+constriction+of+submucosal+arterioles+induced+by+dextran+sodium+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Venular constriction of submucosal arterioles induced by dextran sodium sulfate.</a> Inflamm. Bowel Dis. 11, 806-813 (2005).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يمكن تطبيق هذه التقنية من الفحص المجهري بالفيديو داخل الحيوية ليس فقط على الفئران ، ولكن أيضا على الفئران. يعتمد هذا البروتوكول على عدة افتراضات فقط ، ولكنه يقتصر على الاستخدام تحت التخدير ومع اتساع حدقة العين كما وصفناه. الافتراضات والقيود الأخرى هي كما يلي:
1. افتراض الحد الأدنى من خطأ التكبير البصري الناتج عن الطبيعة الانكسارية للعين. كما وصفه آخرون18-20 ، فإن طريقة ملء الفراغ بين القرنية والغطاء بطبقة سائلة من محلول العيون تقاوم القوة الانكسارية للقرنية. أي تكبير...

الشبكية هي واحدة من أكثر الأنسجة نشاطا في الجسم ، وبالتالي تتطلب إمدادات دم سخية. تلبي دورتان منفصلتان هذا الطلب: الدورة الدموية المشيمية للجزء الخارجي من شبكية العين ، والدورة الدموية في الشبكية للجزء الداخلي من شبكية العين. تعد فحوصات تروية الشبكية ضرورية لفهم الآليات المرضية وعواقب اعتلال الشبكية السكري ، واعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين ، وانسداد الشريان أو الوريد ، والسكتة الدماغية. تم استخدام عدة طرق لتحديد تدفق الدم في الشبكية ، مع كل تقنية لها مزاياها وعيوبها وقيودها وافتراضاتها. من بين هذه التقنيات ضخ الكريات المجهرية بقطر 7-8 ميكرومتر التي تستقر في الشرايين قبل الشعيراتالدموية 1،2 ، والتصوير الذاتي الكمي3،4 ، والتصوير المقطعي للاعتلال الوعائي البصري والتماسك البصري5،6 ، والتصوير بالرنين المغناطيسي7،8 ، والفحص المجهري بالفيديوداخل الحيوية 9-16. تشمل مزايا هذا الأخير التصور المباشر لأوعية الشبكية وتدفقها ، والاعتماد على عدد قليل من الافتراضات البسيطة فقط ، والقدرة على تحمل التكاليف للمختبرات التي تحتوي على مجهر مضان مع كاميرا فيديو متصلة. في الدراسات السابقة للفحص المجهري بالفيديوداخل الحيوية 9-16 ، تم استخدام ديكستران الفلورسنت كعلامة بلازما ، وتم استخدام خلايا الدم الحمراء المصنفة بالفلورسنت (من متبرع) كعلامات سرعة. في البروتوكول الحالي ، يتم استخدام الكريات المجهرية ذات التصنيف الفلوري بقطر 1.9 ميكرومتر ، بدلا من خلايا الدم الحمراء ، لقياس السرعة ، مع هذا التغيير الذي يلغي الحاجة إلى متبرع بخلايا الدم.

<table><tbody><tr><td>مختبرات القارات المجهرية الفلورية</td><td></td><td>FS04F / 10584 (أخضر)</td><td></td></tr> <tr><td>مجسات</td> <td>جزيئية عالية الوزن الجزيئي الفلوري ديكستران</td><td>D-7137 (أخضر) ؛ D-7139 (أحمر)</td><td></td></tr> <tr><td>نظام المجهر</td><td>نيكون</td><td>Eclipse E600FN + المرفقات 4X</td><td></td></tr><tr><td>موضوعي</td><td>نيكون</td><td>خطة فلور 4X</td><td>الفتحة العددية 0.13 ؛ مسافة العمل 17.2 مم</td></tr><tr><td>10X موضوعي</td><td>خطة نيكون</td><td>10X</td><td>الفتحة العددية 0.25 ؛ مسافة العمل 10.5 مم</td></tr><tr><td>محلول العيون تروبيكاميد</td><td>Bausch Lomb</td><td>1٪ Tropicamide</td><td></td></tr><tr><td>محلول طب العيون Hypromellose</td><td>HUB Pharmaceuticals</td><td>2.5٪ Goniovisc</td><td></td></tr><tr><td>برنامج معالجة الصور</td> جامعة <td>كاليفورنيا سان فرانسيسكو فالي لاب</td><td>مايكرو مدير</td><td></td></tr><tr><td>كاميرا فيديو رقمية للفحص</td><td>المجهري القياسات</td><td>الضوئية CoolSnap ES</td><td>1392 × 1040 بكسل دقة ؛ حجم البكسل 6.45 × 6.45 & م</td></tr></tbody></table>

قياسات المجهر بالفيديو داخل الحيوية لتدفق دم الشبكية في الفئران

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

يمكن أن تساهم التغيرات في تدفق الدم في الشبكية في أمراض العين والخلل البصري أو تكون نتيجة لها. لذلك ، يمكن أن يساعد القياس الكمي للتروية المتغيرة في البحث في آليات أمراض الشبكية. يمكن استخدام الفحص المجهري بالفيديو داخل الحيوية لمتتبعات الفلورسنت لقياس أقطار الأوعية الدموية وسرعات مجرى الدم في الأوعية الدموية الشبكية ، وتحديدا الشرايين المتفرعة من الشريان الشبكي المركزي والأوردة المؤدية إلى الوريد الشبكي المركزي. يمكن حساب معدلات تدفق الدم من الأقطار والسرعات ، مع مجموع التدفق الشرياني ، والتدفق الوريدي بشكل منفصل ، مما يوفر قيما لإجمالي تدفق الدم في الشبكية. تصف هذه الورقة والفيديو المرتبط بها طرق تطبيق هذه التقنية على الفئران ، والتي تشمل 1) تحضير العين للفحص المجهري داخل الحيوية للحيوان المخدر ، 2) التسريب الوريدي للكريات المجهرية الفلورية لقياس سرعة مجرى الدم ، 3) التسريب الوريدي لديكستران فلوري عالي الوزن الجزيئي ، للمساعدة في التصور المجهري للأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، 4) استخدام كاميرا مجهر رقمي للحصول على مقاطع فيديو لشبكية العين المنفوخة ، و 5) استخدام برامج معالجة الصور لتحليل الفيديو. يمكن استخدام نفس التقنيات لقياس معدلات تدفق الدم في الشبكية في الفئران.

الشكل 1 تُظهر لقطات مفردة من فيديو تجربة، مع عرض الألواح من A إلى D ومن F إلى I لآثار كريات مجهرية فلورية مُلتقطة باستخدام عدسة موضوعية 4X وزمن تعريض 8 مللي ثانية (مع دمج بكسلات 2 × 2 لتقليل حجم ملف الفيديو). الشكل 1E يُظهر اتجاه الأوعية الشبكية في الأجزاء الأخرى من الشكل. لن تحتوي كل إطار من أطر الفيديو بالضرورة على خط مضيء واضح التركيز؛ ومع ذلك، قد تحتوي بعض الإطارات على عدة خطوط مضيئة يمكن استخدامها في التحليل (مثلاً اللوحات C وD وG وH وI). في هذه التجربة، كانت معظم البقع الم...

يمكن استخدام الفحص المجهري داخل الحيوية في لتصور وقياس أقطار الأوعية الدموية في الشبكية ، وسرعات مجرى الدم ، وتدفق الدم الكلي في الشبكية.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس تدفق الدم في الشبكية في الفئران. يتم تحقيق ذلك عن طريق غرس الكريات المجهرية الفلورية أولا من خلال الوريد الفخذي المقنن للفأر المخدر. الخطوة الثانية هي تسجيل الكريات المجهرية المتدفقة عبر أوعية شبكية الفأر بالفأر.بعد ذلك ، قم بغرس ديكستران الفلورسنت عبر الوريد الفخذي والتقط الفيديو أثناء تدفقه عبر الأوعية الشبكية. تتمثل الخطوة الأخيرة في قياس سرعات الكرة المجهرية وأقطار الأوعية الدموية من مقاطع الفيديو المسجلة لحساب تدفق الدم في الشبكية. تتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية في القدرة على قياس تدفق الدم في شبكية العين بدقة باستخدام مجهر مضان قياسي.يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال شبكية العين ، مثل مدى مساهمة التغيرات في تدفق الدم في اعتلال الشبكية السكري. على الرغم من أننا سنعرض هذه التقنية في شبكية الفأر. يمكن استخدام الطريقة العامة في الأنسجة الأخرى وكذلك في الفئران.قم بسحب محلول مخزون 1٪ من الكريات المجهرية بقطر 1.9 ميكرون ، وسحب 10 ميكرولترات من محلول المخزون إلى حقنة سعة 300 ميكرولتر ، ثم قم بتخفيف الكريات المجهرية عن طريق سحب 240 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم في المحقنة. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 50 ميكرولتر من ديكستران الفلورسنت ، مذاب في محلول ملحي معقم كاف بحيث تكون الجرعة المحقونة خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام. ثم قم بتغطية الديكستران بورق الألمنيوم حتى يحين وقت الاندماج.بعد تخدير واختبار التخدير الكافي عن طريق قرصة السحب ، ضع وسادة تدفئة أسفل. حافظ على رطوبة العينين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات. بعد ذلك ، قم بقطع الطرف الحاد لإبرة المحقنة عن طريق ثنيها ذهابا وإيابا باستخدام المرقئ.ثم ضع أنبوب البولي إيثيلين بطول 20 سم على الطرف الضعيف للإبرة واملأ الأنبوب بالمحلول الملحي الهباريني. الآن قم بإعداد 25 وحدة لكل مليلتر محلول ملحي هيبارين. املأ المحقنة بالمحلول الملحي الهباريني بعد حلق جانب واحد من أسفل البطن ، وقم بعمل شق سنتيمتر واحد عند الانتقال بين البطن والساق لكشف الوريد الفخذي.ثم اربط الوعاء القريب تماما من اتساع الوريد الفخذي بخياطة خماسية T. بعد ذلك ، قم بعمل شق جزئي بنصف قطر الوعاء وأدخل الأنبوب في الوعاء على طول محوره بزاوية 20 إلى 30 درجة فوق الأفقي. قم بتأمين الأنبوب مع ربط الخيط حول القسم المقن.لتحضير للفحص المجهري ، قم بتوسيع بؤبؤ العين بقطرة واحدة من محلول العين الاستوائي بنسبة 1٪ ، متبوعا بقطرة 2.5٪ محلول عيون مفرط ميلوس. ثم قم بتغطية العين بزلة غطاء زجاجي بطول خمسة ملليمترات. بعد وضع على لوح زجاجي ، ضع اللوح أسفل هدف المجهر من المجهر المستقيم.ضع شاشا جراحيا تحت الرأس للسماح بمحور مباشر عبر الهدف إلى الشبكية المركزية والقرص البصري. باستخدام هدف الفوركس ومرشح الفلورسين ، ركز على القرص البصري ، مع إبقائه في وسط مجال الرؤية. بعد ذلك ، قم بغرس محلول الكرة المجهرية الفلورية في الوريد الفخذي بمعدل 250 ميكرولتر في الدقيقة لكل كيلوغرام.باستخدام وقت تعرض الكاميرا لمدة ثمانية مللي ثانية ، يسجل الفيديو شبكية العين القابلة للعرض حول القرص البصري. أوقف التسريب المجهري. بعد ثلاث دقائق ، قد يظل بعض محلول الكرة المجهرية غير مستخدم.قم بنقع المحلول المحضر من ديكستران الفلورسنت في الوريد الفخذي كبلعة على مدى خمس ثوان. لبدء قياس أقطار أوعية الشبكية ، حافظ على التركيز على القرص البصري بهدف الفوركس. ثم قم بالتبديل إلى هدف 10 × وتعرض 40 مللي ثانية.حان الوقت لتحسين دقة الفيديو من أربعة إلى سبعة شرايين وأربعة إلى سبعة أماكن في شبكية العين السطحية. ركز على ربع واحد من شبكية العين القابلة للعرض في كل مرة مع الحفاظ على مركز القرص البصري في أحد أركان مجال الرؤية. سجل كل ربع لمدة 10 إلى 15 ثانية فقط لتقليل احتمالية السمية الضوئية.الآن ، قم بتحليل الفيديو لتحديد معدلات التدفق وإجمالي تدفق الدم في الشبكية. باستخدام مقياس ميكرومتر ، قم بمعايرة نظام الفيديو لتحويل الميكرونات إلى بكسل باستخدام برنامج معالجة الصور. قم بتشغيل الفيديو المسجل من فيديو ضخ بلعة ديكستران الفلورسنت.تحديد الشرايين والشقيق التي تثمر الشرايين قبل الشراغ. قم بقياس أقطار كل من الشرايين والشقوق المملوءة بالديكستران الفلوري. بمتوسط خمسة مقاييس للقطر لكل وعاء على طول العرض.ثم لكل من الشرايين والشفرات نفسها ، قم بقياس طول خط الكريات المجهرية الفلورية باستخدام 10 خطوط مجهرية متتالية في كل وعاء لتجنب تحيز الاختيار. الآن اقسم أطوال الخطوط على وقت التعرض لحساب سرعة الكرة المجهرية ومتوسط 10 سرعات لكل سفينة. بعد ذلك ، احسب معدل التدفق الحجمي لكل سفينة.التدفق يساوي متوسط السرعة مضروبا في pi في مربع القطر مقسوما على أربعة. أخيرا ، قم بجمع معدلات التدفق الشرياني ومعدلات التدفق الآلي بشكل منفصل للحصول على إجمالي تدفق دم الشبكية. تفعيلك. فيما يلي إطارات مفردة من الفيديو تظهر كريات فلورية 1.9 ميكرون تظهر على شكل خطوط أثناء تحركها عبر أوعية الشبكية.تظهر الصورة الوسطى اتجاه أوعية الشبكية في اللوحات الأخرى من الشكل. لاحظ أن بعض الإطارات لها خطوط متعددة. في هذه التجربة ، يتراوح طول معظم خطوط الفلورسنت من 120 إلى 170 ميكرون ، وهو ما يتوافق مع سرعات تتراوح من 1.5 إلى 2.1 سم في الثانية.هذه الصور التالية مأخوذة من ضخ بلعة ديكستران الفلورسنت. في الإطارات الأولى ، ترى الشرايين ممتلئة بالديكستران. تمتلئ الأرجل بعد أن تمر الصبغة عبر الأسرة الشعرية.تظهر هنا واحدة من 10 صور تستخدم لقياس أقطار السفينة. تراوحت أقطار الشرايين من 47 إلى 55 ميكرون وتراوحت أقطار الفساد من 50 إلى 65 ميكرون. يوضح هذا الشكل قياسات التدفق من تجربة سابقة تم فيها حقن كل من الكريات المجهرية الفلورية وخلايا الدم الحمراء الفلورية في نفس الفأر لتحديد ما إذا كان سيتم العثور على سرعات وتدفقات الأوعية الدموية المتشابهة.كما يشير هذا الشكل ، كانت السرعات والتدفقات المقاسة متشابهة جدا بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تقليل إثارة الفلورسنت للأصباغ عن طريق الحد من وقت فتح مصراع المجهر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام الأصباغ الفلورية لقياس تدفق الدم في الشبكية في الفئران.

intravital-video-microscopy-measurements-of-retinal-blood-flow-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

قياسات ميكروسكوب الفيديو داخل الحياة لتدفق الدم في الشبكية في الفئران

Intravital المجهري لمتابعة الأحداث الزمانية والمكانية الدورة الدموية والتهابات في دوران الأوعية الدقيقة حنوني.

Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

intravital المجهري للالمشمرة دوران الأوعية الدقيقة الماوس M. عروض فريدة وموحدة جيدا في نموذج الجسم الحي لتحليل الطرفية نخاع العظم الخلايا الجذعية الهجرة.

حيوي داخلي المجهري للدوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة ماوس لتحليل الهجرة الجذعية الطرفية المحمولة

تقدم هذه المقالة طريقة مفصلة للقياس الديناميكي والقياس الكمي لسرعة تدفق الدم داخل الأوعية الدموية الفردية لالأوعية الدموية في كبد الفأر باستخدام التصوير المجهري داخل الحيوية مع منهجية محددة للحصول على الصور وتحليلها.

حيوي داخلي المجهري التصوير الكبد التالية<em&gt; الليشمانيا</em&gt; العدوى: تقييم كبدي ديناميكا الدم

التصوير الخلية الحية من خلايا الدم المسمى في الدورة الدموية العين يمكن أن توفر معلومات عن التهاب ونقص التروية في اعتلال الشبكية السكري والانحطاط البقعي المرتبط بالعمر. ويرد وصف بروتوكول لتسمية خلايا الدم وصورة الخلايا المسمى في الدورة الدموية في شبكية العين.

صبغة الفلورسنت وصفها من كرات الدم الحمراء والكريات البيض لدراسة ديناميات التدفق في الماوس دوران الشبكية

العديد من أمراض العين تهدد الرؤية ترتبط باختلال ميكروفيسيلس الشبكية. ولذلك، من المهم قياس الاستجابات arteriole الشبكية للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة. توضح هذه المقالة بروتوكول مفصل للماوس arteriole الشبكية العزلة والتحضير لتقييم آثار المواد فعال في الأوعية على قطر الأوعية الدموية.

خطوات الإعداد لقياس مفاعليه في الماوس الشرايين الشبكية السابقين فيفو

يوفر نهج نافذة الأوعية المفتوحة باستخدام مقتفيات الفلورسنت دقة كافية لقياس تدفق الدم في القوقعة الصناعية (CoBF). تسهل هذه الطريقة دراسة التغيرات الهيكلية والوظيفية في CoBF في الفئران في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.

قياس تدفق الدم الغريلي في قوقعة الفئران باستخدام نافذة الأوعية المفتوحة والمجهر الفلوري داخل الحيوية

التصوير في الجسم الحي هو أداة قوية لدراسة علم الأحياء في الصحة والمرض. يصف هذا البروتوكول التصوير عبر الحدقتين لشبكية الفأر باستخدام مجهر قياسي ثنائي الفوتون. كما أنه يوضح اختلافا في طرق التصوير الحي لتسمية مجموعات خلوية متعددة من شبكية العين.

تصوير الفوتون عبر الحدقة في الجسم الحي لشبكية العين الفأرية

يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لإعداد وتلطيخ التألق المناعي للحوامل المسطحة لشبكية العين لدى الفئران وتحليلها. يتم وصف استخدام تصوير الأوعية الدموية قاع العين بالفلوريسين (FFA) لجراء الفئران ومعالجة الصور بالتفصيل أيضا.

مراقبة النمو الديناميكي لأوعية الشبكية في نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين

تصف هذه المقالة فحص بقع اللكتين الراسخ والقابل للتكرار لمستحضرات الشبكية الكاملة والبروتوكولات المطلوبة للقياس الكمي لمعلمات الأوعية الدموية التي يتم تغييرها بشكل متكرر في اعتلال الشبكية التكاثري وغير التكاثري.

القياس الكمي للمعلمات الوعائية في شبكية العين الكاملة للفئران ذات اعتلال الشبكية غير التكاثري والتكاثري

هنا ، نقدم ثلاثة بروتوكولات لتحليل البيانات لتصوير الأوعية بالفلوريسئين (FA) والتصوير المقطعي للتماسك البصري (OCT) في دراسة انسداد الوريد الشبكي (RVO).

في الجسم الحي قراءات إصابة الأوعية الدموية في شبكية الفأر لتعزيز التكاثر

الأوعية الدموية في شبكية الفأر مثيرة للاهتمام بشكل خاص في فهم آليات تشكيل نمط الأوعية الدموية. يقيس هذا البروتوكول تلقائيا قطر أوعية شبكية الفأر من صور قاع تصوير الأوعية الفلورية على مسافة ثابتة من القرص البصري.

قياس قطر وعاء الشبكية من صور تصوير الأوعية الفلورية للفأر

تعلم قياس تدفق الدم الشبكي في الفئران باستخدام المجهر الضوئي بالفلورسنت والكريات الدقيقة المضيئة. هذه التقنية تتيح قياس أقطار الأوعية وسرعات الدم بدقة عالية.

قياسات المجهر بالفيديو داخل الحيوية لتدفق دم الشبكية في الفئران

استكشف المزيد من الفيديوهات