التجميعي السريع وفحص عوامل النسخ المنشط كيميائيا مع مراسلون القائم GFP

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء واختبار والتحقق من صحة عوامل نسخ اصطناعية (ATFs) مُحفزة ومُرمزة جينياً ذات نوعية محددة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء الـ ATF عبر عملية تحول بسيطة للخميرة، حيث يؤدي إدراج ناتج PCR لنطاق ربط الـ DNA إلى اندماج متوافق الإطار مع مستقبل الإستروجين البشري وVP 16. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إنشاء بلازميد مراسل GFP لـ ATF عن طريق استبدال مواقع الربط في البلازميد PMN eight بتسلسلات استهداف الـ TF.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تحليل قدرة عوامل النسخ (ATFs) على تنشيط المراسل GFP، وكذلك تقييم تأثيرها على فيزيولوجيا الخميرة من خلال قياس معدل النمو. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي استخدام عامل النسخ (TF) الذي تم التحقق من صحته للتعبير الشرطي عن هدف جينومي أصلي. وفي نهاية المطاف، يمكن جعل أي جين مستهدف ذات أهمية نشطًا بشكل شرطي.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الحث المعتمد على الجالاكتوز للتعبير الجيني، في إمكانية تحقيق حث انتقائي تحت ظروف غذائية وفيزيولوجية متنوعة دون حدوث تأثيرات متعددة المظاهر. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في بيولوجيا الخميرة من خلال الإدخال السريع والعكسي لمنتجات جينية محددة، مما يتيح دراسة كل من اكتساب الوظيفة وفقدانها. للبدء، قم بتضخيم نطاق ربط DNA أو DVD المطلوب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مع بوليميراز عالي الدقة.

قم بتحويل أكثر من 1 µg من ناتج PCR المُنقى إلى الخميرة باستخدام طريقة أسيتات الليثيوم. بعد عملية التحويل، قم بتدوير الخلايا بالسرعة القصوى لمدة 15 ثانية في جهاز طرد مركزي دقيق، ثم تخلص من خليط التحويل وأعد تعليق الخلايا في حوالي 200 µL من الماء المعقم قبل الزراعة على وسط مستخلص الخميرة والبيبتون والدكستروز (YPD). في اليوم التالي، قم بنقل المستعمرات من وسط YPD إلى أطباق تحتوي على حمض الفلورو-أوروتيك.

بعد النمو لمدة تتراوح من يومين إلى أربعة أيام، أعد تخطيط ما لا يقل عن 5 إلى 10 مستعمرات على وسط YPD. ثم أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات (colony PCR) باستخدام البادئات المذكورة في البروتوكول النصي، وقم بإجراء التسلسل للتحقق من الإدراج. خفف أوليغونات منطقة الربط المطلوبة إلى تركيزات متساوية المولات.

قم بفسفرة منطقة الربط باستخدام T four polynucleotide kinase، ثم استخدم neo thermocycler وفقاً لظروف التفاعل الموضحة في البروتوكول النصي. بعد ذلك، قم بهضم ما يقرب من واحد إلى اثنين ميكروغرام من PMN eight باستخدام not one HF و xb. One لمدة ساعة واحدة عند 37 °C gel.

قم بتنقية نطاق العمود الفقري (backbone band) وتخفيف العمود الفقري المنقى ليصل تركيزه إلى 10 nanograms per microliter. ثم خفف موقع الارتباط المفسفر مزدوج الشريط ليكون تركيزه المولي خمسة أضعاف تركيز العمود الفقري per microliter. باستخدام T four DNA Ligase، قم بربط مواقع الارتباط في العمود الفقري المهضوم في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

قم بإجراء عملية التحويل عن طريق إضافة نصف تفاعل الربط إلى 50 µL من خلايا E. coli المختصة كيميائياً القياسية، واتباع الإجراء المدرج في البروتوكول النصي. بعد استعادة الخلايا، أضف من 100 إلى 200 µL من الخلايا لكل طبق luria berti أو LB مضاف إليه الأمبيسيلين، ثم قم بالتحضين طوال الليل. في اليوم التالي، قم بتنمية E. coli في وسط LB سائل مضاف إليه الأمبيسيلين، واستخلص الحمض النووي للبلازميد كما هو موضح في البروتوكول النصي.

بعد ذلك، قم بالتحقق من تسلسل بلازميد المراسل الجديد من مستعمرات الربط. وأخيراً، قم بتحويل بلازميد المراسل الجديد إلى سلالة E التي تحتوي على TF باستخدام تحويل خلات الليثيوم. للبدء، قم بتنمية سلالة تحتوي على TF ومراسل طوال الليل في خمسة ملليلترات من الوسط الاصطناعي الكامل الخالي من اليوراسيل.

أحضر 9 دوارق هزازة سعة 250 ملليلتر، وأضف 25 ملليلتر من وسط SC minus URA إلى كل منها. بعد ذلك، جهز سبعة من هذه الدوارق بتخفيفات مختلفة من beta estradiol كما هو موضح في البروتوكول النصي، وذلك عن طريق إجراء تخفيف تسلسلي بمقدار عشرة أضعاف من محلول مخزون beta estradiol بتركيز 25 ميليمولار، مع إضافة 125 ميكرولتر من المزارع الليلية إلى هذه الدوارق السبعة. وبالنسبة للدوارق الاثنين المتبقيين، يتم تلقيحهما بسلالة منتجة لـ GFP بشكل تأسيسي وسلالة تفتقر إلى GFP؛ حيث يلزم ذلك لمعايرة جهاز قياس التدفق الخلوي.

رج القارورة بسرعة 200 RPM وعند درجة حرارة 30 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 12 و18 ساعة. بعد ذلك، اسحب 500 µL من كل مزرعة وقم بتركيزها عن طريق الطرد المركزي في أنابيب إيبندورف منفصلة سعة 1.7 mL. بعد شفط السائل الطافي، اشطف الخلايا المترسبة مرة واحدة باستخدام محلول منظم لقياس التدفق الخلوي، ثم أعد تعليق الخلايا في 1 mL من المحلول المنظم نفسه.

بعد ذلك، أضف 1 mL من منظم التدفق الخلوي (flow cytometry buffer) إلى تسعة من أنابيب فالكون (falcon tubes). ثم أضف الخلايا المعاد تعليقها إلى المنظم الموجود في أنابيب فالكون ليكون الحجم النهائي مساوياً لـ 2 mL. وأخيراً، قم بإجراء تحليل التدفق الخلوي.

استخدم التشتت الأمامي والتشتت الجانبي لتحديد خلايا الخميرة. اضبط معدل التدفق على 3000 خلية في الثانية تقريباً. قم بقياس GFP من خلال القناة 50، ثم تابع كما ورد في البروتوكول النصي من المخزونات المجمدة عبر تخطيط كل من سلالة تحتوي على A TF وسلالة تفتقر إلى A TF على وسط YPD. بعد يومين من النمو، قم بتلقيح أنابيب زراعة منفصلة تحتوي على خمسة ملليلترات من وسط YPD السائل، وازرع كل سلالة طوال الليل عند 30 درجة Celsius.

قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لمحلول مخزون من beta estradiol بتركيز 0.25 millimolar حتى تصل إلى تخفيف بمقدار 10,000 ضعف في 100% ethanol. أضف 40 µL من كل مزرعة ليلية إلى 10 mL من وسط YPD السائل. لكل سلالة، أضف 96 µL من الخلايا المخففة إلى 18 بئراً من طبق يحتوي على 96 بئراً.

ثم أضف 4 µL من beta estradiol إلى الخلايا. ومن النقاط الجوهرية التأكد من أن كل بئر يحتوي على نفس الكمية الإجمالية من الإيثانول. قم بإجراء تجربة ثلاثية بحيث تكون ثلاث من الآبار لكل سلالة تحتوي على الإيثانول فقط.

تُغطى الضوابط في طبق 96 بئراً بغشاء نفاذ للغاز. يتم مراقبة النمو عند كثافة ضوئية تبلغ 600 nanometers باستخدام قارئ الأطباق. تُحدد معدلات النمو باستخدام أي عدد من الطرق، مثل إيجاد أقصى ميل.

بعد تحضير البلازميد وفقاً للتعليمات الواردة في بروتوكول PCR النصي، قم بتضخيم كاسيت محفز can MX. قم بتحويل ناتج PCR إلى سلالة تعبر عن A TF باستخدام طريقة خلات الليثيوم، ثم ازرع الخلايا المحولة على وسط YPD وقم بنقلها في اليوم التالي إلى وسط YPD مضاف إليه المضاد الحيوي G418. وأخيراً، تحقق من الإدخال الصحيح للمحفز باستخدام البادئ الأمامي وبادئ عكسي داخلي للجين الذي تم استبدال محفزه.

يبلغ طول ناتج PCR النهائي حوالي 1.2 KB. يظهر هنا تحفيز GFP بواسطة ثلاثة أزواج مختلفة من محفزات TF وهي Z four EVZ three EV، أو GEV بمرور الوقت استجابةً لـ 1 µM من beta estradiol. لاحظ الزيادة في إنتاج GFP استجابةً لـ ATFs التي تحتوي على نطاقات ربط DNA غير خميرية. قد ينتج ذلك عن تحقيق هذه العوامل خصوصية جين واحدة في جينوم الخميرة.

يؤدي تحريض GEV وحده إلى تنشيط أو كبح مئات الجينات، بينما يقوم Z three EV و Z four EV فقط بتنشيط تعبير جين مستهدف موضوع في المصب من محفز اصطناعي يحتوي على مواقع ارتباط مناسبة. هنا، يتم عرض تحريض GFP بواسطة Z three EV استجابةً لـ 0 nM من beta estradiol، و 1 µM من beta estradiol بعد 18 ساعة من التحريض. كما تم قياس الفلورة من خلايا تفتقر إلى GFP لتوضيح التنظيم الدقيق لنظام Z three EV. وتظهر هنا قدرة Z three EV على تحريض GFP عبر نطاق من تركيزات beta estradiol.

يكشف متوسط الفلورة للتوزيعات أن العلاقة بين تركيز المحفز ومخرجات التعبير هي علاقة متدرجة مع معامل هيل يبلغ واحد تقريبًا، مما يشير إلى ارتباط مستقل لـ Z three EV. بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المصفوفات الدقيقة للتعبير الجيني من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيف يؤثر تغيير التعبير عن جين واحد على أنماط التعبير الجيني في الجينوم. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية هندسة عوامل النسخ الاصطناعية واختبارها والتحقق من فعاليتها. تتحكم عوامل النسخ الاصطناعية هذه بشكل شرطي في تعبير الجينات الموجودة في اتجاه المصب من تسلسلات الحمض النووي المستهدفة المناسبة.