أنسنة نموذج الفأر لدراسة الالتهابات البكتيرية استهداف الأوعية الدموية الدقيقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الآليات التي تصيب بها البكتيريا التهاب السحايا الأوعية الدموية البشرية في الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك عن طريق تطعيم جلد الإنسان أولا على فأر يعاني من نقص المناعة ، وبالتالي إدخال الأوعية الدموية الجلدية البشرية. في الخطوة الثانية ، تصاب الفئران المتوافقة مع البشر بالبكتيريا.

ثم يسمح للعدوى بالمضي قدما لفترة زمنية محددة مسبقا. في الخطوة الأخيرة ، يتم الحصول على عينات الدم والأنسجة لتقييم نتيجة العدوى. في النهاية ، يتم استخدام مزيج من علم الأنسجة والتألق المناعي وتحليل الدم والأنسجة لدراسة تطور العدوى في الأوعية البشرية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على التقنيات الحالية مثل نماذج زراعة الخلايا أو النماذج الحيوانية ، هي أنه لأول مرة ، يمكننا ملاحظة علم الأمراض السريري النموذجي الذي يحدث أثناء هذه العدوى. في أقرب وقت ممكن بعد التجميع ، قم بتنظيف سطح جلد الإنسان بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم ضعه بشكل مسطح على سطح نظيف جيدا ، ويفضل أن يكون ذلك تحت غطاء التدفق. بعد ذلك ، استخدم ديرماتوم بسماكة محددة مسبقا لقطع شرائح من 200 إلى 400 ميكرومتر من أعلى الجلد.

تحقق من سلامة الشرائح ، ثم قم بقصها إلى مربعين في سنتيمترين. ضع المربعات في PBS ثم نظف المنطقة المحلوقة من مخدر معد جراحيا ، وعمره ستة إلى ثمانية أسابيع ، فأر بيج شديد يعاني من نقص المناعة مع 70٪ إيثانول. بعد وضع مخدر موضعي على موقع الكسب غير المشروع ، استخدم مقصا منحنيا لإزالة الطبقة السطحية من جلد الفأر بعناية في منطقة أصغر قليلا من قطع الكسب غير المشروع ، مع الحرص على عدم إزعاج الأوعية الدموية الأساسية.

تحرك بسرعة لتجنب جفاف الكسب غير المشروع ، ضع إحدى شرائح جلد الإنسان فوق طبقة الكسب غير المشروع ، مع التأكد من أن جانب البشرة متجها لأعلى. قم بمحاذاة حافة الأنسجة وإصلاحها بغراء الأنسجة. ثم قم بتركيب باقي جلد الإنسان بعناية على فراش الكسب غير المشروع ، مع وضع كميات صغيرة من غراء الأنسجة حول كل حافة.

قم دائما بقص جلد الإنسان حسب الحجم بدلا من تكبير سرير الكسب غير المشروع. بعد التأكد من أن كل زاوية ثابتة ، قم بتنظيف المنطقة بمحلول اليود وقم بتطبيق ضمادة بقوة ولكن ليس بإحكام مع جانب الوسادة فوق الكسب غير المشروع ، مع الحرص على عدم تأثر تنفس ، ثم قم بتثبيت الضمادة بشريط خلع الملابس واسمح للحيوان بالتعافي على سطح دافئ. بمجرد الاستيقاظ ، أعد إلى قفصه حتى يعيد الحقن البكتيري تلقيح ثقافة صفيحة بين عشية وضحاها في الثقافة السائلة.

صباح العدوى ، عندما تصل البكتيريا إلى التركيز المطلوب ، تمييع الخلايا إلى واحد في 10 إلى المستعمرة السابعة التي تشكل وحدات في المليلتر. ثم بعد التخدير ، تأكد من تخدير الفئران المطعمة بإصبع القدم. قرصة ووضع على وسادة حرارية.

ضع مرهم العين على عيون ، ثم IP. حقن كل فأر بثمانية ملليغرام من النقل البشري في محلول ملحي. ثم لكل ، قم بقطع طرف الذيل ونشر قطرة صغيرة من الدم من الذيل على صفيحة أجار للتأكد من أن الدم معقم قبل الإصابة.

ثم حقن 100 ميكرولتر من المزرعة البكتيرية عن طريق الوريد عن طريق الحقن خلف الحجاج. بعد بضع دقائق ، قص نهاية الذيل مرة أخرى وانشر عينة الدم هذه على أطباق أجار طازجة أيضا. لإنشاء وحدات تشكيل مستعمرة الدم مباشرة بعد الإصابة ، أغلق الذيل بغراء الأنسجة ثم قم بتخفيف اللقاح البكتيري ونشره على ألواح أجار بالمضادات الحيوية المناسبة.

لإنشاء وحدات تشكيل مستعمرة اللقاح بعد ست ساعات من الإصابة ، اسحب كمية صغيرة أخرى من الدم من كل ذيل من ذيول الفأر ، ثم قم بتخفيف قطرات الدم وصفيحتها كما هو موضح للتو لإنشاء وحدات تشكيل المستعمرة في ست ساعات. ثم احتضان جميع الصفائح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون بين عشية وضحاها لإجراء تشكيل مستعمرة الأعضاء. عدد الوحدات للحيوانات المصابة.

ابدأ بعمل شق في خط الوسط في كل فأر قتل رحيم. ثم لكل ، قم بقطع الضلع وقم بعمل شق في القلب. استخدم حقنة معقمة لسحب أكبر قدر ممكن من الدم من القلب وتجويف الصدر ، وتوزيعها في أنابيب معقمة فردية لكل عينة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأعضاء ذات الأهمية ثم انقل ترقيع الجلد والأجزاء المصاحبة من جلد الفأر إلى صفيحة معقمة واحدة لكل. اترك الدم الذي تم جمعه يتجلط لمدة 15 دقيقة ، ثم قم بتدويره. ثم قم بإزالة البلازما من الدم وتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحليلها لاحقا.

بعد ذلك ، قم بوزن أنابيب التجانس التي تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS لكل منها. ثم استخدم خزعة معقمة لأخذ عينات خزعة بمقدار أربعة ملليمترات من كل نسيج تم تشريحه. ضع الخزعات بشكل فردي في أنابيب التجانس مع حبة واحدة بحجم ملليمترين في كل أنبوب يحتوي على عينة جلدية.

قم بتخزين الأنسجة المتبقية في 4٪ بارا فورمالديهايد عند أربع درجات مئوية للفحص المجهري ، وقم بوزن أنابيب التجانس لتحديد وزن الخزعة. ثم قم بتجانس العينات عند 6 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية ، مع تكرار تجانس الجلد حتى يصبح التجانس. أخيرا ، انشر ملاط الخلايا من كل أنبوب على ألواح أجار طازجة وقم بزراعة المزارع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

لإنشاء وحدة تشكيل مستعمرة الأعضاء في هذه النتائج التمثيلية. سلالة إيجابية GFP من التهاب السحايا N. تم استخدام المجموعة المصلية C.

أظهرت تعداد الدم أنه بعد خمس دقائق من الحقن الوريدي من واحد في 10 إلى وحدات البكتيريا الست المكونة للمستعمرة ، كان هناك متوسط 1.5 في 10 إلى المستعمرة الخامسة التي تشكل وحدات لكل مليلتر منتشرة في الدم. بعد ست ساعات ، يبلغ متوسط التعداد 4.8 أضعاف 10 إلى المستعمرة الرابعة التي تشكل وحدات لكل مليلتر بمقدار 24 ساعة. كان متوسط التعداد 2.4 في 10 إلى المستعمرة الرابعة التي تشكل وحدات لكل مليلتر.

ولكن في هذه المجموعة المكونة من 10 فئران ، لم يكن لدى خمسة بكتيريا منتشرة يمكن اكتشافها بينما كان لدى الخمسة الآخرين عدد مرتفع نسبيا. تظهر هذه الأشرطة الموجودة على هذه الرسوم البيانية القيم المتوسطة لكل مجموعة من أعداد CFU المأخوذة من الجلد. تظهر العينات أن غالبية الفئران لديها أعداد كبيرة في جلد الإنسان ، بمتوسط 2.1 مرة 10 إلى رابع CFU لكل مليغرام من الأنسجة في ست ساعات ، و 4.4 مرات 10 إلى CFU الثاني لكل ملليغرام من الأنسجة في 24 ساعة.

تظهر عينات جلد الفئران المقابلة أي أعداد بكتيرية في 24 ساعة وعدد منخفض جدا فقط في ست ساعات ، مما يدل على التفضيل القوي لالتهاب السحايا النهائي للأوعية البشرية في الأنسجة المطعمة. بشكل عام ، كانت أعداد البكتيريا منخفضة جدا إلى غير قابلة للاكتشاف في العضو الآخر الذي تم أخذ عينات منه ، على الرغم من أن حيوانين أظهرا عددا ، والذي قد يكون مرتبطا بأعداد بكتيرية عالية الانتشار. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج لتحديد دور عوامل الفوعة في الجسم الحي.

على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، لم تظهر السلالات البكتيرية التي تفتقر إلى حبوب منع الحمل الوظيفية من النوع الرابع الأولى ، ولم تظهر الفئران المصابة بهذه السلالات الطافرة أي التصاق بكتيري في ترقيع جلد الإنسان ، مما يؤكد الدور الحاسم الذي ألعبه حبوب منع الحمل من النوع الرابع في الالتصاق في الجسم الحي. في هذه الصور متحدة البؤر لتطعيم الجلد ، بعد ساعتين من الإصابة ، يمكن ملاحظة الأوعية البشرية الملطخة بالليكتين UEA الرومين المترافق. يمكن التعرف على الحدود الجلدية للبشرة بوضوح ويمكن ملاحظة التهاب السحايا المعدي الإيجابي والتهاب السحايا بوضوح في جميع أنحاء الأوعية.

يوضح هذا الطعم الجلدي البشري الملطخ ب h و e الالتهاب وتسربات الأوعية الدموية ، بالإضافة إلى تجلط الدم الذي يتركز في الأوعية القريبة من حدود جلد البشرة. بعد 24 ساعة من الإصابة في حوالي 30٪ من الالتهابات ، أدت الالتصاقات البكتيرية في الجلد إلى تطور فرفرية يمكن اكتشافها بالمجهر. لذا فإن تطوير هذه التقنية يمهد الطريق للباحثين المشاركين في البحث وتفاعلات مسببات الأمراض المضيفة لدراسة آليات المرض في سياق الأوعية البشرية.