انخفاض تركيز إتراكونازول والآماد ناجحة في علاج

الهدف العام من هذا الإجراء هو علاج البرمائيات المصابة بفطر البرمائيات Kitt، المعروف باسم Bera key tridium, dendro, he أو BD، باستخدام العلاج الكيميائي المضاد للفطريات at triazole. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تنمية مستنبتات BD وتلقيح الحيوانات بمسببات الأمراض الفطرية. وتتمثل الخطوة الثانية في فحص الحيوانات باستخدام استخلاص DNA وتقنية QPCR على مسحات جلدية للتأكد من حدوث عدوى BD.

بعد ذلك، تُعالج الحيوانات المصابة عن طريق تحميمها بمحلول econazole بتركيز 0.0025% لمدة خمس دقائق يوميًا ولمدة ستة أيام. وتتمثل الخطوة النهائية في مراقبة حالة العدوى لدى الحيوانات المعالجة من خلال إجراء تحليل QPCR على مسحات جلدية لمدة أربعة أسابيع على الأقل بعد انتهاء العلاج لضمان نجاح علاج الحيوان؛ يثبت هذا الإجراء أن استخدام تركيز منخفض وفترة علاج أقصر من مضاد الفطريات itraconazole يعد فعالاً لعلاج الحيوانات المصابة بـ bd. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام نظام العلاج هذا مقارنة بجرعة العلاج الموصى بها، وهي محلول itraconazole بتركيز 0.01% لمدة 11 يومًا، في أن استخدام تركيز منخفض يعادل ربع الجرعة الموصى بها وتقليص مدة العلاج إلى ستة أيام يظل فعالاً في علاج عدوى BD، كما يقلل من الآثار الجانبية السلبية الناتجة عن استخدام جرعة العلاج الموصى بها.

بعد تحضين BD في مرق التريتون (tritone broth) كما هو موضح في البروتوكول النصي والتحقق من حركة أبواغ Zo، اغمر كل طبق بخمسة ملليلتر من ماء الصنبور المعتّق وانتظر لمدة 10 دقائق للسماح لأبواغ ZO بالدخول إلى الوسط. بعد ذلك، صب معلق أبواغ Zo في حاوية محمولة. قم بتقدير تركيز أبواغ ZO باستخدام مقياس كريات الدم (hemocytometer) وخفف الخليط ليصل تركيزه إلى 1×10⁶ لكل 3 ملليلتر باستخدام ماء صنبور معتّق لتلقيح حيوان مثل Latoria vei Alpina الموضح هنا.

أمسكه فوق حاوية سعة 50 milliliter واسكب ثلاثة milliliters من خليط اللقاح فوق منطقة البطن. بعد ذلك، ضع الحيوان داخل الحاوية مع السوائل المنسكبة من اللقاح. ضع غطاءً على الحاوية واترك الحيوان في حاوية التلقيح لمدة 24 hours لضمان حدوث العدوى.

لمنع التلوث بممرض BD. قم بإزالة القفازات القديمة ووضعها لتعقيمها بجهاز autoclave قبل التخلص منها. بعد ارتداء زوج جديد من القفازات، ابدأ بتلقيح الحيوان التالي.

بعد مرور 24 ساعة على التلقيح، تُعاد الحيوانات إلى مساكنها (terraria) الفردية والمعقمة لمدة أسبوعين. تذكر تعقيم جميع النفايات السائلة قبل التخلص منها عن طريق جعل المحلول يحتوي على 10%bleach بعد مرور الأسبوعين. يتم اختبار نجاح الإصابة بـ BD عن طريق مسح الحيوانات باستخدام مسحة قطنية معقمة.

قم بتدوير المسحة برفق أثناء وببن المسحات. امسح خمس مرات على الجانب البطني من كل جانب، وكل فخذ، وكل طرف من الأطراف الأربعة، بإجمالي 45 مسحة. تُحفظ المسحات في أنابيب دقيقة سعة 1.5 milliliter عند درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

استخلص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (genomic DNA) من المسحات باستخدام طقم عزل DNA متوفر تجارياً، وأجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (QPCR) كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتحضير ثلاثة أحواض معالجة، حوض واحد لكل جرعة من جرعات itraconazole الثلاث كما هو موصوف في البروتوكول النصي. بعد ذلك، ضع البرمائيات بشكل فردي في أوعية معقمة.

عبوات معدنية سعة 50 milliliter تحتوي على 35 milliliters من محلول المعالجة. مع مراعاة تغيير القفازات بين كل حيوان والآخر، قم بتدوير العبوة بلطف من حين لآخر لضمان تغطية الحيوانات بالكامل لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، أعد الحيوانات إلى منطقتها المطهرة.

كرر المعالجة لمدة خمس دقائق يومياً لمدة خمسة أيام إضافية. اختبر الحيوانات مرة أخرى للكشف عن عدوى BD بعد أسبوع من انتهاء العلاج، ومرة واحدة أسبوعياً لمدة أربعة أسابيع للتأكد من زوال العدوى. يرجى ملاحظة أنه حتى بعد اكتمال العلاج، يجب التعامل مع الحيوانات كما لو كانت لا تزال تمثل خطراً للتلوث.

يجب الاحتفاظ بالحيوانات في منطقة منفصلة لمدة شهر واحد على الأقل بعد الإصابة. وفي حال عدم نجاح العلاج، يجب تكراره. تستجيب الأنواع المختلفة والمراحل العمرية المختلفة بشكل متفاوت للإصابة ولأنظمة العلاج، ولذلك يجب تجربة العلاج قبل تطبيقه على نطاق واسع.

نظرًا لأن مرض BD يمثل خطرًا بيولوجيًا، قم بتطهير كل حوض تربية أسبوعيًا عن طريق غمر حوض التربية وحاويات المعالجة في محلول مبيض بتركيز 10%. انقعها لمدة 30 ثانية على الأقل، ثم اغسل المبيض بمرتين من الشطف بالماء، واترك الحاويات لتجف لمدة 24 ساعة قبل إعادة استخدامها لبقاء الضفادع. يظهر هنا ما بعد 11 يومًا من العلاج من BD أو ستة أيام من العلاج من BD.

تشير الأسهم السوداء إلى اليوم الأخير من العلاج. وتشير الخطوط المتصلة إلى بقاء مجموعات الشواهد على قيد الحياة. أما الخطوط السوداء المتصلة فهي تمثل الحيوانات التي كانت إيجابية لـ BD ولكنها لم تتلقَّ علاج BD.

وتشير الخطوط الرمادية المتصلة إلى الحيوانات التي كانت سالبة لمرض BD ولم تتلق علاج BD. بينما توضح الخطوط المتقطعة معدل بقاء مجموعات العلاج التي تلقت التركيز المحدد من econazole. وكانت جميع الحيوانات التي عولجت بتركيز 0.0025% بواسطة جهاز الإرذاذ (nebuliser) لمدة ستة أيام سالبة لمرض BD بعد أربعة أسابيع من انتهاء العلاج، وبالتالي اعتُبر هذا العلاج ناجحاً.

بالإضافة إلى ذلك، لم تختلف هذه الجرعة من العلاج بـ econazole بشكل ملحوظ في معدل الوفيات عند مقارنتها بمجموعات الضبط الإيجابية المصابة بـ BD. تجدر الإشارة إلى أن العلاج بـ econazole بتركيز 0.01% و 0.005% لمدة 11 يومًا أدى إلى زيادة ملحوظة في معدل الوفيات مقارنة بمجموعات الضبط الإيجابية المصابة بـ BD. لا تنسَ أن الممرض الفطري BD يشكل خطراً بيولوجياً، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة مثل ارتداء القفازات وتغييرها، وتعقيم جميع النفايات الصلبة باستخدام autoclave، والتطهير.

يجب التخلص من جميع النفايات السائلة عند اتباع هذا الإجراء.