مؤسسة المناظير الفئران مثلي المثانة Xenografts

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء طعوم غريبة لسرطان المثانة في موقعها التشريحي بطريقة سريعة ودقيقة وبأقل قدر من التدخل الجراحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زيادة عدد خط خلايا ورمية معين وتعليق الخلايا الورمية في Matrigel. بعد ذلك، يتم تثبيت الحيوان على منصة التصوير وفحص المثانة باستخدام الموجات فوق الصوتية.

بعد ذلك، يتم فصل الطبقتين المخاطية والعضلية في المثانة عن طريق حقن محلول ملحي. وأخيراً، يتم حقن معلق خلايا الورم في الماتريجيل (matrigel) في هذا الحيز الذي تم إنشاؤه اصطناعياً. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر نمو الورم من خلال التصوير بالموجات فوق الصوتية والتلألؤ البيولوجي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى المتاحة، مثل استخدام عملية فتح البطن لتلقيح الطعوم الغريبة الأولية، في أن هذا النهج سريع ودقيق وبأقل قدر من التدخل الجراحي. وتمتد آثار هذه التقنيات إلى تشخيص وعلاج سرطان المثانة لأن الطعوم الغريبة الذاتية تمثل المعيار الذهبي للدراسات قبل السريرية للعلاجات الجديدة. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن خطوات الحقن صعبة التعلم للغاية، كما أن جدار المثانة رقيق جداً، وسيكون عرض هذا الإجراء مفيداً.

يعمل مع إيغور موسكا مساعد بحث وولفغانغ ياغر، وهو زميل ما بعد الدكتوراه، وكلاهما من أخصائيي المسالك البولية. وبعد التأكد من هوية خطوط الخلايا السرطانية في المثانة البشرية المعنية، يتم في هذه الدراسة استخدام بنية فيروسية بطيئة (lentiviral construct) تحمل جين لوسيفيراز اليراع (firefly luciferase gene) لتحليل نمو الأورام المزروعة غريبة المنشأ (xenograft tumors) عن طريق التلألؤ البيولوجي، وذلك لنقل الجين إلى خطوط الخلايا.

عند الاستعداد لبدء الإجراء، يتم إذابة واستخدام DMEM مع 10%FBS لتوسيع خطوط الخلايا الموجودة، ثم تُحضن عند 37 درجة مئوية في جو مرطب يحتوي على 5%CO2. ولتحضير معلق خلوي للحقن بعد الإذابة، واستخدام matrigel، والحفاظ على trypsin على الثلج، تُستخدم خلايا بنسبة 70%confluence ويُستخدم وسط نمو عادي للتعليق، ثم تُعد الخلايا ويتم تدوير المعلق بسرعة 200 ×g لمدة خمس دقائق. وبعد إزالة الطافي، تُضاف الكمية المناسبة من أحجام متساوية من D-M-E-M-F-B-S و MATRIGEL للوصول إلى تركيز الخلايا المطلوب لحقن حجم 40 µL لكل حيوان.

امزج المكونات جيداً وتجنب تكوين فقاعات هوائية باستخدام أي مادة بلاستيكية مسطحة وصلبة. اقطع مثبت المثانة بعناية وافحص الحزام وقم بإزالة أي حواف حادة قبل تطبيقه على الفئران. بعد تخدير إناث الفئران باستخدام 3% isoflurane في الأكسجين وإجراء اختبار قرص الإصبع.

لضمان التخدير الكافي، يتم تثبيت الحيوان على طاولة التصوير الحرارية الخاصة بمنصة تصوير الحيوانات الصغيرة، مع المراقبة المستمرة لعلاماته الحيوية باستخدام شريط مطاطي. يتم تثبيت الأطراف السفلية واستخدام جلوكونات الكلورهيكسيدين بتركيز 0.5% لتطهير البطن قبل استخدام مسحة قطنية معقمة لمسح الجلد. بعد ذلك، يتم تثبيت المثانة باستخدام حزام تثبيت المثانة لمنع تحركها أثناء الحقن داخل الجدار.

بعد ذلك، ضع هلام الموجات فوق الصوتية المعقم على أسفل البطن. حرك رأس جهاز الفحص بالموجات فوق الصوتية ببطء نحو الجلد وراقب المثانة على شاشة الجهاز. إذا كانت المثانة فارغة، استخدم 50 µL من محلول PBS الدافئ عبر قسطرة وعائية مقاس 24 تمر عبر الإحليل لملئها من أجل فصل طبقات جدار المثانة.

ابدأ بتثبيت حقنة سعة 1.0 milliliter مملوءة بـ PBS ومتصلة بإبرة مقاس 30 gauge وطول ثلاثة أرباع البوصة في مشبك الحقنة. ضع الإبرة باتجاه الجلد فوق عظم العانة مباشرة. وبزاوية تتراوح من 30 إلى 45 درجة، حدد موقع الإبرة على شاشة الموجات فوق الصوتية قبل ثقب الجلد وعضلات جدار البطن ببطء.

بعد ذلك، قم بتدوير شطبة الإبرة بمقدار 180 درجة بحيث تكون متجهة للخلف، ثم أدخل طرف الإبرة في جدار المثانة دون اختراق المخاطية. ومن ثم، ولإنشاء مساحة اصطناعية، احقن ببطء 50 µL من PBS بين الطبقة العضلية والمخاطية قبل سحب الإبرة. ولحقن خلايا سرطان المثانة، قم بتثبيت محقنة ثانية سعة 1.0 mL مملوءة بمعلق الماتريجيل لخلايا السرطان، وإبرة قياس 30 gauge بطول ثلاثة أرباع بوصة في مشبك المحقنة.

وجه طرف الإبرة نحو الحيز المملوء بـ PBS. قم بحقن 40 µL من المعلق في هذا الحيز. بعد ذلك، اسحب الإبرة ثم قم بفصل الفأر عن منصة التصوير.

يُحفظ الحيوان في بيئة دافئة ومريحة تحت المراقبة المستمرة. وبعد استعادة الوعي والقدرة الطبيعية على الحركة، يُعاد الحيوان إلى قفصه الأصلي. تم إجراء حقن داخل الجدار لثلاثة خطوط خلوية ورمية مختلفة في 50 حيواناً تحت توجيه الموجات فوق الصوتية على مدار ثلاثة أيام متتالية.

تم إجراء التلقيح بكفاءة ولم يرتبط بأي مضاعفات أثناء أو بعد التدخل. وتمت مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية والتلألؤ البيولوجي. وفي اليوم الثالث، أمكن اكتشاف ورم بواسطة الموجات فوق الصوتية في المثانة الأمامية لجميع الحيوانات البالغ عددها 50 حيوانًا، وأظهرت 98% من الفئران نموًا مستمرًا للورم خلال فترة المتابعة التي تلت تلقيح uc.Three.

أظهر فأر واحد من مجموعة Luke انتشاراً ورمياً داخل الصفاق، بينما تراجع الورم بعد اليوم السابع في حيوان ثانٍ. كانت هذه المجموعة الأولى من الفئران التي تم تلقيحها بهذه التقنية الجديدة بعد تلقيح uc.Three. Luke uc, one Luke, and uc.

13 لوك. تم التضحية بالفئران في الأيام 24 و28 و37 على التوالي. تم استئصال أورام الطعوم الغريبة وفحصها عبر مقاطع h وd.

كانت جميع الأورام غازية للعضلات، وتسلل بعضها إلى الدهون المحيطة بالأحشاء، ولكن لم يُلاحظ أي غزو للأعضاء المجاورة. 60% من uc، و 13 Luke، و 20% من uc. ظهرت نقائل في العقد اللمفاوية خلف الصفاق في ثلاثة من الفئران الحاملة لأورام Luke، وتم تأكيد ذلك بواسطة صبغ h and e.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ثلاث دقائق. وتعد المعرفة بتصوير الموجات فوق الصوتية شرطاً أساسياً لإجراء هذه العملية. فبعد تلقيح الأورام بهذه الطريقة، تتيح لنا الموجات فوق الصوتية ليس فقط مراقبة نمو الورم بمرور الوقت، بل وأيضاً فحص تروية الورم باستخدام الفقاعات الدقيقة. كما تتيح لنا إجراء الحقن داخل الورم باستخدام عوامل تجريبية حديثة.