January 16th, 2015
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل الإكسوسومات عن بول الإنسان باستخدام تقنية هطول الأمطار المعدلة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تصميم طريقة معدلة لترسيب الإكسوسوم توفر بديلا سريعا وقابلا للتطوير وفعالا لعزل الإكسوزومات عن البول. يتم تحقيق ذلك عن طريق إزالة الخلايا الميتة الكبيرة وحطام الخلايا أولا من عينة البول عن طريق الطرد المركزي ، ويتم نقل الأنفط الذي يحتوي على الإكسوسومات البولية إلى أنبوب جديد. في الخطوة الثانية ، يتم إذابة الحبيبات في محلول معزول يحتوي على DTT لإزالة بروتين سقوط الحصان TAM.
ثم بعد مزيد من الطرد المركزي ، يتم تحضين المادة الطافية الخالية من TP بكاشف TC السريع بين عشية وضحاها لتسريع الإكسوسومات في اليوم التالي. يتم طرد العينات المعالجة بكاشف exo السريع TC مرة أخيرة للحصول على حبيبات الإكسوزوم. في النهاية ، يمكن إجراء عمليات المصب مثل اللطخة الغربية و QPCR في الوقت الفعلي على الإكسوسومات لتحديد المؤشرات الحيوية ذات الأهمية.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل ترشيح التمركزية الفائقة وهطول الأمطار هي أن طريقة الذراع لا تتطلب خطوات اعتماد فائقة ، ومن السهل تنفيذها بسرعة نسبيا ، مع توفير عائد إكسوسوم مرتفع ونقي نسبيا للتحليل الجزيئي اللاحق قبل جمع البول. في 3.125 مل من كوكتيل مثبط البروتياز المحضر حديثا إلى وعاء معقم فارغ ، ثم اجمع ما يقرب من 10 مل من البول الفارغ الأول في الوعاء. نقل العينة إلى أنابيب مخروطية سعة 15 ملليلترا.
يرجى ملاحظة أنه يمكن أيضا استخدام عينة بول تم جمعها على مدار 24 ساعة لعزل الإكسوسوم عن طريق تخزينها في أربع درجات مئوية. قم بتدوير الأنابيب لمدة 10 دقائق عند 17،000 GS و 37 درجة مئوية لإزالة أو فصل الحطام الخلوي عن الإكسوسومات البولية. بعد ذلك ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وإعادة تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من محلول العزل.
احتضان الحبيبات مع DTT بتركيز نهائي قدره 200 ملليغرام لكل مليلتر عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. دوامة العينة كل دقيقتين. ثم عندما تذوب الحبيبات تماما ، أضف 500 ميكرولتر من محلول العزل إلى العينة وقم بتدوير التعليق الناتج على الفور.
تجمع المادة الطافية مع المادة الطافية التي تم جمعها مسبقا وإعادة التعليق ، الحبيبات الجديدة في 50 ميكرولتر من محلول العزل. لتحليل صفحة SDS لعزل الإكسوسومات ، احتضان أولا 11 مل من المادة الطافية المجمعة مع 3.3 مل من كاشف TC السريع عند أربع درجات مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل. بعد الحضانة ، تقوم العينة بالطرد المركزي ، ثم انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد لتحليل صفحة SDS وتستخدم الحبيبات التي تحتوي على الإكسوسومات البولية لاستخراج D-N-A-R-N-A أو البروتين ، أو تخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لتحديد تركيزات الحمض النووي والحمض النووي الريبي لكل عملية استخراج عن طريق قياس الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر باستخدام ميكرولترين من العينة هنا. يظهر استنساخ معدل لتحليل صفحة SDS واكتشاف المؤشرات الحيوية باستخدام تحليل الدم الغربي في الممرات ذات البول غير المعالج ولوحظ أول حظر لبروتين الحبيبات البولية المقابل ل 90 إلى 100 كيلودلتون مما يشير إلى وجود وإزالة بروتين سقوط الحصان TAM على التوالي في ممرات حبيبات الطاف والإكسوسوم النهائية. لم يلاحظ نطاق بروتين سقوط الحصان TAM مما يشير إلى إزالة بروتين سقوط الحصان TAM في الخطوات السابقة مما أدى إلى زيادة إنتاجية حبيبات الإكسوزوم.
في هذه التجربة ، تم اكتشاف المؤشرات الحيوية Alex و TSG 1 0 1 حتى عند استخدام كميات منخفضة من العينة مما يشير إلى حبيبات إكسوسوم نقية جدا لتحليل المؤشرات الحيوية وغياب البروتينات القابلة للذوبان بكثرة ، بما في ذلك بروتين سقوط الحصان TAM بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أمراض الكلى المزمنة لاستخدام الإكسوسومات المعزولة بالبول للكشف المبكر عن اعتلال الكلية السكري وتشخيصه.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
يصف هذا المخطوط بروتوكولًا لعزل الإكسوزميات من بول الإنسان باستخدام تقنية ترسيب معدلة. تهدف الطريقة إلى توفير بديل سريع وقابل للتطوير وفعال لعزل الإكسوزميات.
Isolating urinary exosomes enables non-invasive biomarker discovery for kidney disease, supporting early detection and mechanistic de-risking in renal therapeutic development. The modified precipitation method offers a scalable, high-yield alternative to ultracentrifugation, improving reproducibility and throughput for target validation workflows. This approach enhances predictive confidence in biomarker identification by reducing contamination and increasing exosome purity for downstream molecular profiling.
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling non-invasive biomarker isolation that informs target selection and preclinical continuity.