وهناك طريقة الهطول معدلة لعزل البولية Exosomes
يناير 16, 2015
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل الإكسوسومات عن بول الإنسان باستخدام تقنية هطول الأمطار المعدلة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصميم طريقة معدلة لترسيب الإكسوسوم توفر بديلا سريعا وقابلا للتطوير وفعالا لعزل الإكسوزومات عن البول. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا الميتة الكبيرة وحطام الخلايا أولا من عينة البول عن طريق الطرد المركزي ، ويتم نقل الأنفط الذي يحتوي على الإكسوسومات البولية إلى أنبوب جديد. في الخطوة الثانية ، يتم إذابة الحبيبات في محلول معزول يحتوي على DTT لإزالة بروتين سقوط الحصان TAM.
ثم بعد مزيد من الطرد المركزي ، يتم تحضين المادة الطافية الخالية من TP بكاشف TC السريع بين عشية وضحاها لتسريع الإكسوسومات في اليوم التالي. يتم طرد العينات المعالجة بكاشف exo السريع TC مرة أخيرة للحصول على حبيبات الإكسوزوم. في النهاية ، يمكن إجراء عمليات المصب مثل اللطخة الغربية و QPCR في الوقت الفعلي على الإكسوسومات لتحديد المؤشرات الحيوية ذات الأهمية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل ترشيح التمركزية الفائقة وهطول الأمطار هي أن طريقة الذراع لا تتطلب خطوات اعتماد فائقة ، ومن السهل تنفيذها بسرعة نسبيا ، مع توفير عائد إكسوسوم مرتفع ونقي نسبيا للتحليل الجزيئي اللاحق قبل جمع البول. في 3.125 مل من كوكتيل مثبط البروتياز المحضر حديثا إلى وعاء معقم فارغ ، ثم اجمع ما يقرب من 10 مل من البول الفارغ الأول في الوعاء. نقل العينة إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا.
يرجى ملاحظة أنه يمكن أيضا استخدام عينة بول تم جمعها على مدار 24 ساعة لعزل الإكسوسوم عن طريق تخزينها في أربع درجات مئوية. قم بتدوير الأنابيب لمدة 10 دقائق عند 17،000 GS و 37 درجة مئوية لإزالة أو فصل الحطام الخلوي عن الإكسوسومات البولية. بعد ذلك ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول العزل.
احتضان الحبيبات مع DTT بتركيز نهائي قدره 200 ملليغرام لكل مليلتر عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دوامة العينة كل دقيقتين. ثم عندما تذوب الحبيبات تماما ، أضف 500 ميكرولتر من محلول العزل إلى العينة وقم بتدوير التعليق الناتج على الفور.
تجمع المادة الطافية مع المادة الطافية التي تم جمعها مسبقا وإعادة التعليق ، الحبيبات الجديدة في 50 ميكرولتر من محلول العزل. لتحليل صفحة SDS لعزل الإكسوسومات ، احتضان أولا 11 مل من المادة الطافية المجمعة مع 3.3 مل من كاشف TC السريع عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل. بعد الحضانة ، تقوم العينة بالطرد المركزي ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد لتحليل صفحة SDS وتستخدم الحبيبات التي تحتوي على الإكسوسومات البولية لاستخراج D-N-A-R-N-A أو البروتين ، أو تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لتحديد تركيزات الحمض النووي والحمض النووي الريبي لكل عملية استخراج عن طريق قياس الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر باستخدام ميكرولترين من العينة هنا. يظهر استنساخ معدل لتحليل صفحة SDS واكتشاف المؤشرات الحيوية باستخدام تحليل الدم الغربي في الممرات ذات البول غير المعالج ولوحظ أول حظر لبروتين الحبيبات البولية المقابل ل 90 إلى 100 كيلودلتون مما يشير إلى وجود وإزالة بروتين سقوط الحصان TAM على التوالي في ممرات حبيبات الطاف والإكسوسوم النهائية. لم يلاحظ نطاق بروتين سقوط الحصان TAM مما يشير إلى إزالة بروتين سقوط الحصان TAM في الخطوات السابقة مما أدى إلى زيادة إنتاجية حبيبات الإكسوزوم.
في هذه التجربة ، تم اكتشاف المؤشرات الحيوية Alex و TSG 1 0 1 حتى عند استخدام كميات منخفضة من العينة مما يشير إلى حبيبات إكسوسوم نقية جدا لتحليل المؤشرات الحيوية وغياب البروتينات القابلة للذوبان بكثرة ، بما في ذلك بروتين سقوط الحصان TAM بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكلى المزمنة لاستخدام الإكسوسومات المعزولة بالبول للكشف المبكر عن اعتلال الكلية السكري وتشخيصه.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً لعزل الإكسوسومات من البول البشري باستخدام تقنية ترسيب معدلة. تهدف هذه الطريقة إلى توفير بديل سريع وقابل للتوسيع وفعال لعزل الإكسوسومات.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء
- أبحاث الإكسوزومات
خلفية علمية
- تعد الإكسوسومات حويصلات خارج خلوية صغيرة تشارك في التواصل بين الخلايا.
- يمكن أن يوفر عزل الإكسوسومات من البول رؤى حول عمليات بيولوجية مختلفة.
- قد تكون الطرق الحالية مستهلكة للوقت وأقل كفاءة.
- يمكن لتقنية ترسيب معدلة أن تعزز استعادة الإكسوسومات.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة سريعة لعزل الإكسوسومات من البول.
- تحسين القابلية للتوسع وفعالية استخلاص الإكسوسومات.
- تسهيل التطبيقات اللاحقة مثل تحديد المؤشرات الحيوية.
الطرق المستخدمة
- الطرد المركزي لإزالة الخلايا الكبيرة والبقايا من عينات البول.
- إذابة الراسب في محلول العزل الذي يحتوي على DTT.
- تحضين السائل الطافي مع كاشف exo quick TC طوال الليل.
- الطرد المركزي النهائي للحصول على راسب الإكسوسومات.
النتائج الرئيسية
- تنجح الطريقة المعدلة في عزل الإكسوسومات من البول.
- يمكن استخدام الإكسوسومات في التحليلات اللاحقة مثل Western blot و qPCR.
- يؤدي الإزالة الفعالة للملوثات إلى تعزيز نقاء الإكسوسومات المعزولة.
- يتميز البروتوكول بقابلية التوسع للتعامل مع أحجام عينات أكبر.
الاستنتاجات
- تُعد تقنية الترسيب المعدلة طريقة فعالة لعزل الإكسوسومات.
- يمكن لهذا النهج أن يسهل أبحاث الإكسوسومات في مختلف الدراسات البيولوجية.
- قد تستكشف الدراسات المستقبلية تطبيقات إضافية للإكسوسومات المعزولة.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في الصناعة
يتيح عزل الإكسوسومات البولية اكتشاف المؤشرات الحيوية غير الغازية لأمراض الكلى، مما يدعم الكشف المبكر وتقليل المخاطر الميكانيكية في تطوير العلاجات الكلوية. وتوفر طريقة الترسيب المعدلة بديلًا قابلاً للتوسع وعالي الإنتاجية مقارنة بالطرد المركزي الفائق، مما يحسن قابلية التكرار والإنتاجية لسير عمل التحقق من الأهداف. ويعزز هذا النهج الثقة التنبؤية في تحديد المؤشرات الحيوية من خلال تقليل التلوث وزيادة نقاء الإكسوسومات من أجل التنميط الجزيئي اللاحق.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء الفرضيات العلاجية من خلال عزل الإكسوسومات التي تعكس الحمولة الخاصة بنوع الخلايا من قطاعات النفرون.
- القيمة التشغيلية: يوفر طريقة سريعة وقابلة للتوسع لعزل الإكسوسومات دون الحاجة إلى الطرد المركزي الفائق، مما يقلل من التباين التقني.
- القيمة التنبؤية: يزيد من الموثوقية في الكشف عن المؤشرات الحيوية من خلال الحصول على رواسب إكسوسومات عالية النقاوة وغنية بـ miRNA و mRNA لغرض التنميط.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تحضير عينات إكسوسوم (exosome) موثقة للاختبارات اللاحقة مثل Western blot و qPCR للكشف عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بالأمراض.
- القيمة التشغيلية: توحيد عملية عزل الإكسوسومات من خلال سير عمل قائم على الترسيب يتوافق مع معالجة العينات عالية الإنتاجية.
- جاهزية المقايسة: توليد عوائد متسقة من الإكسوسومات مناسبة لاستخراج RNA وتحليل البروتين، مما يدعم الفحص القابل للتكرار للمؤشرات الحيوية.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- الاستمرارية الانتقالية: يدعم الانتقال من اكتشاف المؤشرات الحيوية في البول إلى التحقق قبل السريري من خلال توفير حمولة الإكسوسومات ذات الصلة بالمرض.
- تقليل المخاطر الميكانيكية: يُمكّن من الكشف عن محتوى الإكسوسومات المتغير في حالات القصور الكلوي، مما يوضح المسارات الفيزيولوجية المرضية.
- الثقة التنبؤية: يسهّل اتخاذ قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال ربط المؤشرات الحيوية للإكسوسومات بالعلامات المبكرة لاعتلال الكلية السكري.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل عمليات الاكتشاف، بدءاً من اختبار الفرضيات وصولاً إلى تحديد المركبات الرائدة، مما يتيح عزل المؤشرات الحيوية بطريقة غير جراحية، وهو ما يساهم في توجيه عملية اختيار الأهداف وضمان الاستمرارية في المرحلة قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال عزل الإكسوسومات التي تعكس الشحنات النوعية للخلايا الأصلية في خلايا المسالك البولية.
- الفحص: يوفر مخرجات كمية وقابلة للتكرار من الإكسوسومات، مما يجعلها مناسبة لتطوير مقايسات المؤشرات الحيوية وفحص المركبات.
- التحليلات: يتيح قياس مستويات البروتين والـ RNA المرتبطة بالإكسوسومات عبر تقنيتي qPCR و Western blot لإجراء تحليل مقارن للحالات.
- البحث الانتقالي: يربط المؤشرات الحيوية للإكسوسومات البولية بالنماذج قبل السريرية لأمراض الكلى من خلال الكشف عن الشحنات ذات الصلة بالمرض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس لمنصة عزل معيارية وقابلة للتوسع يمكن تطبيقها على أنواع متعددة من عينات البول والبرامج البحثية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز من التحقق من صحة الهدف عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي من خلال عزل الإكسوسومات النقية لتوصيف المؤشرات الحيوية.
- القيمة التشغيلية: تحسن التقييس وقابلية التوسع من خلال إلغاء خطوات الطرد المركزي الفائق وتبسيط تدفق العمل.
- القيمة الاستراتيجية: تدعم اتخاذ قرارات أفضل بشأن المضي قدماً أو التوقف عن المشروع من خلال زيادة الثقة في الكشف المبكر عن المؤشرات الحيوية لأمراض الكلى.
- التأثير على مجموعة المشاريع: تتيح تحديد الأولويات للمرشحين للعلاجات الكلوية وفقاً للمخاطر المعدلة بناءً على بيانات قوية للمؤشرات الحيوية للإكسوسومات.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في بيولوجيا الإكسوسومات والتقنيات الجزيئية مثل استخلاص RNA وqPCR.
- يتطلب الوصول إلى معدات الطرد المركزي، وكاشف ExoQuick TC، وأدوات القياس الطيفي لتقدير كمية RNA/DNA.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان اتساق أوقات الحضن ودرجات الحرارة والتعامل مع الكواشف.
- يتطلب مراعاة اعتبارات التكيف عند تطبيق الطريقة على بروتوكولات جمع البول المختلفة أو ظروف التخزين.
- تشمل القيود العملية الحاجة إلى الحضن طوال الليل والتعامل بعناية لتجنب فقدان الإكسوسومات أثناء عمليات النقل.
