متعدد الطبقات لتركيب المدى الطويل المجهر الضوئي ورقة من الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تثبيت جنين سمكة الزيبرا لإجراء مجهر الصفيحة الضوئية في الجسم الحي لفترة طويلة. يتم تحقيق ذلك أولاً بتنظيف أنبوب من إيثيلين بروبيلين مفلور أو FEP وتغليفه بالميثيل سليلوز. بعد ذلك، يتم تغليف جنين سمكة الزيبرا المطلوب دراسته.

بعد ذلك، يُنقل الجنين أولاً إلى أغاروز مُذاب، ثم إلى أنبوب FEP المطلي. وأخيراً، يتم إغلاق أسفل الأنبوب باستخدام سدادة aros والتحقق بعناية من توجيه الجنين المثبت. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التطور غير المضطرب لأجنة zebra fish على مدار عدة أيام وبدقة مكانية وزمانية عالية من خلال مجهر الورقة الضوئية in vivo.

إن الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالتقنيات الحالية هي قدرتنا الآن على مراقبة أجنة أسماك الزيبرا لعدة أيام وليس لبضع ساعات فقط. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى قيمة حول عملية التكون الجنيني طويلة الأمد لأسماك الزيبرا باستخدام مجهر الورقة الضوئية. كما يمكن تطبيقها على كائنات صغيرة أخرى مثل الكائنات البحرية الصغيرة.

يمكن استخدامه أيضًا مع تقنيات مجهرية أخرى مثل التصوير المقطعي بالإسقاط البصري، أو المجهر ذو المجال الواسع، أو المجهر البؤري. قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأن البروتوكول يتضمن خطوات حرجة زمنياً، كما يتطلب تحديد الموضع النهائي للجنين بعض الخبرة. لتحضير أنبوب FEP، ابدأ بتنظيفه عن طريق شطفه بشكل متكرر بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 molar. ثم انقل الأنبوب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter مملوء بمحلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.5 molar وعرّضه للموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق.

انقل الأنبوب البوليمري إلى حوض صغير يحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات وقم بشطفه. ثم اتبع ذلك بشطف باستخدام إيثانول 70% قبل نقله إلى أنبوب طرد مركزي جديد. مع استخدام الموجات فوق الصوتية في الإيثانول.

قم بمعالجة الأنبوب بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق قبل نقله إلى حوض صغير يحتوي على ماء مقطر منزوع الأيونات وشطفه. مجدداً. اقطع أنبوب FEB النظيف إلى قطع بطول ثلاثة سنتيمترات وقم بتسويتها إذا لزم الأمر. احفظ الأنابيب التي تم تنظيفها في أنبوب جديد سعة 50 milliliter مملوء بماء مقطر منزوع الأيونات.

قم بتحضير المحلول المخزون من Trica. ومحلول ميثيل السليلوز (Methylcellulose) بتركيز 3% ومحلول Aros بتركيزين 1.5% و0.1% وفقاً لبروتوكول النص. قم بصهر الآغار (agarro) بتركيز 1.5% وصبّه في طبق بتري لتشكيل طبقة بسمك حوالي مليمترين.

اجمع أجنة أسماك الزيبرا في المرحلة المطلوبة والتي أظهرت تعبيراً إيجابياً لجين الفلورة المختار، ثم انقلها إلى طبق جديد يحتوي على محلول E three تحت المجهر المجسم. وباستخدام ملقطين حادين، قم بإزالة الغشاء الكوريوني للأجنة بعناية، حيث يُستخدم الملقط الأول لتثبيت الغشاء الكوريوني والملقط الثاني لتمزيقه وسحبه لإجراء عملية التثبيت متعدد الطبقات. وباستخدام يدين مغطاتين بقفازات، قم بتوصيل كانيولا ذات نهاية غير حادة بحقنة.

أدخل الكانيولا بعناية لمسافة ثلاثة مليمترات تقريباً في أحد طرفي قطعة نظيفة من أنبوب FEP. بعد ذلك، اغمس الطرف الحر لأنبوب FEP في Methylcellulose بتركيز 3% واملأ الأنبوب بالمحلول. ثم اضغط ببطء على المحقنة لطرد الميثيل سليلوز باستخدام وسط E three، وكرر خطوات الغمس والطرد.

وفي هذه الأثناء، يتم تسخين حصة واحدة من 0.1%aros في كتلة تسخين حتى 70 °C. قم برج أنبوب التفاعل باستخدام جهاز الرج (Vortex) لفترة وجيزة قبل نقله إلى كتلة تسخين مضبوطة على 38 °C. وبعد التسخين، اترك الأنبوب ليبرد لفترة وجيزة ثم أضف trica ليصل التركيز النهائي إلى 133 إلى 200 mg/L وقم بالرج باستخدام جهاز Vortex.

مرة أخرى، وباستخدام ماصة باستير زجاجية، انقل جنيناً مُغلفاً إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي على سائل aros المُسخن مسبقاً، مع نقل أقل كمية ممكنة من E three. وباستخدام أنبوب FEP والمحقنة المتصلة به، اسحب كمية صغيرة من سائل aros بلطف قبل سحب الجنين، ثم املأ الأنبوب بالكامل بسائل aros.

يجب وضع الجنين عند أي من طرفي الأنبوب بحيث يكون الرأس متجهاً نحو الفتحة. ولتجنب تسرب المحتويات، حافظ على الأنبوب في وضع أفقي لسدّه. استخدم شفرة حلاقة لقطعه عن الكانيولا.

بعد ذلك، مع إمساك الأنبوب بشكل عمودي، اغرس طرفه ببطء عبر طبقة 1.5%aros بالكامل وقم بتدويره قليلاً. ولتجنب الجفاف، احتفظ بالعينة المثبتة في أنبوب تفاعل سعة 1.5 milliliter مملوء بوسط E three قبل التصوير. تحقق من أن السمكة داخل أنبوب FEP في وضع مستقيم، بحيث يستقر رأسها مباشرة فوق السدادة من أجل التصوير.

أضف مادة trica إلى الوسط داخل غرفة التصوير. يظهر هنا جنين سمكة زيبرا معدل وراثياً K-G-R-L-G-F-P بعد يوم واحد من الإخصاب، حيث تم تصويره على مدار يومين لمراقبة تطور الأوعية الدموية.

لا يتقيد سمك الزيبرا بوسط التثبيت ويمكنه النمو بشكل طبيعي. فعلى سبيل المثال، يرتفع الرأس، ويمتد الذيل، ويظهر التبرعم الوعائي دون عوائق.

يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون 10 دقائق إذا تم تطبيقها بشكل صحيح وكانت جميع المواد متاحة. تذكر تنفيذ جميع الخطوات الرئيسية دون أي تأخير. حافظ على نظافة جميع المحاليل لأن الشوائب قد تؤثر سلباً على جودة الصورة النهائية.