تقييم تطوير خلايا الفئران الجذعية بلازماوية في بقع باير طريق نقل بالتبني من أسلاف المكونة للدم

الهدف العام من الإجراء التالي هو فحص قدرة الأسلاف المكونة للدم المنقاة على ظهور الخلايا المتغصنة البلازمية في بقع الأمعاء عند النقل بالتبني. يتم تحقيق ذلك عن طريق إجراء نقل الجينات الهيدروديناميكية للبلازميد أولا ، وترميز عامل نمو الخلية المتغصنة. FLIT ثلاثة روابط في الفئران المصابة بالخلايا المتغصنة البلازمية الصحيحة من PI.

في الخطوة الثانية ، يتم عزل الخلايا السلفية المتغصنة الشائعة عن نخاع العظام البري عن طريق فصل الخرزة المغناطيسية وفرز التدفق. في الخطوة الأخيرة ، يتم نقل الخلايا السلفية بالتبني عن طريق الحقن الوريدي في الفئران المصابة بالخلايا المتغصنة البلازمية التي تم علاجها عن طريق نقل الجينات الهيدروديناميكية. في النهاية ، يمكن تقييم الخلايا السلفية المكونة للدم المانحة المشتقة من PI من الخلايا المتغصنة البلازمية الرقعة PI عن طريق قياس التدفق الخلوي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل ما هو الأصل التنموي لخلايا Cy Dendri في البلازما التي تتمركز داخل بقع القراصنة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لأصل الخلايا المتغصنة البلازمية الرقعة. يمكن تطبيقه أيضا لفهم كيفية تأثير الخلايا المتغصنة البلازمية على مجموعات الخلايا الليمفاوية داخل هذه الأنسجة.

قبل يومين من النقل بالتبني ، قم بتوسيع الأوعية الدموية لخمسة فئران متلقية بالضربة القاضية لمستقبلات الإنترفيرون ألفا الإيجابية CD 45 2 تحت مصباح حراري لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم لكل فأر ، ضع في مصفاة وقم بتطهير الذيل بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، استخدم إبرة قياس 27 لحقن خمسة ميكروغرامات من البلازما وطلاء ثلاثة روابط ومليلترين من PBS المعقم في وريد الذيل لكل.

بالنسبة لمجموعة التحكم ، قم بحقن خمسة ميكروغرامات من ناقل فارغ. بعد مراقبة الفئران لمدة 15 إلى 30 دقيقة ، أعدها إلى منشأتها السكنية. في يوم التجربة ، ضع عظم الفخذ والساق المقطعين من 10 CD 45 1 إيجابي C 57 ستة فئران سوداء في طبق استزراع يحتوي على وسائط كاملة.

ثم أدخل إبرة قياس 27 في أحد طرفي كل عظم واستخدم وسائط كاملة لغسل نخاع العظم في الطبق ثلاث مرات لكل عظم. تأكد من إزالة خلايا نخاع العظم عن طريق التأكد من أن الوسائط المطرودة تبدو غائمة. اصنع تعليقا أحادي الخلية عن طريق سحب الوسائط برفق لأعلى ولأسفل ثلاث إلى خمس مرات في طبق الاستزراع.

ثم قم بإزالة الحطام عن طريق تمرير خلايا نخاع العظم عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر وتعطيل أي كتل خلوية عن طريق تطبيق نهاية مكبس حقنة معقمة برفق. على المصفاة ، قم بتدوير الخلايا ، وإزالة المواد الطافية وقمل خلايا الدم الحمراء في ملليلترين من محلول التحلل كل أربعة إلى ستة أضعاف 10 للخلايا السابعة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 10 ملليلتر من مخزن الفاكس المؤقت إلى خلايا نخاع العظم وقم بتدويره لمدة أربع دقائق عند 500 ضعف G في درجة حرارة الغرفة.

بعد شفط ناتين الكوب برفق ، اغسل الحبيبات في 10 مل من مخزن الفاكس. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الخلايا بعلامة النسب المكونة للدم للتعرف على الأجسام المضادة بعد تلطيخ الأجسام المضادة وغسلها. احتضان الخلايا بميكروبيدات مغناطيسية مضادة للفئران من الماعز.

أثناء حضانة الميكروبياد ، قم بتحميل عمود LD كحد أقصى على فاصل خلية MIDI max وشطف العمود مسبقا بملليلترين من المخزن المؤقت للفاكس. ثم ضع أنبوبا مخروطي سعة 15 مليلتر أسفل العمود وقم بتحميل ما يصل إلى خمسة أضعاف 10 إلى الخلايا الثامنة في 2.5 ملليلتر من المخزن المؤقت للفاكس في العمود. اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام ملليلترين من مخزن الفاكس المؤقت لكل غسلة ، واجمع الخلايا السالبة للنسب التي تمر عبر العمود إلى أنبوب 15 ملليلترا.

عد الخلايا المراوغة. ثم بعد تلطيخ الخلايا بالأجسام المضادة المترافقة الفلورية المناسبة ، انقل العينة إلى أنبوب فاكس لفرز الأسلاف المتغصنة الشائعة على أساس ملف تعريف العلامة المطلوب. اجمع خلايا الفاكس المنقاة في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من الوسائط الكاملة ، ثم في نهاية تشغيل الفاكس سجل العدد المطلق للخلايا التي تم فرزها.

بعد الدوران لأسفل ، تخفف الخلايا مرة واحدة من 10 إلى خمس الأسلاف التغصنية الشائعة المنقاة لكل 100 ميكرولتر الحجم الإجمالي ل PBS المعقم لكل فأر وتستنشق معلقات الخلية في محاقن واحدة مزودة بإبر قياس 27. ثم حقن الخلايا السلفية الإيجابية CD 45 1 في الوريد الذيل لكل متلقي CD 45 2 إيجابي مستقبلات إنترفيرون ألفا بالضربة القاضية كما هو موضح للتو بعد سبعة إلى 10 أيام من نقل التبني. قم بإزالة الأمعاء من الفئران المحقونة للخلايا المتغصنة الشائعة ، ووضع الأنسجة على مناشف ورقية مبللة بنظام تلفزيون

ثم استخدم زوجا من الملقط والمقص الناعم لجمع كل بقع المدافئ المرئية على طول جدار الأمعاء الدقيقة. لاحظ أن بقع الحواق غالبا ما تكون متميزة من الناحية الهيكلية حتى داخل ماوس واحد ، لذا احرص على التأكد من تحديد جميع بقع P'S وتشريحها. اغسل لصقات P المعزولة ثلاث مرات في طبق بتري يحتوي على PBS باستخدام ملقط لإزالة البراز.

ثم هضم بقع P'S بملليغرام واحد لكل مليلتر ، والكولاجيناز أربعة في 10 ملليلتر من HBSS في قارورة 50 مليلتر مع التحريك القوي عند 37 درجة مئوية. بعد ساعة ، اسكب رقع PIs المهضومة في مصفاة خلية 40 ميكرومتر واستخدم مكبس حقنة معقمة لإجبار الخلايا على الدخول في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. بعد تدوير تعليق الخلية المصفاة, أعد تعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من 37٪ لكل محلول مكالمة ونقلها إلى 15 أنبوب ملليلتر.

ثم ضع برفق ستة ملليلتر من 70٪ لكل محلول مكالمة تحتها لتشكيل تدرج لكل خطوة مكالمة. الآن افصل الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 800 مرة جم في درجة حرارة الغرفة مع الانفصال. ثم اجمع عدد الخلايا أحادية النواة في الواجهة.

بعد تكوير الخلايا المجمعة ، اغسلها مرتين في 50 مل من الوسائط الكاملة. ثم قم بلطخها بالأجسام المضادة المناسبة للكشف عن رقعة PYS الإيجابية CD 45 1. الخلايا المتغصنة البلازمية المشتقة من أسلاف CD 41 الإيجابية المنقولة بالتبني.

تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. يمكن التعرف على الخلايا المتغصنة البلازمية من خلال CD 11 C إيجابي ، كليك H إيجابي PDCA ، واحد موجب B ، اثنان ، 20 إيجابي CD 11 B ، النمط الظاهري السلبي. أخيرا ، حدد العدد المطلق للخلايا المتغصنة البلازمية باستخدام هذه المعادلة.

تشير هذه المخططات النقطية إلى استراتيجية البوابات لعزل أسلاف التغصنات الشائعة. بالنسبة لخلايا نخاع عظم الفأر ، كما هو موضح للتو ، تشكل الأسلاف المتغصنة الشائعة ما يقرب من 0.1٪ من إجمالي خلايا نخاع العظم وحوالي أربعة إلى ستة أضعاف 10 إلى الرابع. من هذه الخلايا يمكن عزلها من فأر واحد لتحديد الخلايا المتغصنة البلازمية في PI عن طريق قياس التدفق الخلوي.

يتم استخدام استراتيجية ابتدائية للتشتت الأمامي والجانبي متبوعة ببوابة للخلايا الموجبة CD 11 C clec H. تظهر الفئران بالضربة القاضية لمستقبلات إنترفيرون ألفا انخفاضا كبيرا في الخلايا المتغصنة البلازمية التصحيح بالنسبة للفئران من النوع البري. تتمايز الخلايا السلفية المتغصنة الشائعة أيضا إلى خلايا متغصنة تقليدية.

على عكس الخلايا المتغصنة البلازمية CD 11 C إيجابية ، لوحظت الخلايا المتغصنة التقليدية السلبية H بكميات مماثلة في كل من الفئران البرية والضربة القاضية. ومن ثم ، توفر الفئران بالضربة القاضية لمستقبلات الإنترفيرون ألفا فرصة لفحص إعادة تشكيل الخلايا المتغصنة البلازمية لتصحيح PS دون آثار التشعيع المميت. إن النقل بالتبني للأسلاف المتغصنة الشائعة من النوع البري إلى الفئران بالضربة القاضية لمستقبلات الإنترفيرون ألفا كما هو موضح للتو يحفز زيادة في الخلايا المتغصنة البلازمية PIs.

علاوة على ذلك ، فإن المعالجة المسبقة بنقل الجينات الهيدروديناميكية FL ثلاثة ligand تعزز توسع الخلايا المتغصنة البلازمية في بقع PIs مما يعني أن الأسلاف المتغصنة الشائعة المنقولة وربما ثلاثة أسلاف إيجابية داخلية FL تستجيب ل FL ثلاثة روابط عن طريق تحفيز الخلايا المتغصنة البلازمية الرقعة البيروس. يحفز كلا الحالتين أيضا إنتاج الخلايا المتغصنة التقليدية السلبية CD 11 C الإيجابية H بما يتفق مع الأصل التنموي للخلايا المتغصنة التقليدية. عبرت الخلايا المتغصنة البلازمية PYS عن علامات الخلايا المتغصنة البلازمية التقليدية بما في ذلك clec H و PDCA one و B two 20 و LAC CD 11 B.In بالإضافة إلى ذلك ، يظهر تحليل بقع PYS من الفئران بالضربة القاضية لمستقبلات الإنترفيرون ألفا التي تتلقى كلا من نقل الجينات الهيدروديناميكية الهيدروديناميكية FL الثلاثة والسلاف المتغصنة الشائعة المنقولة أن حوالي 70٪ من الخلايا المتغصنة البلازمية مشتقة من أسلاف التغصنية المشتركة الإيجابية CD 45 1 المانحة.

بشكل جماعي ، توضح هذه البيانات أن النقل بالتبني للأسلاف المتغصنة الشائعة يحفز PIs رقعة الخلايا المتغصنة البلازمية استجابة لإشارات FL الثلاثة بوساطة في الجسم الحي. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وتحديد خلايا البلازما الصحيحة D بارس.