تحليل ترجمة بدء أثناء حالة الإجهاد التي كتبها Polysome التنميط

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس آثار ظروف الإجهاد على الترجمة وبدء خلايا وأنسجة الثدييات عن طريق التنميط متعدد الجدول. يتم تحقيق ذلك عن طريق معالجة الخلايا السرطانية للثدييات أولا بدواء مضاد للسرطان ثم تحضير مستخلصات الخلايا. الخطوة الثانية هي صنع السكروز والتدرجات.

بعد ذلك ، يتم تحميل مستخلصات الخلايا على السكروز والتدرجات والطرد المركزي الفائق لفصل الكسور الريبوزومية. في النهاية ، يتم إجراء تحليل اللطخة الغربية باستخدام أجسام مضادة محددة لتقييم ارتباط البروتينات المختبرة مع البوليسوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لطريقة موجودة مثل وضع العلامات الأيضية ، هي أنها تسمح لنا بتقييم تأثير ظروف الإجهاد على خطوة بدء الترجمة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علاج الإجهاد ، مثل ما إذا كانت الأدوية المضادة للسرطان تؤثر على بدء الترجمة وكيف تؤثر عليها. يمتد تأثير هذه التقنية إلى علاج السرطان لأنها تساعد على الكشف عن مسارات تنظيمية جديدة لبدء الترجمة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتنظيم بدء الترجمة في مزارع الخلايا ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل الأنسجة المعزولة ، بما في ذلك الدماغ والأورام.

لإعداد نظام تجزئة تدرج الكثافة الآلي أولا ، اغسل نظام أنابيب الجهاز بنسبة 0.1٪ SDS لمدة خمس دقائق. ثم اغسل نظام الأنابيب بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بمحلول RNA Zap لمدة خمس دقائق. وأخيرا ، مع DEPC ، الماء ، قم بتجفيف نظام الأنابيب عن طريق ضخ الهواء في النظام.

بعد ذلك ، قم بإعداد محاليل 15٪ و 55٪ السكروز التي تولد التدرج الخطي من 15 إلى 55٪ من السكروز باستخدام نموذج ISCO واحد 60 متدرج سابق. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، من المهم التحكم بعناية في سرعة المضخة التمعجية ثلاثية لتجنب تكوين فقاعات أو اضطرابات في التدرجات خلال الوقت الذي يعمل فيه برنامج صانع التدرج بتبريد جهاز الطرد المركزي الفائق إلى أربع درجات مئوية. حافظ على التدرجات عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام تستخدم هذه التجربة خلايا سرطان عنق الرحم منخفضة الممر التي تم طلاؤها مسبقا للوصول إلى 80٪ التقاء.

في يوم التجربة. من المهم إجراء عمليات استخراج من خلايا جديدة وتجنب تلوث الحمض النووي الريبي أثناء هذا الإجراء ، قبل 90 دقيقة من إضافة الدواء المضاد للسرطان ، استبدل وسط الخلايا بوسط جديد وكامل. لتحفيز الترجمة ، أعد الخلايا إلى الحاضنة.

أضف الدواء المضاد للسرطان مباشرة إلى مزرعة الخلايا كإضافة تحكم. يحتضن DMSO لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون بعد أربع ساعات ، ضع الأطباق على الثلج واغسل الخلايا ثلاث مرات بخلايا حصاد PBS الباردة في مليلتر واحد من مخزن التحلل للحصول على أفضل النتائج. استخدم ما يقرب من 12 مليون خلية لكل حالة تجريبية.

انقل الخلايا من الألواح المكشطة إلى أنبوب einor واخلطها جيدا عن طريق تمريرها 15 مرة عبر حقنة. دع محللات الخلية ترتاح على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، ضع بضع قطرات من محللة الخلية على شريحة وقم بتقييم التحلل الخلوي عن طريق الفحص المجهري الطور باستخدام هدف 10 ×.

بمجرد التحقق من تحلل الخلية ، قم بتوضيح تحلل الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 11 ، 000 جي ثانية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. انقل المحللات القابلة للذوبان التي تحتوي على الريبوسومات المتعددة إلى أنبوب جديد واحتفظ بها على الجليد قبل تحميل المستخلصات السيتوبلازمية على تدرجات السكروز. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي الموجود باستخدام مقياس الطيف الضوئي بعناية وقم بتحميل ما يقرب من 20 OD وحدتين 60 من المستخلص على تدرج السكروز من 15 إلى 55٪.

تأكد من وجود ملليمترين إلى ثلاثة ملليمترات من المساحة المتاحة على سطح الأنبوب لتجنب فيضان الأنبوب أثناء الطرد المركزي. قم بتحميل الأنابيب على الدوار. ضع الدوار على جهاز الطرد المركزي الفائق وقم بالطرد المركزي للتدرجات عند 230،000 جيجابايت عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين و 30 دقيقة.

عند اكتمال الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب وضعها على الجليد بعناية دون إزعاج التدرجات. لبدء تجزئة المستخلصات السيتوبلازمية ، ضع تدرجات السكروز على نظام تجزئة الكثافة الآلي واستمر في التجزئة الآلية وجمع الكسور كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. اجمع كل جزء 0.5 ملليلتر في أنابيب einor فردية مع المراقبة المستمرة للامتصاص عند 250 نانومتر بالتوازي مع عملية تجزئة التدرج ، سيتم تحرير ملف تعريف الريبوسومات المتعددة على ورقة الرسم البياني في نهاية كل تشغيل.

انقل أنابيب الحافة ذات الكسور المجمعة على الجليد. لبدء هذا الإجراء ، أضف مجلدين من الإيثانول البارد بنسبة 100٪ إلى كل جزء تم جمعه ، واترك مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي تترسب عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها. لاستخراج البروتينات ، يترسب كل بروتين من بروتين الحمض النووي الريبي بجهاز طرد مركزي عند 11 ، 000 جي ثاني لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية بعد الغسيل بتجفيف هواء الإيثانول بنسبة 70٪ وإعادة تعليق الرواسب.

مخزن مؤقت لعينة صفحة SDS قبل الشروع في تحليل اللطخة الغربية لاستخراج RNA Resus ، قم بتعليق كل راسب بروتين RNA في محلول التحلل الذي يحتوي على 0.1٪ SDS لهضم مكون بروتيني من الراسب بملليغرامين لكل مليلتر من بروتيناز K لمدة 30 دقيقة. في حمام مائي بنسبة 55٪ مئوية ، أضف حجما واحدا من كلوروفورم الفينول ، ومجلدين من الكلوروفورم و 0.1 حجم من اثنين من أسيتات الصوديوم المولية الأس الهيدروجيني أربعة. اتركه يرتاح على الثلج لمدة 15 دقيقة.

جهاز طرد مركزي عند 10 ، 000 GS عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. اجمع المرحلة المائية الناتجة لكل عينة من الحمض النووي الريبي المترسب عن طريق إضافة حجم واحد من الأيزوبروبانول و 0.2 ميكروغرام لكل ميكرولتر من الجليكوجين وتركه عند 20 درجة مئوية تحت الصفر بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، قم بتدوير الراسب عند 10،000 Gs عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

قم بإزالة المادة الطافية واغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بنسبة 70٪ من الإيثانول البارد ، وأعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي إلى حجم صغير من الحمض النووي الريبي. مياه مجانية. تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس ضوئي الطيفي.

تظهر هنا ملامح تمثيلية متعددة الجسيمات من المستخلصات السيتوبلازمية. أعدت من خلايا الهليكوبتر المزروعة إما في ظروف طبيعية أو بعد العلاج بمثبط البروتيازوم لمدة أربع ساعات وجهاز الطرد المركزي قام بحجم 15 إلى 55٪ لوزن التدرج الخطي للسكروز. يشار إلى مواضع 40 ثانية ريبوسومات 60 ثانية ، والريبوسومات 80 ثانية ، والأمونو والبولي سوم في كل ملف تعريف.

تظهر الكسور من أعلى إلى أسفل التدرج من الكسور اليسرى إلى اليمنى ، وتم جمعها وتحليلها بواسطة اللطخة الغربية مع الأجسام المضادة ضد بروتين الريبوسومي L 28 الكبير ، بالإضافة إلى البروتين المرتبط بالبوليسوم FMRP الذي يعمل كعناصر تحكم لسلامة البولي سوم في ظل ظروف النمو العادية. يتم تحويل مجمعات بدء الترجمة إلى ريبوسومات متعددة يشهد اكتشافها عن طريق التنميط المتعدد الأشكال بدء الترجمة النشط كما هو ملاحظ هنا. يقلل العلاج بمثبط البروتيازوم من قمم البولي جسيمات مع زيادة مصاحبة في DS Monos مما يشير إلى تثبيط بدء الترجمة أثناء حضور هذا الإجراء ، من المهم العمل في بيئة خالية من الأنف للتعامل مع التدرجات بعناية والتحكم في تحلل الخلايا باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الدم الغربي والدم الشمالي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ارتباط بروتين معين أو M MNA مع البولي سوم يتأثر بالعلاج المضاد للسرطان بعد تطوره. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الترجمة لاستكشاف تأثير تنظيم عوامل بدء الترجمة في الأمراض البشرية مثل السرطان والأمراض التنكسية العصبية.