وصفها الفرق من سطح الخلية والمنضوية البروتينات الأجسام المضادة بعد تغذية الخلايا العصبية مثقف لايف

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية البروتينات على سطح الخلايا العصبية الحية وتمييز البروتين السطحي عن البروتينات الداخلية باستخدام وضع العلامات على الأجسام المضادة الثانوية التفاضلية. للقيام بذلك ، يتم تحضين الخلايا العصبية الأولية المزروعة على زجاج الغطاء بجسم مضاد موجه ضد حاتمة سطحية ويتم تحضينها للسماح بالاستيعاب. بعد الحضانة ، يتم تطبيق جسم مضاد ثانوي مصنف بالفلورسنت لتحديد البروتينات المكشوفة للسطح.

ثم يتم تطبيق الجسم المضاد الثانوي الزائد غير المسمى لمنع أي مجمعات أجسام مضادة أولية للبروتين السطحي المتبقية. ثم يتم تجعيد الخلايا العصبية المستنبتة ويتم تطبيق جسم مضاد ثانوي بلون مختلف للكشف عن البروتين الداخلي. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح المستويات النسبية للبروتين الداخلي مقابل البروتين السطحي من خلال الفحص المجهري المناعي.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن الحصول على مسار زمني لاستيعاب البروتين السطحي المصدر مما ينتج عنه معلومات حول معدلات تهريب البروتين في ظل الريحان والظروف المحفزة. ابدأ هذا الإجراء بإعداد زلات غطاء لغسلة غطاء زجاجي بوليك مطلي بالبوليليسين مقاس 18 ملم لثقافة الخلية المحضرة في اليوم السابق عن طريق غمسها في ثلاثة أطباق شطف منفصلة تحتوي على PBS أضف 500 ميكرولتر من المحلول الرقائقي إلى آبار لوح 12 بئر ، ثم باستخدام ملقط ، ضع زلات الغطاء في كل منها. اضغط جيدا على كل زلة غطاء للتأكد من أنها تجلس بشكل مسطح في قاعدة حاضنة البئر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول باستخدام إما قشرة الفأر E 15 أو فرس النهر E 18 كامبي.

في هذا العرض التوضيحي ، يتم استخدام قشرة الفأر. ضع القشرة من نصف فضلات أو فضلات واحدة من الأجنة على الجليد في مليلتر واحد يحتوي على PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم وضعه على الجليد. بعد ذلك ، باستخدام ماصة صغيرة سعة مليلتر واحد ، قم بإزالة PBS من الأنسجة القشرية.

ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول واحد للحمض النووي بابا إلى الأنسجة القشرية من نصف فضلات الأجنة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. مرتين خلال فترة الحضانة ، قم بنفض الأنبوب برفق لخلط المحتويات بعد الحضانة ، واستخدم ماصة معجنة مصقولة من السيليكون باللهب لإعادة تصنيف الأنسجة برفق من 10 إلى 15 مرة حتى يتم الحصول على تشتت الخلية.

القليل ، إذا كان يجب أن تبقى أي قطع من الأنسجة غير المنفصلة ، تجنب تكوين الفقاعات. ضع طبقة بعناية من تعليق الخلية المنفصلة فوق وسادة سعة ثلاثة ملليلتر من 4٪ BS ، A في BSS من Hank مع المواد المضافة. ثم في جهاز طرد مركزي على الطاولة مع جهاز طرد مركزي دوار يتأرجح للخارج عند 100 مرة G لمدة سبع دقائق.

بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية مع الحرص على عدم شفط حبيبات الخلية. ثم أضف ملليلترا واحدا من الوسط القاعدي العصبي الكامل ، وقم بسحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل لإعادة تعليق الخلايا المحببة. بعد ذلك ، استخدم مقياس الخلوي الدموي لتحديد تركيز الخلايا الحية.

يجب اعتبار الخلايا الساطعة فقط في المرحلة حية مباشرة قبل الطلاء. قم بشفط محلول المصل الرقائقي الزائد من زلات الغطاء في الآبار واستبدله بوسط ثقافة الخلايا العصبية الأساسي. ثم أضف 75،000 إلى 100،000 خلية عصبية أولية إلى كل بئر.

استزراع الخلايا العصبية لمدة تصل إلى 21 يوما في الوسط القاعدي العصبي عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في اليوم السابع ، وكل أسبوع بعد ذلك ، أضف الفلورو المضاد للانقسام ، ديوكسي يوريدين يوريدين لمنع فرط النمو الدبقي وإجراء تغيير نصف متوسط. خلال الأسبوع الأول في الثقافة ، طورت الخلايا العصبية العرش الشجيرية كما هو موضح في هذه الصورة لثقافة عمرها يومين. بحلول الأسبوع الثاني إلى الثالث ، ينضجون وسيخضعون لتكوين التشابك العصبي.

يتم توضيح شبكة واسعة من الإسقاطات في هذا الشكل الذي تم أخذه في 14 يوما في المختبر لتسمية البروتينات المكشوفة على السطح ذات الأهمية ، وإضافة الجسم المضاد الأساسي مباشرة إلى الوسط المكيف بالتركيز المناسب. يجب اختبار كل حالة في ثلاث نسخ يمكن استخدام أربعة عناصر تحكم أو مصل ما قبل المناعة أو الأجسام المضادة التي تتعرف على المناطق داخل الخلايا من البروتين التي لا تتعرض لها أثناء إفراز الخلايا في نفس التخفيف مثل الجسم المضاد الأساسي للاختبار. أعد الخلايا إلى حاضنة الثقافة لمدة ساعة أو ساعتين أو أربع ساعات بعد الحضانة ، واستنشق الجسم المضاد الذي يحتوي على وسط ، واغسل الآبار مرة واحدة برفق ولكن بسرعة باستخدام PBS.

أضف درجة حرارة الغرفة عن طريق إضافة محلول إلى الآبار ، ثم الشفط. ثم يضاف 4٪ من الفورمالديهايد الطازج ويحتضن لمدة خمس دقائق. أضف درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا بعد التثبيت.

قم بإزالة محلول بارا فورمالديهايد من الآبار وتخلص منه في حاوية نفايات سائلة في غطاء الدخان. ثم شطف الخلايا بسرعة ثلاث مرات باستخدام PBS كما كان من قبل. اترك الغسيل الثالث في مكانه بحيث يمكن إزالة زلة الغطاء بسهولة.

بعد ذلك ، استخدم الملقط لإزالة زلات الغطاء بعناية من اللوحة ووضعها جنبا إلى جنب مع الخلية لأعلى على ورقة من المعلمة على قاعدة أو غطاء لوحة الثقافة التي تستخدم لمرة واحدة. سيتم تنفيذ ما تبقى من بروتوكول التلوين على هذا السطح بلطف ، ومحلول حجب الماصة من PBS 5٪ BSA على الخلايا لعمل قطرة مستديرة على شكل فقاعة على زلة الغطاء حتى لا تجف. احتضن لمدة 30 دقيقة.

من المهم أن تتذكر عدم إضافة المنظفات إلى محلول الحظر. في هذه المرحلة ، لا ينبغي أن تتغلغل الخلايا عندما يتم تسمية بروتينات سطح الخلية فقط. بعد الحظر ، قم بشفط محلول الانسداد ، ثم لتسمية البروتينات المكشوفة للسطح ، وقم بتطبيق جسم مضاد ثانوي مسمى بالفلورسنت ، ثم احتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، وشفط الجسم المضاد الثانوي واغسل زلات الغطاء مرتين باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة لمنع أي بروتين على سطح الخلية غير مرتبط بالجسم المضاد الثانوي المسمى.

احتضان الخلايا العصبية غير المنفذة بتركيز عال من الأجسام المضادة الثانوية غير المسماة بين عشية وضحاها. في درجة حرارة الغرفة. الحضانة بين عشية وضحاها أمر بالغ الأهمية.

تمنع فترات الحضانة الأقصر تماما أي جسم مضاد أولي غير مرتبط تماما بالجسم المضاد الثانوي المسمى. في اليوم التالي ، اغسل الغطاء مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما باستخدام PBS كما كان من قبل. ثم بعد تثبيت الخلايا مع 4٪ بارا فورمالديهايد في مخزن الفوسفات لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد إزالة المثبت.

شطف الخلايا بسرعة مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك بالنسبة لوضع العلامات داخل الخلايا ، قم بتجشير الخلايا التي تحتوي على PBS تحتوي على 5٪ BSA و 0.1٪ Triton X 100 في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد النفاذ، قم بإزالة محلول الحظر.

مع الحرص على عدم جفاف الغطاء. أضف جسما مضادا ثانويا بعلامات مختلفة واحتضنه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة الجسم المضاد الثانوي الثاني ، اغسل زلات الغطاء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق باستخدام PBS.

ثم اغسلها لفترة وجيزة باستخدام حامل مائي منزوع الأيونات. ينزلق الغطاء على شرائح زجاجية مع وسيط تركيب مائي يحتوي على عامل مضاد للبهتان ويسمح لها بالجفاف ، وتخزين الشرائح في الظلام عند أربع درجات مئوية للحفاظ على إشارة الفلورسنت على النحو الأمثل. قم بتصوير خلايا البقع المناعية على مجهر متحد البؤر باستخدام مرشحات الإثارة والانبعاث المناسبة.

استخدم نفس معلمات اكتساب التصوير لجميع التكرارات والحالات التي تلي التصوير. استخدم برنامج تحليل الصور القياسي مثل Fiji Image J أو Metamorph لتحديد الكثافة المتكاملة للمناطق القياسية ذات الأهمية أو سمات بونتا ، مثل العدد والحجم لتحديد ما إذا كان الجين المرتبط بالنوبات ستة أو يقول ستة موجودا على سطح الخلايا العصبية واستوعبه منه. تم إجراء وضع العلامات على اللون المزدوج للخلايا العصبية الحصين المزروعة للفئران كما هو موضح في هذا الفيديو.

في هذه الصورة ، يظهر بروتين سطح الخلية المسمى باللون السماوي ويظهر البروتين الداخلي باللون الأخضر. لوحظ تلطيخ مزدوج يشير إليه رأس السهم فقط في خلية بدت غير صحية لتحديد ما إذا كان البروتين داخليا أثناء حضانة تغذية الأجسام المضادة الموضعية في الإندوسومات العصبية التي تعبر عن علامة إعادة التدوير المبكرة ترانسفيرين mCherry كانت ملطخة بالمناعة بعد الاختراق كما هو موضح في هذه المنطقة من الشجرة المتغصنة ، كان هناك تداخل واسع النطاق في تلطيخ النقاط مع ترانسفيرين مما يؤكد أن البروتين الداخلي مترجم إلى الجسيمات الداخلية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية هي أنه يمكن استخدام جسم مضاد واحد للتمييز بين سطح الخلية ومجموعات البروتين الداخلية.