Name: جمع وتحليل نبات الأرابيدوبسيس اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-23T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: تعلم جمع إفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام طريقة EDTA الميسرة لتحليل المستقلبات والبروتينات والحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة الإشارات النباتية واستجابات الإجهاد.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم NSF-IOS المنحة الوطنية # 1144391 إلى البنك السعودي الهولندي.

1. إعداد النباتات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن نبتت بذور نبات الأرابيدوبسيس مباشرة على التربة أو على لوحات MS. تنمو النباتات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع الإضاءة 12 ساعة (22 ° C يوم، 15 ° C يلة 14). محطات المياه مرة واحدة إلى مرتين في الأسبوع. استخدام الدرج السفلي للسقي، لا محطات المياه من أعلى؛ تسمح الأدراج لتجف قبل إعادة سقي. التأكد من النباتات جيدا المائية في وقت الحصاد. </li></ol> 2. إعداد حلول والأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K-EDTA 2 الحل: إصنع ملي K-EDTA 2 الحل الحل 100 الأوراق المالية، والتي يمكن أن تبقى في الثلاجة. في يوم جمع وتمييع الحل 04:59 (جزء واحد EDTA حل، وأربعة أجزاء من الماء) للحصول على 20 ملي K-EDTA حل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كوب أو طبق بتري (قطر 7-15 سم) في منتصف الطريق مع ملي 20 K-EDTA حل 2. إذا جمع عينات من العلاجات المختلفة (لالسابقينمراقبة وافرة والنباتات المجهدة الملح أو المورثات مختلفة)، وإعداد أطباق منفصلة لكل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء العدد المرغوب فيه من 1.7 مل أنابيب رد فعل مع 1.4 مل من 20 ملي K-EDTA حل 2. ملء عدد متساو من أنابيب رد فعل مع 1.4 مل تعقيمها الماء منزوع الأيونات أو ميليبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المناشف الورقية على مقاعد البدلاء لوضع النباتات على؛ الحصول على واحد شفرة حلاقة جديدة وضعت على قفازات. </li></ol> 3. جمع من اللحاء الإفرازات (كما هو مبين في المخطط الانسيابي في الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريدة الحصاد يترك من أربع إلى ست محطات من العمر الأسبوع بالقص مع شفرة حلاقة في قاعدة قريبة سويقات إلى وسط ريدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على الفور يترك في الأطباق التي تحتوي على 20 ملي K-EDTA 2. تأكد من المغمورة نهاية قطع من سويقات في الحل (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جمع 15 ورقة (حوالي 3-4 النباتات)، كومة الأوراق بلطف على أعلى من كل هذه ر الأخرىيتم محاذاة قبعة قطع أعناق مع بعضها البعض. Recut قاعدة أعناق (حوالي 1 ملم)، ونقل على الفور الأوراق إلى واحدة من أنابيب رد فعل مع ملي 20 K-EDTA حل 2. الأوراق تناسب أسهل إذا كانت وتوالت ارتفاعا طفيفا. تجنب الضغط على الأوراق في لأن هذا قد يسبب إصابة الخلايا، وبالتالي، ويؤدي إلى جمع المحتوى الخلية ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذا كانت هناك حاجة المزيد من المواد، وتغطي بلطف عينات مع منشفة ورقية مبللة. استخدام مجموعة جديدة من الأطباق إذا لجمع عينات من العلاجات أو الأنماط الجينية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم وضع جميع العينات في أنابيب رد فعل، وجمع الإفرازات إما في الظلام أو في الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في الظلام، خط الكلمة من طبق ضحل كبير مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في طبق وإما غطاء مع مناشف ورقية مبللة أو وضعها في عودة البلاستيك الأسود مع الشقوق للتهوية. وضع الإعداد كامل في خزانة أو غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في ضوء، خط الجزء السفلي من وعاء شبكي واضحة مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في حاوية وإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، إزالة الأوراق بلطف من الحاوية وأنابيب رد فعل ويغسل جيدا بالماء المقطر، منزوع الأيونات أو ميليبور لإزالة جميع EDTA. هذه الخطوة يخدم ثلاثة أغراض: (1) أنه يزيل EDTA إلى الضرر التقليل إلى الخلايا، (2) أنه يلغي تدخل من EDTA مع SDS-PAGE واللوني، و (3) يزيل أي المركبات التي تراكمت من قطع / التالفة الخلايا. نقل على الفور الى رد فعل أنابيب معدة تحتوي على الماء تعقيمها والعودة إلى حاويات جمع مرطب لجمع الإفرازات. في هذه المرحلة، إضافة ريبونوكلياز المانع إذا احتاج الافرازات لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. اختياري: يمكن إضافة مثبطات بروتين إذا كان المطلوب تحليل البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وقت جمع المقصود، سحب وDISCAطريق الأوراق واللحاء تجميد الإفرازات في السائل N 2 لاستخدامها مرة أخرى. اذا كانت هناك حاجة التخزين الموسعة، يجفد العينات وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة نبات الأرابيدوبسيس، يمكن بالفعل يتم الكشف عن نواتج الأيض بعد مجموعة من الإفرازات لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، وجمع ل5-8 ساعة من المستحسن إذا تم التخطيط تحليل مكونات أقل وفرة. للنباتات الكبيرة مثل بريلا، ينصح مرات جمع أطول (8 ساعات). الافرازات التي تم جمعها من 15 ورقة هو عادة ما يكفي لحارة واحدة على SDS-PAGE هلام (البروتينات)، لاستخراج مرنا، GC-MS (السكريات ونواتج الأيض). لتحليل الدهون ويوصى تجميع عينات 2-3 (30-45 ينضح يترك) ويؤدي إلى نتائج أكثر وضوحا. </li></ol> 4. التحليل اللاحق (للحصول على الفيديو نظهر فقط 4.4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البروتين، عينة resuspend في 15 ميكرولتر المياه و 30 ميكرولتر العازلة Lämmli والحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور بسرعة إلى أسفل أي عrecipitates وتحميل عينة كامل الصعود إلى SDS-PAGE هلام (45 جيوب التحميل ميكرولتر). يجب أن تكون ملطخة العينات مع Coomassie صمغي أو البقع الحساسة الأخرى منذ فرة البروتين منخفض جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للسكر وتحليل المستقلب صغيرة، إضافة derivatizing كلاء لالعينة المجففة كما هو موضح في الأدب 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرنا يمكن تحليلها باستخدام RT-PCR، ميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الدهون على الفور تجمع 2-3 العينات وقسم ضد الكلوروفورم: ميثانول (1:1) في غطاء الدخان كما يلي: إضافة مبلغ مساو من الكلوروفورم: ميثانول إلى كل عينة، دوامة لمدة بضع ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 400 ز س. جمع (العضوية) مرحلة القاع في أنبوب زجاجي مع غطاء تفلون وتكرار التقسيم مع مرحلة أعلى ثلاث مرات أكثر. تجفيف المراحل العضوية المشتركة تحت تيار من N 2 وتقدم إلى مزيد من التحليل (طبقة رقيقة اللوني: TLC 14، 37؛ السائل اللوني الكتلة الطيفي: LC-MS 14). </li></ol>

<ol><li>Balachandran, S., Xiang, Y., Schobert, C., Thompson, G. A., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins+from+Cucurbita+maxima+and+Ricinus+communis+have+the+capacity+to+traffic+cell+to+cell+through+plasmodesmata%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity to traffic cell to cell through plasmodesmata.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 14150-14158 (1997).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Aston, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55, 1473-1481 (2004).</li>
<li>Behmer, S. T., Grebenok, R. J., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+sterols+and+host+plant+suitability+for+a+phloem+feeding+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Ecology%22%5BJournal%5D)">Plant sterols and host plant suitability for a phloem feeding insect.</a> Functional Ecology. , (2010).</li>
<li>Benning, U. F., Tamot, B., Guelette, B. S., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+aspects+of+phloem-mediated+long-distance+lipid+signaling+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Front.Plant.Sci%22%5BJournal%5D)">New aspects of phloem-mediated long-distance lipid signaling in plants.</a> Front.Plant.Sci. 3, 53>(2012).</li>
<li>Chen, S., Petersen, B. L., Olsen, C. E., Schulz, A., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-distance+phloem+transport+of+glucosinolates+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PlantPhysiol%22%5BJournal%5D)">Long-distance phloem transport of glucosinolates in Arabidopsis.</a> PlantPhysiol. 127, 194-201 (2001).</li>
<li>Corbesier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FT+protein+movement+contributes+to+long+distance+signalling+in+floral+induction+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">FT protein movement contributes to long distance signalling in floral induction of Arabidopsis.</a> Science. 316, 1030-1033 (2007).</li>
<li>Dafoe, N. J., Gowen, B. E., &Constabel, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thaumatin-like+proteins+are+differentially+expressed+and+localized+in+phloem+tissues+of+hybrid+poplar.BMC%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar.BMC.</a> Plant Biology. 10, (2010).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> The Plant Journal. 55, 746-759 (2008).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J. Exp. Bot. 53, 631-637 (2002).</li>
<li>Fisher, D. B., Wu, Y., Ku, M. S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnover+of+soluble-proteins+in+the+wheat+sieve+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Turnover of soluble-proteins in the wheat sieve tube.</a> Plant Physiol. 100, 1433-1441 (1992).</li>
<li>Gaupels, F., Buhtz, A., Knauer, T., Deshmukh, S., Waller, F., van Bel, A. J. E., Kogel, K. -H., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+aphid+stylectomy+for+analyses+of+proteins+and+mRNAs+in+barley+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Adaptation of aphid stylectomy for analyses of proteins and mRNAs in barley phloem sap.</a> J Exp Bot. 59, 3297-3306 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6, 896-909 (2006).</li>
<li>Guelette, B. S., Chamberlin, B., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. Indications of lipids/lipid signaling in the phloem exudates of Arabidopsis thaliana and Perilla ocymoides. Benning, C., Ohlroggeeds, J. Proceedings of the 17th International Symposium of Plant, , Michigan State University. Lansing, USA. 92-95 (2007).</li>
<li>Guelette, B. S., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+lipids+and+lipid-binding+proteins+in+phloem+exudates+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Identification of lipids and lipid-binding proteins in phloem exudates from Arabidopsis thaliana.</a> J. Exp. Bot. 63, 3603-3616 (2012).</li>
<li>Haebel, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time+of+flight+mass+spectrometry+peptide+mass+fingerprints+and+post+source+decay%3A+a+tool+for+the+identification+and+analysis+of+phloem+proteins+from+Cucurbita+maxima+Duch.+separated+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry peptide mass fingerprints and post source decay: a tool for the identification and analysis of phloem proteins from Cucurbita maxima Duch. separated by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Planta. 214, 3328(2001).</li>
<li>Hayashi, H., Fukuda, A., Suzui, N., Fujimaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+the+sieve+element-companion+cell+complexes%3A+their+detection%2C+localization+and+possible+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proteins in the sieve element-companion cell complexes: their detection, localization and possible functions.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 489-496 (2000).</li>
<li>Hoffmann-Benning, S., Gage, D. A., McIntosh, L., Kende, H., Zeevaart, J. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+peptides+in+the+phloem+sap+of+flowering+and+non-flowering+Perilla+and+lupine+plants+using+microbore+HPLC+followed+by+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of peptides in the phloem sap of flowering and non-flowering Perilla and lupine plants using microbore HPLC followed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Planta. , 216-2140 (2002).</li>
<li>Jorgensen, R. A., Atkinson, R. G., Forster, R. L., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Based+Information+Superhighway+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA-Based Information Superhighway in Plants.</a> Science. 6, 1486-1487 (1998).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 767-774 (2006).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating-agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of phloem exudation from cut petioles by chelating-agents.</a> Plant Physiol. 53, 96-103 (1974).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+pumpkin+phloem+proteome+provides+functional+insights+into+angiosperm+sieve+tube+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the pumpkin phloem proteome provides functional insights into angiosperm sieve tube function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8, 343-356 (2009).</li>
<li>Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+plant+biology%3A+role+of+phloem+long-distance+macromolecular+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative plant biology: role of phloem long-distance macromolecular trafficking.</a> Annu.Rev. Plant Biol. 57, 203-232 (2006).</li>
<li>Madey, E., Nowack, L. M., Thompson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+lipid+in+phloem+sap+of+canola%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of lipid in phloem sap of canola.</a> Planta. 214, 625-634 (2002).</li>
<li>Maeda, H., Song, W., Sage, T. L., DellaPenna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherols+playa+crucial+role+in+low-temperature+adaptation+and+phloem+loading+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Tocopherols playa crucial role in low-temperature adaptation and phloem loading in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 18, 2710-2732 (2006).</li>
<li>Marentes, E., Grusak, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+determination+of+low-molecular-weight+proteins+in+phloem+sap+using+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Mass determination of low-molecular-weight proteins in phloem sap using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 49, 903-911 (1998).</li>
<li>Prado, E., Tjallingii, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+evidence+for+local+reduction+of+aphid-induced+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+ofInsect+Science%22%5BJournal%5D)">Behavioral evidence for local reduction of aphid-induced resistance.</a> Journal ofInsect Science. 7, 48(2007).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Development. 126, 4405-4419 (1999).</li>
<li>Ryabov, E. V., Robinson, D. J., Taliansky, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant+virus-encoded+protein+facilitates+long-distance+movement+of+heterologous+viral+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A plant virus-encoded protein facilitates long-distance movement of heterologous viral RNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1212-1217 (1999).</li>
<li>Schilmiller, A. L., Howe, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+signaling+in+the+wound+response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Systemic signaling in the wound response.</a> Curr.Opin. Plant Biol. 8, 369-377 (2005).</li>
<li>Thompson, G. A., Goggin, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomics+and+functional+genomics+of+plant+defence+induction+by+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Transcriptomics and functional genomics of plant defence induction by phloem-feeding insects.</a> J. Exp. Bot. 57, 755-766 (2006).</li>
<li>Thorpe, M. R., Ferrieri, A. P., Herth, M. M., Ferrieri, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2811%29C-imaging%3A+methyl+jasmonate+moves+in+both+phloem+and+xylem%2C+promotes+transport+of+jasmonate%2C+and+of+photoassimilate+even+after+proton+transport+is+decoupled%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">(11)C-imaging: methyl jasmonate moves in both phloem and xylem, promotes transport of jasmonate, and of photoassimilate even after proton transport is decoupled.</a> Planta. (11), 226-541 (2007).</li>
<li>Truman, W., Bennett, M. H., Kubigsteltig, I., Turnbull, C., Grant, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+systemic+immunity+uses+conserved+defense+signaling+pathways+and+is+mediated+by+jasmonates%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis systemic immunity uses conserved defense signaling pathways and is mediated by jasmonates.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 1075-1080 (2007).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Knoblauch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sieve+element+and+companion+cell%3A+the+story+of+the+comatose+patient+and+the+hyperactive+nurse%5BTitle%5D)+AND+%22Aust.+J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sieve element and companion cell: the story of the comatose patient and the hyperactive nurse.</a> Aust. J. Plant Physiol. 27, 477-487 (2000).</li>
<li>van Bel, A. J. E., Hess, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexoses+as+phloem+transport+sugars%3A+the+end+of+a+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Hexoses as phloem transport sugars: the end of a dogma.</a> J. Exp. Bot. 59, 261-272 Forthcoming.</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31, 189-197 (2002).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65, 1795-1804 (2004).</li>
<li>Wang, Z., Benning, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+thaliana+Polar+Glycerolipid+Profiling+by+Thin+Layer+Chromatography+%28TLC%29+Coupled+with+Gas-Liquid+Chromatography+%28GLC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC).</a> J. Vis. Exp. (49), e2518(2011).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> J. Exp. Bot. 57, 729-737 (2006).</li>
<li>Yoo, B. C., Kragler, F., Varkonyi-Gasic, E., Haywood, V., Archer-Evans, S., Lee, Y. M., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systemic+small+RNA+signaling+system+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A systemic small RNA signaling system in plants.</a> Plant Cell. 16, 1979-2000 (2004).</li>
<li>Zhang, B., Tolstikov, V., Turnbull, C., Hicks, L. M., Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+metabolome+and+proteome+suggest+functional+independence+of+dual+phloem+transport+systems+in+cucurbits%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Divergent metabolome and proteome suggest functional independence of dual phloem transport systems in cucurbits.</a> PNAS USA. 107, 13532-13537 (2010).</li>
<li>Zhang, C., Yu, X., Ayre, B. G., Turgeon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Origin+and+Composition+of+Cucurbit+%22Phloem%22+Exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Origin and Composition of Cucurbit "Phloem" Exudate.</a> Plant Physiology. 158, 1873-1882 (2012).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phloem-Delivered+RNA+Pool+Contains+Small+Noncoding+RNAs+and+Interferes+with+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Phloem-Delivered RNA Pool Contains Small Noncoding RNAs and Interferes with Translation.</a> Plant Physiol. 150, 378-387 (2009).</li>
</ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

جمع EDTA-سهلت من اللحاء الإفرازات بسيطة جدا، ويحتاج الحد الأدنى من المعدات، وينطبق على معظم النباتات. وعموما، هذا الأسلوب يمتد القدرة على تحليل الإفرازات اللحاء من أكثر الأنواع. على الرغم من أن الافرازات غير المخفف، فمن السهل أن جمع العديد من عينات مختلفة أو من العديد من النباتات لزيادة لكمية كبيرة من المواد. هذا ثم يسمح للكشف عن المركبات الرواية التي هي في وفرة منخفضة جدا وولاها يمكن تجاهلها. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع النباتات متعددة ويعمل كما هو موضح لتلك المذكورة في هذه المخطوطة. إذا يتم استكشاف أنواع جديدة، واثنين من الجوانب التي قد تحتاج إلى تعديل هي عدد الأوراق المستخدمة والوقت من نضح. في معظم الحالات، ينبغي أن يكون نضح 5-8 ساعة مناسبة. للتأكد من استخدام هذه الطريقة للحصول على الأنواع النباتية الجديدة، الافرازات يحتاج إلى جمع واحد أو أكثر من تحليل لاحقة كما هو موضح في البروتوكول جزء 4 نeeds التي يتعين القيام بها. اعتمادا على شدة إشارة لوحظ، قد تحتاج إلى جمع حجم زيادتها. بشكل عام، سوف الدهون والبروتين تحليل تتطلب المزيد من المواد من السكر والأيض تحليل منذ السابق هي أقل وفرة في الإفرازات اللحاء. لأن جمع الافرازات EDTA-سهلت ينطوي على السطوح قطع فضلا عن تأثير المدمر المحتمل لEDTA، عدة نقاط يجب النظر فيها: (1) بعد الحضانة ساعة واحدة مع EDTA، وأعناق يجب غسلها جيدا. هذا يزيل أي المركبات التي تم الحصول عليها من خلايا الجرحى فضلا عن EDTA نفسها، والتي يمكن أن تضر خلايا أو تتداخل مع الاستخراج. (2) بحاجة الضوابط الإيجابية والسلبية التي ستدرج لضمان وتستمد البيانات التي تم الحصول عليها من اللحاء SAP وليس من خلايا المصاب (انظر الخطوات الحاسمة أدناه). (3) اللحاء SAP لا تحتوي على العديد من الإنزيمات، والتي يمكن أن تكون نشطة خلال جمع الافرازات. وبالتالي، في بعض الحالات، قد يكون من المفيد جمع FOR كميات مختلفة من الوقت. (4) منذ الأسلوب تشارك نضح في الماء، وهو الكمي المطلق من المركبات غير ممكن. الخطوات الحاسمة: إن مفتاح نجاح استخدام هذا الأسلوب هو استخدام الحذر أثناء التعامل مع العينة أن لا تجرح أي الخلايا وكذلك استخدام الضوابط المناسبة (انظر المرجع 14). واحد للتحكم مناسبة هو مجموعة من الإفرازات اللحاء دون معالجة مسبقة مع EDTA. في هذه الحالة سوف اللحاء عزل نفسه ويمكن جمع أي الافرازات. سوف يتم الكشف عن أي تلويث المركبات القادمة من خلايا الجرحى هنا. ومن شأن التحكم الثاني يكون تحليل السكريات في الافرازات. في نبات الأرابيدوبسيس، ينبغي أن يكون السكروز السائد الأيض داخل اللحاء SAP، مع الفركتوز إلى نسبة السكروز من 1:04 حتي 01:08 (المرجع 8، 14). لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مثبط ريبونوكلياز هو ضروري. وبالإضافة إلى ذلك، تحكم إيجابية من describ سابقاإد مرنا اللحاء المترجمة (UBC9: اليوبيكويتين انزيم التصريف 9، At4g27960، 8، 14) والسيطرة السلبية من على سبيل المثال مرنا بلاستيدات الخضراء (Rubisco LSU) هي الأفضل. لأن الافرازات تحتوي على خمائر نشطة، وينصح دورة الوقت لإجراء تغييرات في التشكيل الجانبي متأكد من اللحاء ليست ببساطة بسبب الاختلافات في وقت جمع. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام مثبطات بروتين. ومع ذلك، فإن المحققين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، أن الافرازات التي تم جمعها سوف تتركز والتي سوف تتركز إلى حد كبير أي مركبات المضافة. والخطوة الثانية الحاسمة ضمن البروتوكول هو recutting من سويقات تحت EDTA. هذه الخطوة تخدم غرضا مزدوجا: أولا، أنه يزيل أي لوحات غربال مختومة في حين منع تشكيل جديد المقابس وبالتالي السماح للتدفق الحر للاللحاء SAP. الثاني، فإنه يزيل فقاعة التجويف في الخشب ولدت في حين خفض وبالتالي يسمح للنقل الخشب. حجم الخفض الثاني تعتمدق على النباتات المستخدمة. في النباتات مع أعناق أكبر ينبغي أن يكون عدة مليمترات (ما يصل إلى 1 سم) فوق قطع الأول، في النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس، مم 1-2 تكفي. ويمكن استخدام هذه الطريقة تؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة في الإفرازات اللحاء التي كان يمكن أن يشير، والآثار التنموية أو الطب الحيوي. وقد دفع ذلك أكثر نظرة متعمقة في إشارة الدهون لمسافات طويلة، والذي كان حقل القليل المدروسة ضمن علوم النبات ويرجع ذلك إلى عدم الوصول إلى اللحاء.

النباتات لا يمكن أن تتحرك إلى الفرار من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، كان لديهم لتطوير آليات للكشف عن الضغوط البيئية، وانتزاع إرسال إشارة ذات الصلة في جميع أنحاء المصنع، وضبط التنمية وفقا لذلك. توجد نظم النقل اثنين لتوزيع المياه والمواد الغذائية وغيرها من المركبات (إشارات). الأول هو الخشب؛ الذي ينقل عادة الماء والمعادن تناولها من قبل الجذور في جميع أنحاء المصنع. والثاني هو اللحاء. لقد تغيرت وجهة نظر اللحاء من استيعاب نظام النقل بسيطة لقناة لRNA والبروتين، والفيروسات، والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. انها تلعب دورا هاما في استيعاب ونقل المواد الغذائية، استجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، وكذلك في نمو وتطور النبات. ويطلق الآن عليها اسم &quot;طريق المعلومات السريع&quot; من النبات 18. ويتكون اللحاء من عدة أنواع من الخلايا: لحمة اللحاء، وكذلك رفيق المتخصصة CELLS وعناصر غربال. العنصر غربال هو موقع الحركة لمسافات طويلة. للسماح لتدفق طولية دون عائق، وعناصر غربال مفقودة معظم العضيات وكذلك النوى والتي يعتقد أنها تحتوي في أحسن الأحوال محدودة الآلات متعدية 21، 33. ويعتقد أن الخلايا رفيق تجميع البروتينات وغيرها من المركبات التي تسافر في تيار اللحاء. ثم يتم نقل هذه المركبات إلى عنصر غربال عبر رابطات هيولية ويمكن أن تعمل كإشارات لمسافات طويلة 4،16. يمكن العثور على عدة مجموعات من المركبات في الإفرازات اللحاء: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السكريات وغالبا ما تكون المنتجات من التمثيل الضوئي ويتم نقلها على أنها &quot;تحمل الطاقة&quot; الجزيئات إلى أجزاء أخرى من النبات لتخزين أو لبنات البناء. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تعمل أيضا كمضاد للتجميد أو كما يشير المركبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تكون موجودة في البروتينات الإفرازات اللحاء. وهي تشمل الإنزيمات الأيضية ولكن أيضا قد يشير إلى وظيفة. واحد أمثلجنيه من البروتين والتي هي بمثابة إشارة التنموية هي مزهرة موضع T البروتين، وهو ما يشير إلى تحريض المزهرة وكذلك اقتطاع ورقة الموسمية في النباتات. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأحماض النووية موجودة في الإفرازات اللحاء في شكل مرنا، الرناوات الصغيرة ومتناهية الصغر، والرنا الفيروسي. تظهر أن تشارك إلى حد كبير في إشارة 27، 28، 39. في نفس الوقت، وقد لوحظت الريباسي وtRNAs لجميع الأحماض الأمينية تقريبا في اللحاء SAP من القرعيات 42. تظهر على أن يتم تحويلها بشكل انتقائي في النظام أنبوب غربال. وtRNAs تظهر التعديلات الضرورية نظرا لقدرته على نقل الأحماض الأمينية إلى الجهاز متعدية. حتى الآن، بدلا من المشاركة في الترجمة، ويبدو أنها تمنع هذه العملية. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تكون بمثابة مصدر سيتوكينين أو إشارة حالة التمثيل الغذائي للنبات 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم العثور على الأحماض الدهنية، oxylipins، والدهون الأخرى أيضا في اللحاء الإفرازات 3، 13، 14، 23. JasmoNIC حامض، تتحرك oxylipin من خلال اللحاء كجزء من الاستجابة للعدوى الممرض 22، 29، 31، 32. في حين أن دور معظم الدهون اللحاء لا يزال غير واضح، وبعضها من المرجح أن يشير ظيفة 4. </li></ul> ويتمثل التحدي في العمل مع اللحاء النبات تكمن في قدرته على عزل نفسه عند اصابة. هناك أربعة أساليب رئيسية تستخدم لجمع الإفرازات اللحاء، ولكنها تعمل فقط في الأنواع حدد: 1) في القرعيات أنه من الممكن الحصول على كميات معقولة من اللحاء الافرازات من خلال تخفيضات للسويقات. بمجرد إزالة الانخفاض الأولي مع التلوث من الخلايا المصاب، فمن الممكن الحصول على كميات كبيرة من الذهب الخالص معقول اللحاء SAP 1، 15. ومع ذلك، مع زيادة وقت جمع، هذه الافرازات يثخن، مما يجعلها غير صالحة على نحو متزايد لنهج اللوني السائل (غير منشورة). المنشورات الأخيرة تشير إلى أن تبعا للأنواع، ويستمد هذا اللحاء SAP من eitheص حزمي (FP) أو extrafascicular اللحاء (EP) والتي، في حين أنها لا تحتوي على &quot;المحمول&quot; اللحاء SAP من العناصر غربال (FP)، بل هو أيضا عرضة للتلوث من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخشب 40، 41 . 2) والنهج الثاني هو الحصول على اللحاء SAP من خلال تخفيضات الضحلة أو ثقوب في الساق أو سويقات. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح في الترمس 17، 25، 36 القرعيات، والكرنب napus 12. هنا التلوث من الخلايا المصاب هو الحد الأدنى والإفرازات نقية جدا. ومع ذلك، النباتات تحتاج إلى أن تكون صحية وجيدة تسقى منذ انها صعبة للغاية لثقب انتقائي فقط العناصر غربال. إذا رصدت سفن الخشب، ويوجه كل الافرازات في مجرى الخشب. هذا يجعل طريقة غير مناسبة للنباتات مع أعناق أو سيقان هشة للغاية أو lignified للغاية. 3) stylectomy المن المن يسمح لإدراج مرود بهم في عناصر غربالن إزالة أولا بأول مع ليزر. وناضح اللحاء SAP من خلال ما تبقى من مرود 2، 9، 10، 35، 38. من الناحية النظرية، أي النباتات التي يمكن أن تصاب المن يمكن استخدامها لهذا النهج. ومع ذلك، فإن معظم الدفيئة أو مديري غرفة نمو لا يعتمد استخدام الممرض. وبالإضافة إلى ذلك، المن إدخال العديد من البروتينات في اللحاء مع لعابهم 19، 33. وهذا يؤدي إلى إعادة برمجة النسخي محدودة 30 و لديه القدرة على تغيير التركيبة اللحاء 26. 4) وصف الأسلوب هنا هو نضح EDTA-سهلت من اللحاء SAP. هذا الأسلوب يستخدم EDTA لمنع تسرب من اللحاء 20. EDTA يخلب كا 2 + الأيونات التي ستشارك خلاف ذلك في العمليات التي ختم اللحاء. بينما EDTA يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا 30، وقد استخدمت عدة مجموعات هذا الأسلوب، ويلاحظ أي تأثير سلبي من تركيزات EDTA من 10 ملم إلى 20 ملم على التركيب الدقيق خلية أو على phloeم التحميل والنقل 5، 24. للحد من أي تأثير ضار وكذلك التدخل من EDTA مع اللوني وهلام الكهربائي، يتم نقل النباتات الى الماء بعد 1 ساعة، ويستخدم فقط في جزء لاحق من الافرازات 14. وهكذا، بدلا من نضح في EDTA، وexudated اللحاء في الماء (EDTA-سهلت نضح). بل هو مستقيم إلى الأمام، وانخفاض التكلفة، ومنخفضة التقنية طريقة لجمع الإفرازات اللحاء. الحصول على اللحاء SAP بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والدهون، والرنا واستخدمت بنجاح في العديد من النباتات. في حين قد تم تنفيذ كمية محدودة من التجارب في ذوات الفلقة 11، الأسلوب يبدو أن أكثر ملاءمة لdicots (بريلا 17، 20، نبات الأرابيدوبسيس 8، 13، 14، الحور 7). مجموعة من الإفرازات أن تحدث في بيئة رطبة لتجنب فقدان الإفرازات من خلال النتح. اعتمادا على النبات، الحضانة في EDTA ل1-2 ساعات هوكافية لمنع ختم العناصر اللحاء / غربال. ويمكن بعد ذلك تحدث جمع في الماء. وهذا له فائدة من منع التأثير السلبي EDTA لديه على بنية الخلية والاستقرار. كما أنه يزيل التدخل من EDTA مع طرق مثل HPLC أو SDS-الصفحة. ويرد عليه كما ينطبق على نبات الأرابيدوبسيس. للنباتات أكبر، الحضانة في EDTA والافرازات مجموعات لابد من زيادتها، ويتم تنفيذها في الأكواب بدلا من 1.7 في أنابيب رد فعل مل.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&nbsp;</td></tr>طبق <tr><td>بتري زجاجي ضحل أو بلاستيكي (7-15 سم)</td> <td>PYREX أو Corning</td><td></td><td>أي طبق نظيف ضحل سيعمل</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>حاويات مفتوحة فقط في غطاء الدخان</td></tr><tr><td>الميثانول</td><td>JTBaker</td><td>9070-03</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>أنابيب غطاء المسمار</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>أنابيب غطاء المسمار</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td> <td>&nbsp ؛</td></tr><tr><td>أنابيب Eppendorf</td><td>Denville</td><td>C2170</td> <td>& nbsp ؛</td></tr></tbody></table>

جمع وتحليل<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب edta-سهلت

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

اللحاء المصنع هو ضروري لنقل لمسافات طويلة من (الصور) تستوعب وكذلك من الإشارات نقل الإجهاد الحيوية أو غير الحيوية. أنه يحتوي على السكريات والأحماض الأمينية والبروتينات والحمض النووي الريبي، والدهون والأيض الأخرى. بينما هناك اهتمام كبير في فهم تركيبة ووظيفة اللحاء، ودور كثير من هذه الجزيئات، وبالتالي، أهميتها في تطوير المصنع والإجهاد استجابة لديه لم يتحدد بعد. واحد عائقا أمام تحليل اللحاء تكمن في حقيقة أن الأختام اللحاء نفسه على جرح. ونتيجة لذلك، فإن عدد النباتات التي يمكن الحصول عليها اللحاء SAP محدودة. أسلوب واحد الذي يسمح مجموعة من الإفرازات اللحاء من عدة أنواع النباتات دون معدات المضافة هي اللحاء جمع الافرازات EDTA التي يسهلها وصفها هنا. في حين أنه من السهل الاستخدام، وأنها لا تؤدي إلى جرح الخلايا والرعاية يجب أن يؤخذ لإزالة محتويات الخلايا التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الضوابط لإثبات نقاء الافرازاتضرورية. لأنها تحلب بدلا من التحصيل المباشر من اللحاء SAP (غير ممكن في كثير من الأنواع) يمكن أن يحدث الكمي النسبي فقط من محتوياته. وميزة هذا الأسلوب مقارنة مع الآخرين هو أنه يمكن استخدامها في العديد من الأنواع النباتية العشبية أو الخشبية (بريلا، نبات الأرابيدوبسيس، الحور، الخ) ويتطلب الحد الأدنى من المعدات والتدريب. أنه يؤدي إلى كميات كبيرة من الإفرازات معقولة التي يمكن استخدامها لتحليلها لاحقا من البروتينات، والسكريات، والدهون، والحمض النووي الريبي والفيروسات ونواتج الأيض. انها بسيطة بما فيه الكفاية أنه يمكن أن تستخدم في كل من البحث وكذلك في مختبر التدريس.

لقد أصبح واضحا خلال السنوات القليلة الماضية أن تعقد اللحاء SAP قد يكون الجواب على السؤال عن كيفية إرسال إشارات متفاوتة النباتات التنموية والإجهاد للاستجابة المثلى. باستخدام EDTA-سهلت اللحاء نضح قد توفر فرصة لتحليل الإفرازات اللحاء من النباتات التي ليست مناسبة للمناهج أخرى ولكن قد يكون من مصلحة اقتصادية أو الفسيولوجية. هذا الأسلوب يسمح للحصاد ما يكفي من اللحاء الإفرازات لتحديد البروتينات اللحاء المترجمة وكشف عن تغيرات في مستوياتها استجابة لتطوير أو الإجهاد (الشكل 3). كما يظهر في الشكل، هي في وفرة البروتينات منخفضة جدا، وحتى الآن، ومستوى مرتفع بما يكفي لتجارب لاحقة باستخدام البروتينات LC-MS/MS أو تحليل لطخة غربية. النتائج في القرعيات تشير إلى أن قطع من جذع يؤدي إلى اختلال التوازن إمكانات المياه وتدفق المياه واللاحقةالملوثات المحتملة من apoplast 41. بعد جمع لمرات تتراوح 1-8 ساعات لا يؤثر على البروتين الشخصي اللحاء / تكوين في نبات الأرابيدوبسيس (. فقط المبلغ المطلق يختلف Guelette وآخرون)، وكمية البروتين التي تم جمعها وهذا النمط من البروتينات الموجودة تختلف بين الأنواع (نبات الأرابيدوبسيس: في؛ بريلا، لين أنا وNI) والعلاجات (بريلا نمت في أطوال مختلفة اليوم، لين أنا وNI). ونتيجة لذلك الإشارات البروتينية يمكن تصور، التي تم تحديدها، واتباعها. ويمكن أيضا أن تحدد مرنا ومتناهية الصغر الرنا في الإفرازات اللحاء بواسطة هذه الطريقة. ومع ذلك، مع العلاج ريبونوكلياز المانع ضروري لمنع تدهور مرنا خلال الفترة الممتدة نضح. منذ العناصر غربال لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء وظيفية، Rubisco صغيرة أو كبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء أو RbcL، على التوالي) mRNAs ويمكن استخدام ضوابط السلبية، في حين أن المعروف اللحاءالمترجمة مرنا مثل انزيم اليوبيكويتين-التصريف يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 4). وبالمثل، السكريات او نواتج صغيرة يمكن تحليلها باستخدام GC-MS أو LC-MS. وهنا تجدر الإشارة إلى أن الإفرازات اللحاء تحتوي على عدد كبير من الانزيمات وظيفية، بما في ذلك ما يقرب من مسار حال السكر كامل 12. وبالتالي، وذلك باستخدام العديد من النقاط الزمنية قد تكشف عن عمليات التمثيل الغذائي خلال جمع الافرازات. ويرد مثال في الشكل (5): في جميع الإفرازات، والسكروز هو المستقلب الأكثر وفرة، وهذا هو الأكثر وضوحا بعد جمع لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، بعد خمس ساعات وانخفاض طفيف في نسبة السكروز إلى سكر الفواكه. إذا تم جمعها نفس الافرازات لمدة ساعة واحدة وترك على مقاعد البدلاء لساعات الأربع المقبلة، يتم تقليل السكروز إلى الفركتوز نسبة إلى حد أكبر من ذلك بكثير، مما يدل على أن الانزيمات النشطة في اللحاء الإفرازات تؤدي إلى تدهور السكروز في غرفة TEMاحلرارة (لمزيد من التفسيرات الذروة انظر 14). وهذا يتفق مع النتائج التي اللحاء التحميل والنقل من الجزيئات من الخلايا رفيق في عناصر غربال قد يستمر خلال نضح حتى يفقد النظام حيويتها 34. نسبة الدهون في الإفرازات اللحاء، وبالتبعية، مما يشير إلى الدهون لمسافات طويلة هي مجال حديث نسبيا من الاهتمام في علوم النبات. ونظرا لنسبة الدهون في طبيعتها مسعور موجودة فقط في تركيزات منخفضة، وربما يكون منضما إلى جزيئات أخرى لالانحلالية. ومع ذلك، فإن نضح EDTA-سهلت يسمح لجمع مادة كافية لتصور (TLC؛ الشكل 6) وتحديد (LC-MS؛ الشكل 7) نسبة الدهون في اللحاء من العديد من الأنواع النباتية. كما يظهر في الشكل فمن الممكن لتحديد وفصل العديد من الأنواع الدهنية. LC-MS يسمح لتحديد الأنواع المختلفة الدهون ورصد التغيرات في ملامح من المادة الدهنية من احالمورثات NT أو العلاجات. وهذا يسمح لدراسة دور الدهون خلال تطوير المصنع والاستجابة للضغط النفسي. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. مخطط تدفق من مجموعة من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس أو بريلا. مسارات مختلفة تؤدي إلى منتجات نهائية مختلفة، والتي أشارت في الزرقاء. لإعداد الحمض النووي الريبي، ريبونوكلياز المانع (100 U / مل، روش) يضاف إلى الماء الذي يتم جمع الافرازات اللحاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. إعداد المواد اللازمة لجمع اللحاء الافرازاتأيون. يعرض إعداد جميع المواد اللازمة لخطوات بروتوكول 3،1-3،4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> الشكل 3 البروتينات الموجودة في اللحاء الإفرازات اثنين من الأنواع المختلفة النبات، نبات الأرابيدوبسيس (في) وبريلا (أنا وNI؛ أطوال اليوم مختلفة)؛ MW: الجزيئية علامة الوزن (حارة 2). تم فصل البروتينات باستخدام التدرج 10-20٪ SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. تحليلوجود مرنا لRubisco الصغيرة والكبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء وRbcL، على التوالي) وانزيم اليوبيكويتين-التصريف (UBC). وقد تم جمع مرنا من أوراق نبات الأرابيدوبسيس (L)، أعناق (P)، والإفرازات اللحاء (PH)، عكس النصوص المحولة ومحددة تصور باستخدام PCR. تم تعديل الرقم من Guelette وآخرون 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> الشكل (5). الشخصي GC-MS من اللحاء الإفرازات التي تم جمعها لكمية مختلفة من الأوقات. لاحظ كيف أن الكمية النسبية للتغيرات السكروز من المجموعة رقم 1 ساعة (A) إلى 5 ساعات من وقت جمع (B). الافرازات الشخصي بعد جمع لمدة 1 ساعة تليها &quot;الحضانة&quot; في غرفة<html> درجة الحرارة (RT) لمدة أربع ساعات (C). أوراق الملف الشخصي الأيض (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (6)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> الشكل (6). طبقة رقيقة اللوني مقارنة الدهون من بريلا (يسار) ونبات الأرابيدوبسيس أوراق (يمين) والإفرازات اللحاء. العلامات النجمية تشير الدهون محددة لالإفرازات اللحاء. DGDG: digalactosyldiacylglycerol؛ PG: phosphatidylglycerol؛ MGDG: monogalactosyldiacyglycerol، وجزء من شخصية عرض الدهون نبات الأرابيدوبسيس تم تعديل من Guelette وآخرون 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . NT &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> الرقم 7. صورة دهن من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس (كلوروفورم المرحلة) باستخدام LC-MS / وضع الأيونات السالبة. الرسوم البيانية في الجزء العلوي (متحولة، A) وأسفل (من النوع البري، B) تظهر الاختلافات في ملامح من المادة الدهنية بين اثنين من المورثات مختلفة (يشار إليه السهام). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر.

جمع وتحليل<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع نضح اللحاء من نبات Arabidopsis أو نباتات أخرى لتحليل محتوياته أو تأكيد وجود مركبات داخل تيار اللحاء. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق قطع البتلة وحضنها في EDTA البوتاسيوم لمنع سداد العناصر الغربالية. الخطوة الثانية هي غسل البتلة جيداً لإزالة أي EDTA متبقٍ قد يتداخل مع التحليل اللاحق ويؤدي أيضاً إلى تلف الخلايا أثناء التعرض طويل الأمد.بعد ذلك، يتم جمع نضحات الغشاء الخارجي (EM) المتدفقة في الماء. وتتمثل الخطوة النهائية في تحضير العينات للتحليل اللاحق بواسطة L-C-M-S-G-C-M-S والترحيل الكهربائي للهلام وكروματοغرافيا الطبقة الرقيقة. وفي نهاية المطاف، يمكن استخدام نضح الغشاء الخارجي المسهل بواسطة EDTA لتحليل وتأكيد محتويات الغشاء الخارجي مثل المستقلبات والدهون، أو البروتينات، أو RNAs.لا تستطيع النباتات الهروب من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، فهي تحتاج إلى أنظمة فعالة وسريعة للغاية لنقل الإشارات البيئية عبر أنحاء النبات والاستجابة لها من خلال تغيير عملية النمو. وأحد مسارات الإشارات هذه هو التدفق النباتي، والذي يعد تكوينه معقداً للغاية من حيث الفهم.نستخدم التخدير التدفقي المسهل بواسطة EDTA لجمع وتحليل محتويات التدفق. تم تطوير هذه الطريقة في الأصل في Perilla بواسطة king وزملاؤه، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لتناسب الأنواع الأخرى. ستقوم Elena و US، وهما طالبان في مرحلة البكالوريوس من مختبري، باستعراض هذا الإجراء قبل البدء في تنفيذه.قم بزراعة نباتات Arabidopsis لمدة تتراوح من أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع فترة ضوئية مدتها 12 ساعة في يوم الجمع. خفف محلول potassium EDTA بتركيز 100 millimolar المحضر مسبقاً بالماء للحصول على تركيز نهائي قدره 20 millimolar. بعد ذلك، املأ طبقين زجاجيين بقطر يتراوح من 7 إلى 15 سنتيمتر حتى المنتصف بمحلول potassium EDTA بتركيز 20 millimolar.عند الانتهاء، املأ أنابيب تفاعل سعة 1.7 milliliter بـ 1.4 milliliters من محلول potassium EDTA بتركيز 20 millimolar. ثم املأ عدداً مساوياً من أنابيب التفاعل بـ 1.4 milliliters من ماء millipore. بعد إخراج النباتات التي يتراوح عمرها من أربعة إلى ستة أسابيع من غرف النمو، يتم حصاد أوراق الوردية عن طريق قطعها بشفرة حلاقة عند قاعدة البتلة بالقرب من مركز الوردية.ضع الأوراق على الفور في الأطباق التي تحتوي على 20 millimolar من potassium EDTA بحيث يكون الطرف المقطوع من السويقة مغموراً في المحلول. وبمجرد جمع 15 ورقة من ثلاث إلى أربع نباتات، قم برصّها برفق فوق بعضها البعض بحيث تكون البتلات المقطوعة محاذية لبعضها. أعد قطع قاعدة البتلات وقم بلف الأوراق برفق.بعد ذلك، أدخل الأوراق الملفوفة برفق في أحد أنابيب التفاعل التي تحتوي على 20 millimolar من potassium EDTA لجمع الإفرازات. وفي مكان مظلم، قم بتبطين قاع طبق ضحل وكبير بمناشف ورقية مبللة. ضع الحامل الذي يحتوي على أنابيب التفاعل المملوءة بالأوراق في الطبق، ثم ضعه داخل كيس بلاستيكي أسود به فتحات للتهوية.ثم ضع التجهيزات بالكامل في خزانة لجمع الإفرازات. ضع مناشف ورقية مبللة في قاع حاوية شفافة من البلكسي غلاس. ضع الرف الذي يحتوي على أنابيب التفاعل المملوءة بالأوراق في الحاوية ثم أغلقها.بعد إخراج الحامل من الوعاء، وبعد مرور ساعة واحدة، يتم إخراج الأوراق من أنابيب التفاعل. تُغسل الأوراق جيداً بالماء المقطر لإزالة كل الـ EDTA. تُنقل الأوراق على الفور إلى أنابيب التفاعل التي تحتوي على مياه millipore، ثم تُعاد إلى الأوعية المرطبة لجمع الإفرازات بعد إزالة الحامل من الوعاء المرطب.بعد مرور خمس إلى ثماني ساعات، أخرج الأوراق من الأنابيب، ثم قم بتجميد نضوجات التدفق في نيتروجين سائل واحفظها في مجمد درجة حرارته 80- درجة مئوية. ولإجراء المزيد من التحاليل في اليوم التالي، قم بإذابة العينات تحضيراً لتحليل الدهون. بعد ذلك، اسحب عينتين إلى ثلاث عينات وأضف كمية متساوية من الكلوروفورم والميثانول إلى المحلول المشترك.قم برج المزيج باستخدام جهاز الـ Vortex لبضع ثوانٍ. بعد ذلك، قم بطرد العينة مركزياً لمدة أربع دقائق عند 400 gs. وعند الانتهاء، اجمع الطور العضوي السفلي في أنبوب زجاجي بعد تكرار عملية الفصل مع الطور العلوي ثلاث مرات إضافية، ثم جفف الأطوار العضوية المجمعة تحت تيار من النيتروجين، وأخضعها لتحليل كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) وتحليل LCMS.تتيح هذه الطريقة حصاد كمية كافية من إفرازات الفيم (phem) لتحديد البروتينات الموضعية في الفيم والتغيرات في مستوياتها استجابةً للنمو أو الإجهاد. وفي بعض الحالات، قد يرغب الباحثون في استخدام مثبطات البروتياز لمنع تحلل البروتينات. وكما هو موضح هنا، فإن البروتينات تتواجد بوفرة منخفضة جداً، ومع ذلك فإن مستواها مرتفع بما يكفي لإجراء تجارب البروتيوميات اللاحقة.تشير النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام LCMS أو تحليل western blot في القرعيات إلى أن قطع الساق يؤدي إلى اضطراب في توازن الجهد المائي، وما يتبع ذلك من تدفق للمياه والملوثات المحتملة من الأنسجة المحيطة. ومع ذلك، فإن الجمع في أوقات تتراوح من ساعة إلى ثماني ساعات لا يؤثر على ملف بروتين تدفق M وتكوينه في InOpSys. تختلف كمية البروتين المجمعة ونمط البروتينات الموجودة بين الأنواع والمعاملات.ونتيجة لذلك، يمكن تصور إشارات البروتين وتحديدها وتتبعها. كما يمكن تحديد mRNA وmicroRNAs في نضحات الفلوم باستخدام هذه الطريقة. ومع ذلك، فإن المعالجة بمثبطات الـ RNAs ضرورية لمنع تحلل MR.NA خلال فترة النضح الممتدة.بما أن العناصر C لا تحتوي على بلاستيدات خضراء وظيفية، فيمكن استخدام mRNAs الخاصة بـ rubis، أو الوحدة الفرعية الصغيرة أو الكبيرة كضوابط سلبية، بينما يمكن استخدام mRNA الموضع في pH flu m والمعروف مثل إنزيم ubiquitin conjugating كضابط إيجابي. وبالمثل، يمكن تحليل السكريات أو المستقلبات الصغيرة باستخدام GCMS أو LCMS. وتجدر الإشارة إلى أن إفرازات phem تحتوي على عدد كبير من الإنزيمات الوظيفية، بما في ذلك كامل مسار تحلل السكر تقريباً.وبناءً على ذلك، قد يكشف استخدام عدة نقاط زمنية عن العمليات الأيضية أثناء جمع الإفرازات. وفي جميع الإفرازات، يعد السكروز أكثر المستقلبات وفرة، ويظهر ذلك بوضوح أكبر بعد الجمع لمدة ساعة واحدة.ومع ذلك، بعد مرور خمس ساعات، تنخفض نسبة السكروز إلى الفركتوز بشكل طفيف. وإذا جُمعت الإفرازات نفسها لمدة ساعة واحدة ثم تُرِكت على طاولة المختبر لمدة أربع ساعات إضافية، فإن نسبة السكروز إلى الفركتوز تنخفض بدرجة أكبر بكثير. مما يشير إلى أن الإنزيمات النشطة في إفرازات الفيم تؤدي إلى تحلل السكروز في درجة حرارة الغرفة.بالإضافة إلى ذلك، فإن حقيقة أن الجمع المستمر لمدة خمس ساعات يظهر انخفاضاً طفيفاً فقط في نسبة السكروز إلى الفركتوز تتفق مع النتائج التي تشير إلى أن تحميل اللحاء ونقل الجزيئات من الخلايا المرافقة إلى عناصر الغربال قد يستمر خلال عملية النضح حتى يفقد النظام حيويته. وتعد الدهون في نضوجات اللحاء، وبالتالي إشارات الدهون بعيدة المدى، مجال اهتمام حديث نسبياً في علوم النبات. ونظراً لطبيعتها الكارهة للماء، تتواجد الدهون فقط بتركيزات منخفضة وقد تكون مرتبطة بجزيئات أخرى من أجل الذوبان.ومع ذلك، فإن النضح المُسهل بواسطة EDTA يسمح بجمع مادة كافية لتصور وتحديد التدفق والليبيدات من عدة أنواع نباتية. وكما هو موضح هنا، فمن الممكن فصل عدة أنواع من الليبيدات باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. كما تتيح تقنية LCMS تحديد أنواع مختلفة من الليبيدات ومراقبة التغيرات ضمن ملفات الليبيدات لمختلف الأنماط الجينية أو المعاملات.يتيح ذلك دراسة دور الدهون أثناء نمو النبات والاستجابة للإجهاد. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ثلاث ساعات فقط إذا نُفذت بشكل صحيح. ومع ذلك، فإننا نقترح أن تتراوح مدة الجمع لمعظم العينات من خمس إلى ثماني ساعات.في هذه الحالة، يُوصى ببدء حصاد الأوراق في وقت مبكر من الصباح. يمكن تعديل هذا الإجراء لنباتات أخرى، وقد يؤدي ذلك إلى اكتشاف أو تأكيد مركبات تدفق جديدة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر مراقبة الـ PDLs بدقة بعد الساعة الأولى لإزالة الـ EDTA، وعدم عصر الأوراق لمنع التلوث بمحتويات الخلايا الأخرى.بالإضافة إلى ذلك، فإن ارتداء القفازات يحمي أيضاً عيناتك من الملوثات التي قد تنتقل من جلدك. ولمنع التلوث، استخدم الضوابط المناسبة لعينات البروتين أو RNA أو المستقلبات. الضوابط المقترحة مدرجة في البروتوكول النصي. لقد أتاحت لنا هذه الطريقة اكتساب رؤى جديدة حول تكوين التدفق النباتي.تمكنا من تحديد عدة ليبيدات ضمن إفرازات النحل، والتي لم يكن من المتوقع وجودها في البيئة المائية لأرضية الخلية. وقد دفعنا ذلك، ونحن وآخرون، إلى تقديم مفهوم إشارات الليبيدات بعيدة المدى، والذي تطور الآن ليصبح مجالاً بحثياً جديداً ومثيراً في دراسات النحل.

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويجري التحقيق في الأساس الجزيئي للمكانية محددة ردود فيتوكروم استخدام النباتات المعدلة وراثيا التي تظهر الأنسجة والأعضاء القصور فيتوكروم محددة. عزل خلايا معينة العارضة التي يسببها استنزاف حامل اللون فيتوكروم التي الإسفار المنشط الخلية فرز تليها تحليلات ميكروأري يجري استخدامها لتحديد الجينات المسؤولة عن ردود فيتوكروم مكانية محددة.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

نحن هنا تصف طريقة قوية للتجزئة أغشية البلازما مصنع المنظفات في الأغشية القابلة للذوبان مقاومة والمنظفات يعتمد على خليط من غير المسماة في الجسم الحي بالكامل و15 N المسمى الثقافات خلية نبات الأرابيدوبسيس thaliana. يتم تطبيق هذا الإجراء للدراسات المقارنة البروتين لفهم العمليات الإشارة.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

السليلوز البلوري هو مكون مهم لجدار الخلية النباتية. ومع ذلك ، فإن القياس الكمي بدقة خلوية يمثل تحديا تقنيا.  هنا ، نبلغ عن استخدام تقنية الضوء المستقطب والمقاطع العرضية للجذور للحصول على معلومات عن تكوين جدار الخلية بدقة زمانية مكانية.

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

تنظم الساعة اليومية عن ثلث Transcriptome على نبات الأرابيدوبسيس، لكن نسبة الجينات التي تغذي مرة أخرى إلى ضبط الوقت ما زال مجهولا. نحن هنا تصور طريقة لتقييم بسرعة الظواهر الإيقاعية في أي خط متحولة من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام التصوير الانارة مراسل الإيقاعية أعرب عابر في جبلة مجردة.

تحليل سريع من الظواهر الإيقاعية في نبات الأرابيدوبسيس جبلة مجردة Transfected مع ساعة مراسل الفلورسنت

نقدم هنا بروتوكولا لتحليل تكوين البروتين البروتين الأصلي كبير: البروتين والبروتين: مجمعات الحمض النووي من الاغتصاب البذور الزيتية (نابوس باء) لحاء نضحة باستخدام نهج 3D polyacrylamide هلام التفريد (صفحة) يجمع بين الأزرق أصلي (BN) مع صفحتين يشوه متبوعاً بالهوية الجماعية والمطيافيه.

لحاء Sap أخذ العينات من كرنب نابوس 3D-صفحة من البروتين ومجمعات ريبونوكليوبروتين

نقدم بروتوكول للفحص السريع للعينات البيئية لإمكانات سيديروفوري المساهمة في التوافر البيولوجي المغذيات الدقيقة ودوران في النظم الأرضية.

الفحص سيديروفوري الفائق من العينات البيئية: زراعة الأنسجة، والتربة السائبة، وتربة Rhizosphere

قدمت هنا هو نهج phosphoproteomic، وهي وقف والذهاب تلميح استخراج القائمة على phosphoproteomic، الذي يوفر إنتاجية عالية وتغطية عميقة من phosphoproteome Arabidopsis. يحدد هذا النهج نظرة عامة على إشارات الإجهاد التناضح في Arabidopsis.

استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis

عادة ما يكون إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات تحت ظروف الإجهاد. يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم من خلال التحليل الأيضي غير المستهدف.

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

يتم وصف طريقة محسنة لقياس ملامح ترطيب حبوب اللقاح في Arabidopsis thaliana هنا. توفر الطريقة الجديدة دقة أعلى ، وهي غير جراحية ، وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة. يمثل البروتوكول أداة جديدة لتشريح أدق للعمليات التي تنظم المراحل المبكرة من التلقيح.

اختبار حيوي عالي الدقة ، أحادي الحبة ، في الجسم الحي لترطيب حبوب اللقاح لأرابيدوبسيس ثاليانا

يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) من أوراق الأرابيدوبسيس ثاليانا لدعم التحليلات الجزيئية والوظيفية في مراحل لاحقة.

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلايا النباتية من أوراق الأرابيدوبسيس باستخدام طريقة جمع غسيل أبوبلاستيك محسنة

تعلم جمع إفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس باستخدام طريقة EDTA الميسرة لتحليل المستقلبات والبروتينات والحمض النووي الريبوزي. تساعد هذه التقنية الباحثين على دراسة الإشارات النباتية واستجابات الإجهاد.

جمع وتحليل

استكشف المزيد من الفيديوهات