من أسفل إلى أعلى وبندقية البروتيوميات من التعرف على القوقعة بروتيوم الشامل

الهدف العام من التجربة التالية هو تحقيق أكبر عدد من تحديدات البروتين من ظهارة القوقعة الحسية باستخدام تقنيات البروتينات المختلفة. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل القوقعة والظهارة الحسية من الفئران البالغة والصوتنة في محلول التحلل للحصول على البروتين كخطوة ثانية. يتم تطبيق استراتيجيات الهضم المختلفة على المحللة الكاملة أو على محللة البروتين المجزأة من أجل تعزيز تغطية تسلسل الببتيد والبروتين.

بعد ذلك ، يتم استخدام تقنيات الفصل المختلفة ، بما في ذلك التبادل الكاتيوني القوي وكروماتوغرافيا الطور العكسي لتقليل تعقيد العينة قبل تحليل المواصفات الكتلية. تظهر النتائج تحديد عدد كبير من البروتينات الغشائية والقابلة للذوبان لظهارة القوقعة الحسية للفأر باستخدام مناهج متعددة للبروتينات ومطياف كتلة عالي الدقة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل المصفوفة الدقيقة للأجسام المضادة والرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد هي أنه يتم تحديد عدد كبير من البروتينات القابلة للذوبان والغشاء ، وبالتالي زيادة بيانات بروتين القوقعة الصناعية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للمؤشرات الحيوية المتعلقة بضعف السمع والتمزق ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل تحديد المؤشرات الحيوية المتعلقة بالعمر وسرطان الثدي أو الرئة. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على دراسة العينات البيولوجية الأخرى مثل الدم. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا مجموعة البيانات البروتينية المحدودة المتاحة من الأذن الداخلية للثدييات ، وعلى وجه الخصوص ، العدد المحدود من بروتينات الغشاء التي تم تحديدها قبل بدء هذا الإجراء.

عزل ظهارة القوقعة الحسية من 30 فأرا بعد الولادة. بعد غسل الأنسجة بمخزن مؤقت فوسفات واحد ، أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الأنسجة وقم بصوتنة الخليط لمدة 30 ثانية على الجليد باستخدام تقطيع صوتي. قم بتبريد المحللة على الجليد لمدة دقيقة واحدة بين كل صوتنة ، ثم صوتنة العينة ما مجموعه ثلاث مرات.

Centra بدمج التعليق عند 16،000 مرة G عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. عند الانتهاء ، احتفظ بالمادة الطافية للهضم. بعد ذلك ، أضف 30 ميكرولتر من مستخلص بروتين القوقعة الصناعية مباشرة إلى مرشح دوران 30 كيلو واخلطه مع 200 ميكرولتر من ثمانية يوريا مولية في جهاز الطرد المركزي Riss HCL.

الخليط في 14 ، 000 مرة جم لمدة 15 دقيقة. عند الانتهاء ، قم بتخفيف التركيز ب 200 ميكرولتر من محلول اليوريا الثماني مولار وكرر الطرد المركزي باستخدام نفس الظروف كما كان من قبل. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولترات من 10 XI oto acetamide ، و 90 ميكرولترا من محلول اليوريا الثمانية مولار إلى التركيز في المرشح والدوامة لمدة دقيقة واحدة.

بعد وضع مرشح الدوران في رف الطرد المركزي الصغير ، احتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام بعد الطرد المركزي عند 14،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من endo protease ly C بنسبة واحد إلى 50 إنزيم إلى بروتين ، واحتضان الخليط طوال الليل عند 30 درجة مئوية. عند الانتهاء ، أضف 40 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار إلى وحدة الترشيح وقم بالطرد المركزي للخليط عند 14 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق بعد تكرار الخطوة السابقة ، اغسل وحدة الفلتر ب 40 ميكرولتر من ثمانية مولي اليوريا. ثم اغسل وحدة الفلتر مرتين ب 40 ميكرولتر من ماء مللي كيو.

بمجرد غسل وحدة المرشح ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار ، أضف 0.4 ميكروغرام لكل ميكرولتر من التربسين بنسبة إنزيم إلى 100 إنزيم إلى بروتين ، واحتضن الخليط طوال الليل عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، قم بتصفية الببتيدات الثلاثية عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملي مولار إلى وحدة الترشيح وقم بالطرد المركزي للخليط عند 14 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق. ثم كرر هذه الخطوة مرة أخرى.

في هذه المرحلة ، قم بحقن 50 إلى 100 ميكروغرام من عينة البروتين المهضومة على عمود تبادل كاتيوني قوي 200 × 2.1 ملم خمسة ميكرومتر لفصل الببتيدات ، راقب كسور الببتيد عند 280 نانومتر واجمع الكسور على فترات دقيقتين. باستخدام مجمع الكسر ، ثم جفف الكسور في مكثف فراغ. عند الانتهاء ، قم بتخزين الكسور المجففة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تصبح جاهزة للاستخدام في الكروماتوغرافيا السائلة.

تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي. في طريقة أخرى ، تم استخدام التجزئة الخالية من الهلام لفصل خليط البروتين. بمجرد تحلية المادة الطافية لبروتين القوقعة الصناعية عن طريق ترسيب الأسيتون ، أضف 30 ميكرولترا من خمسة × عينة عازلة إلى البروتين المحلى المعلق مسبقا في 112 ميكرولتر من ماء Milli Q.

بعد ذلك ، أضف ثمانية ميكرولترات من DTT مولاري واحد وقم بتسخين الخليط على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لتقليل روابط ثاني كبريتيد البروتين. بعد التسخين ، اترك الخليط يبرد. أضف ثمانية ملليلتر من المخزن المؤقت للتشغيل إلى خزان الأنود ، و 150 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتشغيل إلى غرفة جمع العينات ، وستة ملليلتر من المخزن المؤقت للتشغيل إلى خزان الكاثود.

بعد هذا الحمل ، 150 ميكرولتر من خليط بروتين القوقعة الصناعية في غرفة تحميل العينة ، باستخدام خرطوشة أسيتات تريس 8٪ مع نطاق كتلي يتراوح من 3.5 إلى 150 كيلودالتون. بعد بدء التشغيل ، اجمع العينة من غرفة جمع العينات في كل فاصل مؤقت على الجهاز باستخدام ماصة وأضفها إلى أنبوب صغير مسمى حديثا. ثم اغسل غرفة التجميع مرتين باستخدام 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل وتخلص منه.

بعد الرحلان الكهربائي للهلام 1D للكسور الخالية من الهلام. أضف كل كسر فردي مباشرة إلى وحدة مرشح 30 كلفن. ثم امزج كل جزء مع 200 ميكرولتر من ثمانية مولي يوريا في tris HCL بعد الطرد المركزي عند 14 ، 000 مرة G لمدة 25 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من 10 XI oto acetamide في محلول اليوريا إلى التركيز في كل وحدة مرشح ودوامة لمدة دقيقة واحدة.

بعد وضع مرشحات الدوران في رف أجهزة الطرد المركزي الدقيقة ، احتضن العينات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، أضف 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر من LY C لنسبة إنزيم إلى بروتين من واحد إلى 50 إلى وحدات المرشح بعد الحضانة الليلية عند 30 درجة مئوية ، أضف 40 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 مللي مولار إلى مرشحات الدوران وقم بالطرد المركزي للعينات عند 14 ، 000 مرة G لمدة 10 دقائق بعد تكرار الخطوة السابقة مرة واحدة ، اغسل مرشحات الدوران ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولي ، أضف 0.4 ميكروغرام لكل ميكرولتر من التربسين بنسبة واحد إلى 100 إنزيم إلى بروتين بعد الغسيل النهائي. بمجرد احتضان العينات طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، قم بإزالة الببتيدات ثلاثية الحروف من كل وحدة مرشح عن طريق إضافة 40 ميكرولترا من محلول بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمولار والطرد المركزي للعينات عند 14،000 مرة G لمدة 10 دقائق.

بعد تكرار ذلك ، خطوة مرة واحدة ، قم بتحليل العينات عن طريق قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة. كان هناك نوعان من إجراءات الهضم المزدوجة المستخدمة. الأول كان هضما ثلاثيا ، متبوعا بهضم ثان مع التربسين ، والذي تم تجميعه مجزأ على عمود تبادل كاتيوني قوي إلى 18 جزءا ، وتم تحليله بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة النانوية.

تحديد ما مجموعه 1 ، 485 بروتين باستخدام 1٪ FDR عند إجراء مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة لتشغيل واحد. باستخدام هذا النهج التجريبي. من بين البروتينات المحددة ، تم تصنيف 324 و 258 بروتينا في الميتوكوندريا وغشاء البلازما على التوالي.

يتكون إجراء الهضم المزدوج الثاني من هضم Lys C ، يليه هضم التربسين. تم تحميل كل ملخص بشكل فردي وفصله على عمود التبادل الكاتيوني القوي إلى 18 جزءا ، وتم تحليله بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة النانوية. أنتجت نتائج هضم LY C و trypsin ما مجموعه 3،503 بروتين مع 1٪ FDR.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تصنيف 605 و 617 بروتينا في الميتوكوندريا وغشاء البلازما على التوالي. قدم هذا النهج أكبر عدد من معرفات البروتين المرتبطة بالغشاء. تحليل مكرر ل LY C والتربسين.

أظهرت الكسور أن أكثر من 65 من البروتينات التي تم تحديدها تمت مشاركتها بين التجارب. ومع ذلك ، كانت هناك أيضا بروتينات تم تحديدها حديثا في تحليل التكرار. تم تحديد الببتيدات والبروتينات الإضافية بسبب التغييرات الطفيفة في الكروماتوغرافيا ، مما أدى إلى ببتيدات مختلفة للتجزئة.

تم تحضير جل البقع الفضية لتصور نتائج التجزئة الخالية من الهلام كما هو موضح. هنا ، أظهر الجل فصل البروتين عن طريق زيادة الوزن الجزيئي لكل جزء متتالي. لذلك ، تم هضم 12 جزءا سائلا خاليا من الهلام باستخدام طريقتين مختلفتين للهضم متعدد الأوجه وتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة.

تم تنفيذ نهج الهضم الأول باستخدام هضم التربسين المزدوج ، مما أدى إلى تحديد 2،165 بروتين مع 1٪ FDR عند إجراء مطياف الكتلة الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة لتشغيل واحد. في هذه التجربة ، تم تصنيف 516 و 399 بروتينا في الميتوكوندريا وغشاء البلازما على التوالي. تم تنفيذ طريقة الهضم الثانية باستخدام البروتيناز الداخلي في C متبوعا بهضم التربسين ، والكروماتوغرافيا السائلة أحادية التشغيل.

حدد تحليل قياس الطيف الكتلي الترادفي 2،211 بروتين مع 1٪ FDR. أظهر هذا النهج عددا مشابها من البروتينات المرتبطة بالغشاء كما هو الحال عند استخدام نهج التربسين التربسين ، تم إيداع بيانات بروتينات قياس الطيف الكتلي في اتحاد تبادل البروتينات باستخدام معرف مجموعة البيانات PXD 0 0 0 2 3 1. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تجنب التلوث في كل خطوة وإبقاء الأنسجة على الجليد عند إجراء استخراج البروتين لتجنب تدهور البروتين.