جمع وتحليل نبات الأرابيدوبسيس اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع إفرازات النفوس من نبات الأرابيدوبسيس أو النباتات الأخرى لتحليل محتوياتها أو تأكيد وجود مركبات داخل تيار النفاذ. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع البتلة أولا واحتضانها في EDTA البوتاسيوم لمنع إغلاق عنصر البحر. الخطوة الثانية هي غسل البتلة جيدا لإزالة أي EDTA متبقي يمكن أن يتداخل مع التحليل اللاحق ويتلف الخلايا أيضا أثناء التعرض طويل الأمد.

بعد ذلك ، يتم جمع إفرازات EM المتدفقة في الماء. تتمثل الخطوة الأخيرة في إعداد عينات للتحليل اللاحق بواسطة جل L-C-M-S-G-C-M-S ، والرحلان الكهربائي ، والكروماتوغرافيا ذات الطبقة الرقيقة. في النهاية ، يمكن استخدام نضح phem الميسر EDTA لتحليل وتأكيد محتويات phem مثل المستقلبات والدهون أو البروتينات أو الحمض النووي الريبي.

لا يمكن للنباتات الهروب من الظروف المعاكسة. نتيجة لذلك ، فإنها تتطلب أنظمة فعالة وسريعة للغاية لنقل الإشارات البيئية في جميع أنحاء المصانع والاستجابة عن طريق تغيير التطوير. أحد مسارات الإشارات هذه هو تدفق النبات ، وهو أمر معقد للغاية لفهم تكوينه.

نستخدم تخدير التدفق الميسر EDTA لجمع وتحليل محتويات التدفق. تم تطويره في الأصل في بيريلا من قبل الملك ولكن يمكن تعديله بسهولة لأنواع أخرى. سيتم توضيح الإجراء من إيلينا والولايات المتحدة كلاهما طلاب جامعيين من مختبري قبل البدء في هذا الإجراء.

تخطط Grow Arabidopsis لمدة أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع فترة تصوير مدتها 12 ساعة في يوم المجموعة. مخفف مسبقا 100 ملليمولار محلول EDTA من البوتاسيوم مع الماء لإعطاء تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمولار. بعد ذلك ، املأ طبقين زجاجيين بقطر سبعة إلى 15 سم في منتصف الطريق بمحلول EDTA من البوتاسيوم 20 ملليمول.

عند الانتهاء ، املأ أنابيب تفاعل 1.7 مليلتر ب 1.4 مل من محلول EDTA البوتاسيوم 20 ملليمول. ثم املأ عددا متساويا من أنابيب التفاعل ب 1.4 ملليلتر من ماء المليبور. بعد إزالة النباتات التي يبلغ عمرها من أربعة إلى ستة أسابيع من غرف النمو ، قم بحصاد أوراق الوردة عن طريق قطعها بشفرة حلاقة في قاعدة البتلة بالقرب من مركز الوردة.

ضع الأوراق على الفور في الأطباق التي تحتوي على 20 مللي مولار من البوتاسيوم EDTA مع غمر الطرف المقطوع من البول في المحلول. بمجرد جمع 15 ورقة من ثلاثة إلى أربعة نباتات ، قم بتكديسها برفق فوق بعضها البعض بحيث تتماشى البتلات المقطوعة مع بعضها البعض. أعد قص قاعدة البتلات ولف الأوراق برفق.

بعد ذلك ، أدخل الأوراق الملفوفة برفق في أحد أنابيب التفاعل التي تحتوي على 20 مللي مولار من البوتاسيوم EDTA لجمع الإفرازات. في الخط المظلم قاع طبق ضحل كبير مع مناشف ورقية مبللة. ضع الرف مع أنابيب التفاعل المملوءة بالأوراق في الطبق وضعها في كيس بلاستيكي أسود به شقوق للتهوية.

ثم ضع الإعداد بالكامل في خزانة لجمع الإفرازات. في خط الضوء ، الجزء السفلي من حاوية زجاج شبكي شفافة مع مناشف ورقية مبللة. ضع الرف مع أنابيب التفاعل المملوءة بالأوراق في الحاوية وأغلقها.

بعد إزالة الرف من الحاوية ، بعد ساعة واحدة ، أخرج الأوراق من أنابيب التفاعل. اغسل الأوراق جيدا بالماء المقطر لإزالة كل EDTA. انقل الأوراق على الفور إلى أنابيب التفاعل التي تحتوي على ماء مليبور وأعدها إلى الحاويات المرطبة لجمع الإفرازات بعد إزالة الرف من الحاوية المرطبة.

بعد خمس إلى ثماني ساعات ، أخرج الأوراق من الأنابيب ، ثم قم بتجميد إفرازات التدفق في النيتروجين السائل وتخزينها في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر. لمزيد من التحليل في اليوم التالي ، قم بإذابة العينات استعدادا لتحليل الدهون. ثم اسحب عينتين إلى ثلاث عينات وأضف كمية متساوية من الكلوروفورم والميثانول إلى المحلول المركب.

دوامة الخليط لبضع ثوان. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة لمدة أربع دقائق عند 400 جرام. عند الانتهاء ، اجمع المرحلة العضوية السفلية في أنبوب زجاجي بعد تكرار القسم مع المرحلة العليا ، ثلاث مرات أخرى ، وجفف المراحل العضوية المدمجة تحت تيار من النيتروجين وأخضعها لكروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وتحليل LCMS.

تسمح هذه الطريقة بحصاد ما يكفي من إفرازات phem لتحديد البروتينات الموضعية phem والتغيرات في مستواها استجابة للتطور أو الإجهاد. في بعض الحالات ، قد يرغب الباحثون في استخدام مثبطات البروتيناز لمنع تدهور البروتينات. كما هو موضح هنا ، فإن البروتينات منخفضة جدا ، ومع ذلك فإن مستواها مرتفع بما يكفي لتجارب البروتينات اللاحقة.

يشير استخدام LCMS أو لتحليل اللطخة الغربية في القرعيات إلى أن قطع STEM يؤدي إلى تعطيل توازن إمكانات الماء وتدفق لاحق للمياه والملوثات المحتملة من البلاست. ومع ذلك ، فإن التجميع لأوقات تتراوح من ساعة إلى ثماني ساعات لا يؤثر على ملف تعريف بروتين M وتكوينه InOpSys. تختلف كمية البروتين التي تم جمعها ونمط البروتينات الموجودة بين الأنواع والعلاجات.

نتيجة لذلك ، يمكن تصور إشارات البروتين وتحديدها ومتابعتها. يمكن أيضا تحديد mRNA و microRNAs في إفرازات flom بهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن العلاج بمثبطات الحمض النووي الريبي ضروري لمنع تدهور التصوير بالرنين المغناطيسي. NA خلال وقت النضح الممتد.

نظرا لأن عناصر C لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء الوظيفية ، يمكن استخدام الروبيس ، والوحدة الفرعية الصغيرة أو الكبيرة mRNAs كعناصر تحكم سلبية بينما يمكن استخدام mRNA الموضعي المعروف لإنفلونزا الأس الهيدروجيني مثل الإنزيم المترافق لليوبيكويتين كعنصر تحكم إيجابي. وبالمثل ، يمكن تحليل السكريات أو المستقلبات الصغيرة باستخدام GCMS أو LCMS. وتجدر الإشارة إلى أن إفرازات phem تحتوي على عدد كبير من الإنزيمات الوظيفية ، بما في ذلك مسار حال السكر بأكمله تقريبا.

وبالتالي ، فإن استخدام عدة نقاط زمنية قد يكشف عن عمليات التمثيل الغذائي أثناء جمع الإفرازات. في جميع الإفرازات ، يعتبر السكروز هو المستقلب الأكثر وفرة. هذا أكثر وضوحا بعد الجمع لمدة ساعة واحدة.

ومع ذلك ، بعد خمس ساعات ، تنخفض نسبة السكروز إلى الفركتوز قليلا. إذا تم جمع نفس الإفرازات لمدة ساعة واحدة ثم تركت على المقعد لمدة أربع ساعات إضافية ، يتم تقليل نسبة السكروز إلى الفركتوز إلى حد أكبر بكثير. مما يشير إلى أن الإنزيمات النشطة في إفرازات الفيم تؤدي إلى تدهور السكروز في درجة حرارة الغرفة.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن حقيقة أن الجمع المستمر لمدة خمس ساعات يظهر انخفاضا طفيفا فقط في نسبة السكروز إلى الفركتوز يتوافق مع النتائج التي تفيد بأن تحميل الجزيئات ونقلها من الخلايا المصاحبة إلى عناصر البحر قد يستمر أثناء النضح حتى يفقد النظام حيويته. الدهون في إفرازات phem وبالتالي إشارات الدهون لمسافات طويلة هي مجال اهتمام حديث إلى حد ما في علوم النبات. نظرا لطبيعتها الكارهة للماء ، فإن الدهون موجودة فقط بتركيزات منخفضة وقد تكون مرتبطة بجزيئات أخرى للذوبان.

ومع ذلك ، فإن النضح الميسر ل EDTA يسمح بجمع مواد كافية لتصور وتحديد التدفق والدهون من العديد من الأنواع النباتية. كما هو موضح هنا ، من الممكن فصل العديد من أنواع الدهون باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة. يسمح LCMS للمرء بتحديد أنواع الدهون المختلفة ومراقبة التغيرات داخل ملامح الدهون للأنماط الجينية أو العلاجات المختلفة.

هذا يسمح بدراسة دور الدهون أثناء نمو النبات والاستجابة للإجهاد. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية وأقل من ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم العينات ، نقترح وقت تجميع من خمس إلى ثماني ساعات.

في هذه الحالة ، يوصى ببدء حصاد الأوراق في الصباح الباكر. يمكن تعديل هذا الإجراء للنباتات الأخرى ويمكن أن يؤدي إلى اكتشاف أو تأكيد مركبات تدفق جديدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر مراقبة PDLs جيدا بعد الساعة الأولى لإزالة EDTA وعدم الضغط على الأوراق لمنع التلوث بمحتوى الخلايا الأخرى.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن ارتداء القفازات يحمي عيناتك أيضا من الملوثات التي يمكن أن تدخلها من جلدك لمنع التلوث ، استخدم الضوابط المناسبة لعينات الحمض النووي الريبي البروتيني أو المستقلب. يتم سرد عناصر التحكم المقترحة في بروتوكول النص. سمحت لنا هذه الطريقة باكتساب رؤى جديدة حول تكوين تدفق النبات.

تمكنا من تحديد العديد من الدهون داخل الإفرازات ، والتي لم تكن متوقعة في البيئة المائية للأرضية. قادنا هذا نحن وآخرون إلى تقديم مفهوم إشارات الدهون لمسافات طويلة ، والتي تطورت الآن إلى أبحاث ميدانية جديدة ومثيرة للزرع.