تصميم وتشغيل المستمر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مادة نباتية مخصبة للغاية بالكربون 13 والنيتروجين 15 بشكل موحد في جميع أنحاء النبات أو بشكل متفاوت في الأنسجة التركيبية والأيضية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء غرفة محكمة الإغلاق لنمو النباتات. وتتمثل الخطوة الثانية في التحكم في درجة الحرارة والرطوبة ومستويات ثاني أكسيد الكربون داخل الغرفة للحفاظ على ظروف نمو مناسبة للنباتات.

بعد ذلك، تُزرع النباتات في غرفة محكمة الإغلاق تحتوي على هواء يتضمن 13 C وثاني أكسيد الكربون، مع الري والتسميد بمواد تحتوي على النيتروجين 15. وتتمثل الخطوة النهائية في إيقاف عملية الوسم عن طريق نقل النباتات الموُسمة بشكل تفاضلي من الغرفة قبل أسابيع من الحصاد، وذلك لتقليل إثراء موادها الأيضية بالكربون 13 والنيتروجين 15. ومقارنة بالمكونات الهيكلية للنبات بعد حصاد المادة النباتية، يُستخدم الاستخلاص بالماء الساخن ومطياف الكتلة لنسب النظائر لقياس الوسم النظائري العام والاختلافات في قوة الوسم.

تكمن الميزة الرئيسية للوسم المستمر مقارنة بالطرق الأخرى، مثل التطبيق الورقي أو الوسم النبضي المتكرر، في أنه ينتج مواد نباتية موسومة بشكل متجانس يمكن وسم مكوناتها الأيضية أو التركيبية بشكل تفاضلي. لبدء هذا الإجراء، قم بإنشاء غرفة الوسم كما هو موضح في البروتوكول النصي المصاحب عن طريق تركيب جدران من الأكريليك الشفاف بسمك 3.18 millimeter وسقف من الأكريليك الشفاف بسمك 6.35 millimeter على إطار من الألومنيوم مع أرضية من الفولاذ المصبوغ باللون الأبيض، ويمكن تعديل أبعاد الغرفة لتناسب احتياجات نمو نباتات محددة. تبلغ قياسات الغرفة الموضحة هنا 1.2 × 2.4 × 3.6 meters وتستوعب 40 أصيصاً سعة 15 liter؛ تأكد من أن الغرفة محكمة الإغلاق عن طريق تغطية جميع الفواصل بمانع تسرب سيليكون مناسب.

قم بتثبيت الباب على براغي الآلة، والتي يمكن ربطها وفكها باستخدام صواميل مجنحة قابلة للإزالة. قم بإحكام إغلاق الباب باستخدام شريط عازل لمنع تسرب الهواء في المنطقة المجاورة مباشرة لغرفة الوسم. قم بتثبيت مركز التحكم في الشاشة وضبط درجة الحرارة، والرطوبة، وثاني أكسيد الكربون داخل الغرفة.

تأكد من إحكام غلق الأسلاك الكهربائية وأنابيب الغاز المارة إلى الغرفة باستخدام السيليكون لمنع تسرب الهواء. يمكن إضافة مصابيح إلى الغرفة اختيارياً لزيادة نفاذ الضوء والتحكم في طول النهار. ولتنظيم درجة حرارة الغرفة، قم بتركيب مكيف هواء تجاري من النوع المنفصل (split type)، بحيث تكون ملفات المبخر موجودة داخل الغرفة، بينما يوضع الضاغط وملفات المكثف خارج الغرفة لتشتيت الحرارة.

بعد ذلك، قم بتركيب جهاز صغير لإزالة الرطوبة من الغرفة داخل الغرفة. احفر ثقبًا في الأرضية بجوار جهاز إزالة الرطوبة، ومرر أنبوب التصريف الخاص بالجهاز عبر الثقب إلى وعاء مملوء بالماء. يؤدي ذلك إلى إنشاء سدادة محكمة الهواء للتصريف ويسمح بتوازن الضغط. قم بتنظيم الرطوبة في الغرفة عن طريق توصيل وحدة تحكم قابلة للبرمجة، مثل omega eye series، مزودة بمستشعر رطوبة بجهاز إزالة الرطوبة.

بعد ذلك، قم بتركيب محلل غاز بالأشعة تحت الحمراء أو ER a مع مضخة حجابية تسحب الهواء باستمرار من الغرفة عبر ER A وإعادته إلى الغرفة. يحافظ هذا الإجراء على نظام مغلق مع المراقبة المستمرة لتركيز ثاني أكسيد الكربون في الغرفة. ثم قم بتوصيل خزانين من غاز ثاني أكسيد الكربون النقي بنظام التحكم في ثاني أكسيد الكربون.

يجب أن يحتوي أحد الخزانات على ثاني أكسيد الكربون بنسبة 10% من ذرات 13 C أو أعلى، بينما يحتوي الخزان الآخر على ثاني أكسيد الكربون بتركيز 13 C الطبيعي. اضبط منظمات الخزانات على 20 PSI، ثم قم بتركيب صمامات ملف لولبي (solenoid valves) في خطوط الغاز بعد المنظمات للتحكم في عمليات حقن ثاني أكسيد الكربون بواسطة برنامج Ergo.

تحكم في فتح وإغلاق الصمامات الملفية (solenoid valves) عن طريق توصيلها بجهاز ER rga عبر برنامج مرحل الحالة الصلبة (solid state relay)، مع ضبط إنذار منخفض في برنامج ergas لتحفيز فتح الصمامات الملفية عندما ينخفض تركيز ثاني أكسيد الكربون في الغرفة عن قيمة معينة، وضبط نطاق ميت (deadband) لإغلاق الصمامات بمجرد وصول تركيز ثاني أكسيد الكربون إلى نقطة ضبط عليا. بعد الصمامات الملفية، قم بتركيب صمام قياس على كل خط من خطي خزان الغاز، واضبطهما بعناية للوصول إلى مستوى إثراء carbon 13 المطلوب في الغلاف الجوي.

نستخدم هنا إثراءً بالكربون 13 بنسبة 4.4 في المائة ذرية. صِل المخرجات معاً ثم وجّه الخط في النهاية إلى مركز الغرفة بين المروحتين، مما يساعد على توزيع ثاني أكسيد الكربون المسمى بالتساوي في جميع أنحاء الغرفة لإعداد نظام الري. أولاً، قم بإنشاء حلقة ري بالتنقيط واحدة لكل أصيص، ومرر أنابيب الري عبر ثقب صغير مصنوع في جدار الغرفة إلى الخارج.

ثم قم بسد الثقوب المحيطة بأنابيب الري باستخدام مادة السيليكون العازلة لمنع تسرب الهواء إلى الخارج من الغرفة. صِل أنابيب الري بأنابيب المضخة 연동ية (peristaltic pump) وضع مشبك خرطوم صغير عليها لمنع تسرب الهواء بين عمليات الري. قم بإنبات البذور قبل زراعتها في الأصص لضمان حيويتها، ثم لقّح الشتلات بملاط تربة طازج. ولإدخال الميكروبات النافعة، املأ الأصص بخليط زراعة خالٍ من التربة لاستبعاد إدخال الكربون والنيتروجين غير المحددين من التربة.

نستخدم هنا خليطاً من الرمل والفيرميكوليت وسيراميك مسامي ذو مقطع عرضي. وبمجرد إنبات البذور، تُنقل الشتلات بعناية إلى الأصص التي تحتوي على حد أدنى من تربة التأصيص. ثم تُنقل الأصص إلى الحجرة ويتم تركيب خرطوم ري فردي لكل أصيص.

أخيراً، أحكم إغلاق باب الغرفة وقم بإزالة ثاني أكسيد الكربون الخارجي عن طريق توصيل جهاز تنقية الصودا والجير (soda lime scrubber) بمضخة الهواء حتى ينخفض تركيز ثاني أكسيد الكربون إلى 200 إلى 250 جزء في المليون على الأقل. وقبل إعادة ملء الغرفة لتصل إلى 400 جزء في المليون باستخدام خليط خزان ثاني أكسيد الكربون 13 C، حاول إبقاء الغرفة مغلقة طوال فترة موسم النمو لتقليل التلوث بثاني أكسيد الكربون ذي الوفرة الطبيعية.

أولاً، قم بتوسيم محلول سماد من نوع hyland باستخدام nitrogen 15 عن طريق خلط potassium nitrate بنسبة 98 atom percent nitrogen 15 مع potassium nitrate بنسبة طبيعية من nitrogen 15، ثم إضافته إلى بقية محلول hookin. نستخدم هنا محلولاً بنسبة 7 atom percent nitrogen 15 للتسميد. استخدم مضخة تمعجية لتغذية محلول السماد الموسوم بـ nitrogen 15 عبر أنابيب الري.

استخدم مشابك UNC لغلق خراطيم الري وتوزيع كميات متفاوتة من السماد على النباتات الفردية وفقاً للاحتياج والتصميم التجريبي. بعد ذلك، قم بضخ المياه عبر الخراطيم لشطف السماد منها. يجب ألا تتجاوز الكمية الإجمالية للسائل المضاف السعة المائية للاصص لتقليل هدر السماد.

أعد تثبيت المشبك، وجميع الخراطيم بعد التسميد والري للقضاء على تسرب الهواء من الغرفة. وللتمييز بين المكونات التركيبية والأيضية في عملية الوسم، يتم إخراج النباتات من غرفة الوسم قبل أسبوع إلى ثلاثة أسابيع من الحصاد. أما النباتات التي تتطلب وسماً منتظماً، فتبقى داخل الغرفة حتى موعد الحصاد.

لتحفيز الشيخوخة، توقف ببساطة عن الري عند الجاهزية. احصد النباتات عن طريق قص الكتلة الحيوية فوق سطح الأرض أولاً.

بعد حصاد الكتلة الحيوية فوق سطح الأرض، صب التربة المستخدمة في الأصص والجذور فوق منخل بفتحات قياسها 6 mm لفصل الجذور عن تربة الأصص. ثم اشطف الجذور فوق منخل بفتحات قياسها 2 mm لإزالة أي بقايا من مواد التربة. استخدم الملقط عند الضرورة لإزالة أي من تربة الأصص التي قد تكون ملتصقة بالجذور، ثم اترك الجذور لتجف في الهواء استعداداً للتجارب المستقبلية.

خلال ثلاثة مواسم نمو تشغيلية، نجحت الحجرة في الحفاظ على درجة الحرارة بين 26 و 29 درجة Celsius، والرطوبة بين 36 و 56%، وتركيزات ثاني أكسيد الكربون بين 360 و 400 أجزاء في المليون وفقًا لما تم ضبطه في مركز التحكم. تظهر هنا نتائج تمثيلية من موسم نمو عام 2011 لنبات *Andra Pogon Girard di*. ولا يبدو أن تراكم ثاني أكسيد الكربون أثناء التنفس الليلي يتسبب في إلحاق الضرر بالنباتات النامية، كما يتم امتصاصه بسرعة بعد شروق الشمس.

أدى وسم النيتروجين 15 باستخدام محلول هوغلين بتركيز مستهدف قدره 7 atom percent من النيتروجين 15 إلى إنتاج مادة نباتية عالية الوسم بنسبة 6.7 atom percent من النيتروجين 15، وقد يعود هذا التخفيف الطفيف عن وسم النيتروجين 15 المستهدف إلى وجود بعض النيتروجين الطبيعي في خليط التربة أو نتيجة التلقيح بالتربة الأصلية. أما وسم الكربون 13 باستخدام ثاني أكسيد الكربون بتركيز مستهدف قدره 4.4 atom percent من 13 C فقد نتج عنه 4.46 atom percent من الكربون 13. ومن خلال تحليل كامل كمية المادة النباتية الموحدة الوسم، أظهرت النباتات الموُسمة بشكل تفاضلي، والتي أزيلت من الغرفة قبل 7 أو 14 أو 22 يوماً من الحصاد، فرقاً معنوياً في الكربون 13 والنيتروجين 15.

المحتوى في المكونات الأيضية التي تم الحصول عليها كخلاصات مائية ساخنة والمكونات الهيكلية التي تم الحصول عليها كبقايا خلاصات مائية ساخنة، مما يشير إلى وسم متباين للمواد النباتية الأيضية والهيكلية. وبعد تطويره، مهد الوسم المستمر بنظيرين الطريق للباحثين في الكيمياء الجيولوجية الحيوية لاستكشاف مصير وتحول المكونات النباتية في البيئة على المقياسين الكلي والنانوي.