تشريح القيطم المورق العصبية كريست ل في المختبر يزدرع الثقافة أو في الجسم الحي زرع

يصف هذا البروتوكول كيفية تشريح premigratory قمة العصبية القحفية (NC) من القيطم neurulas المورق. هذه إإكسبلنتس يمكن مطلي على فبرونيكتين وتربيتها في المختبر، أو المطعمة مرة أخرى إلى الأجنة المضيفة. هذه التقنية تسمح بدراسة آليات NC ظهارة إلى اللحمة المتوسطة التي تمر بمرحلة انتقالية، والهجرة، والتمايز.

الهدف العام من الإجراء التالي هو تتبع هجرة خلايا القمة العصبية Opus Lavis. يتم تحقيق ذلك عن طريق تشريح القمم العصبية أولا من الأجنة في المرحلة العصبية. في الخطوة الثانية ، يتم طلاء النباتات الخارجية في طبق مغطى بالفبرونيكتين لدراسة هجرة الخلايا في المختبر.

بدلا من ذلك ، بعد إزالة القمة العصبية من الجنين المضيف ، يمكن تطعيم المستخلصات مرة أخرى لتتبع هجرتها في الجسم الحي. في النهاية ، يمكن التحقيق في مساهمة هجرة خلايا القمة العصبية الجنينية في تطور opus lavis. بشكل عام ، قد يجد الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة لأن الأجنة المبكرة هشة.

القمة العصبية عبارة عن مجموعة صغيرة من الخلايا ، وعليك أن تصنع أدوات التشريح الخاصة بك. العرض المرئي لهذا البروتوكول أمر بالغ الأهمية. تم تحسين كل عنصر من عناصر عملية التشريح لضمان الإزالة النظيفة للمهمة العصبية.

في يوم التجربة ، خذ طبق تشريح 60 ملم مغطى بحوالي 10 ملليلتر من 2٪ أروس ، واملأه بثلاثة أرباع ، أو وسط برمائي عادي ، أو نام تقريبا إلى الأعلى. ثم استخدم ماصة المراعي البلاستيكية لنقل أجنة المرحلة 16 XUS lavis إلى الطبق ووضع الطبق تحت مجهر مجهر باستخدام مجموعتين من الملقط. قم بإزالة غشاء Vitale من الأجنة ، مع الحرص على عدم إتلاف الجزء الظهري من الأجنة.

ثم احتضان الأجنة في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى المرحلة 17 عندما تصل الأجنة إلى المرحلة المناسبة من التطور. احفر حفرة صغيرة في العروق في قاع الطبق لعمل مكانة للأجنة أثناء التشريح ، ثم ضع جنينا داخل الجانب الظهري للثقب. بعد ذلك ، استخدم سكين الحاجب ودبوس الحشرات لعمل شق من خلال طبقتين إلى ثلاث طبقات خلوية في الجزء الجانبي من الطية العصبية.

ثم قم بعمل شق متوازي وسطي ثان في الجزء الظهري من الطية العصبية. بعد قلب الطبق 90 درجة إذا لزم الأمر ، قم بعمل شق عمودي ثالث على الجانب الخلفي من أول شقين. القمة العصبية عبارة عن كتلة رمادية سميكة من الخلايا أسفل الطبقة الخارجية المصطبغة من الأديم الظاهر الجانبي إلى الأنبوب العصبي وفوق الأديم المتوسط الرأسي ، وهو أبيض.

بعد تحديد القمة العصبية ، استخدم طرف سكين الحاجب لفصل طبقة الأديم الظاهر المصطبغة عن القمة العصبية الأساسية بدءا من حافة الشق الثالث. بعد ذلك ، بدءا من الشق الثالث ، مرة أخرى ، افصل الأنسجة بعناية عن الأديم المتوسط. ثم افصل نسيج القمة العصبية من الأمام عن الحويصلة البصرية وحرر العرض.

عند البدء ، تعلم الإجراء باستخدام تهجين C two للتحقق من أن بعض explan على الأقل يعبر عن الحلزون الثاني ، علامة قمة عصبية أساسية للتأكد من أن مجموعة الخلايا الصحيحة يتم تشريحها للوحة X explan لتصوير الهجرة في المختبر أولا ، املأ طبقا مغطى بالفبرونيكتين بوسط كتاكيت دانال المعدلة. ثم لمنع X explan من ملامسة واجهة الهواء السائل ، قم بشفط بعض السوائل في طرف ماصة P 1000. بعد ذلك ، اسحب X explan في طرف الماصة ، ثم المزيد من السائل.

بمجرد أن يكون الطرف داخل الوسط في الطبق المطلي بالفيبرونيكتين ، اسمح للنباتات X بالاستغناء ببطء عن طريق الجاذبية ، ودفع مكبس الماصة برفق شديد حسب الضرورة. الآن ، استخدم سكين الحاجب لقص وتباعد بضع مرات في جميع أنحاء الطبق. تجنب الجوانب ، اترك الطبق يرتاح دون أن يتحرك لمدة 15 إلى 30 دقيقة حتى تلتصق النباتات X بالفبرونكتين.

ثم ضع الطبق في حاضنة مبردة بين 15 إلى 20 درجة مئوية حتى التصوير قبل تطعيم الباذنجان الخشبي المتبرع في الأجنة المضيفة. استخدم ملقطا خشنا لتقطيع غطاء زجاجي ناعم إلى قطع 1.5 ملم مربع. بعد ذلك ، قم بتشريح القمة العصبية للمضيف في ثلاثة أرباع.

نام كما هو موضح للتو ، مع الحرص بشكل خاص على عدم إتلاف الجنين المضيف. أصعب جانب في هذه التجربة هو إزالة القمة العصبية المضيفة دون الإضرار بالجنين. يفضل بعض الناس استخدام البلاستيسين لاحتفاظ الجنين بشكل أفضل.

يمكنك أيضا نقل الكسب غير المشروع من طبق آخر أو إجراء التشريح في نفس الطبق حيث تشعر براحة أكبر معه. ضع القمة العصبية على الفور على المنطقة المعطلة للمضيف. ثم ضع قطعة من زلة الغطاء أكبر من الجنين على الجنين المطعمة للحفاظ على الكسب غير المشروع في موضعه.

بعد 15 إلى 20 دقيقة ، قم بإزالة زلة الغطاء برفق. ثم بعد ترك الجنين يتعافى لمدة 10 دقائق أخرى ، انقل الجنين بعناية إلى طبق جديد مليء بثلاثة أرباع نام. عند طلاءها على الفيبرونكتين ، تلتصق النواتج العصبية بسرعة في غضون 15 إلى 30 دقيقة ، وينتشر المخطط بشكل مسطح في غضون ساعتين.

بعد ثلاث إلى ست ساعات ، تبدأ الخلايا في التشتت لمدة 24 ساعة عند 15 درجة مئوية. بدأت العديد من الخلايا في الهجرة بعيدا عن صفار البيض مما يجعل الخلايا تبدو مشرقة جدا تحت تباين الطور ، ونتوءات خلايا فيليبو ولا ميبو مرئية بوضوح. بعد تلطيخ فين من الفعل في الهيكل الخلوي.

في تجربة التطعيم التمثيلية لتقويم العظام هذه ، تم حقن أجنة المتبرعين ب GFP mRNA لمتابعة الخلايا المطعمة في جنين مضيف غير مصنف. ثم تم استئصال القمة العصبية القحفية على جانب واحد من المضيف ، بعد 30 إلى 60 دقيقة من الجراحة ، التئام الطعم ليحل محل القمة العصبية القحفية للمضيف المستبعد. بعد بضع ساعات ، هاجرت الخلايا الإيجابية ل GFP خارج الخطة بعد جذور الهجرة النموذجية لخلايا القمة العصبية المضيفة نحو مواقع الوجه القحفية البطنية.

في هذه الضفادع الصغيرة ، تطورت هياكل الوجه القحفية المشتقة من القمة العصبية. عندما تم استئصال القمة العصبية القحفية ، اختفت هياكل الوجه القحفية ، مما أدى إلى تقصير وجه بعيون مجاورة للغدة الأسمنتية. في الضفادع الصغيرة المطعمة ، ساهمت خلايا القمة العصبية المانحة في هياكل الوجه القحفية مما أدى إلى مورفولوجيا طبيعية للوجه.

يمكن استخدام تقنية التشريح هذه لدراسة العديد من جوانب تطور القمة العصبية. على سبيل المثال ، بالنسبة للدراسات المختبرية ، يمكنك علاج خلاياك بالعديد من الإشارات أو الأدوية ثم دراسة خصائص الهجرة والتمايز. بالنسبة للدراسات في الجسم الحي للأجنة المطعمة ، يمكنك التلاعب بالتعبير الجيني لكل من الأجنة المضيفة والمتبرعة عن طريق اكتساب مناهج فقدان الوظيفة ، وبهذه الطريقة ستتمكن من دراسة الجوانب المستقلة للخلية وغير الخلوية المستقلة لتطور التهجين العصبي.