تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري
January 30th, 2014
الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.
الهدف العام من هذا الإجراء هو مراقبة وتوصيف حركات قوس البلعوم في رأس سمكة الحمار الوحشي النامية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تضمين جنين أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا أولا في هلام مخدر أكروست. الخطوة الثانية هي تركيب جنين الاغاروز المضمن في قطرة من ميثيل السليلوز على شريحة مجهرية.
بعد ذلك ، يتم إغلاق الجنين بين شريحتين مجهريين بشحم مفرغ. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني لإظهار الاختلافات بين النوع البري وسمك الزرد المتحور والحركات المورفولوجية لأقواس البلعوم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق التصوير الثابتة هي أنها تلتقط تطور قوس البلعوم في الوقت الفعلي ، مما يسمح للمحقق بمراقبة حركات الأنسجة الحاسمة لتكوين التشكل بشكل مباشر.
لعمل غطاء جسر ، غراء فائق ، غطاء زجاجي 22 × 22 على كل طرف من طرفي زجاج الغطاء 24 × 60. ترك الوسط مجانيا. اصنع فردي للأجنة التي يقل عمرها عن يوم واحد.
يتضاعف للأجنة التي يبلغ عمرها من يوم إلى أربعة أيام أو ثلاثة أضعاف للأجنة ، خمسة أيام أو أكثر. ولكل عينة ، استخدم زلات غطاء جسر. الآن املأ حقنة 10 ملليلتر بشحم عالي التفريغ.
تحضير مخدر طازج في 0.2٪ سائل وحفظه في كتلة تسخين 42 درجة مئوية. لطلاء الأجنة المعدلة وراثيا غير المفرغة يدويا ، قم بتمزيق كوريان ببطء حتى يتم تحرير الجنين. الآن انقل الأجنة المطلية إلى وسائط نظيفة تحتوي على MS 2 22 والجمالية.
لتحضير زلة غطاء جسر ، ادفع الشحوم المفرغة ببطء خارج المحقنة ، مما يجعل حبة مستمرة ناعمة مجاورة وداخلها وحافة زلة الغطاء. انشر دائرة من 4٪ ميثيل سلولوز في منتصف الجسر لتغطية الانزلاق. عندما يتم تخدير الجنين، اسحبه إلى ماصة زجاجية.
أمسك الماصة عموديا للسماح للجنين بالغرق في قاع السائل في الماصة. ثم انقل الماصة إلى المحلول الزراعي واترك الجنين يسقط في القوس دون طرد السائل. ارسم بعض المحلول الزراعي والجنين في الماصة.
ثم طرد الجنين في قطرة من محلول آرو. فوق ميثيل السليلوز. ادفع الجنين لأسفل على ميثيل السليلوز ووجه الجنين حسب الرغبة للتصوير لإغلاق العينة.
ضع زلة غطاء واحدة ذات جسور أعلى زلة الغطاء المثبتة المتجهة لأسفل. قم بالضغط بشكل متساو على جانبي زلات الغطاء المحصورة حتى تتلامس الجسور بشكل مباشر وتسقط الأختام الزراعية على كلتا زلات الغطاء. تحقق من أن الجنين موجه بشكل صحيح.
افركي قضيبا خشبيا على طول الزجاج لتنعيم الشقوق والفجوات في سرعة الشحوم المفرغة. امسح أي شحوم زائدة من الحواف. قم بتنشيط المجهر متحد البؤر وأي أجهزة ليزر خارجية.
قم أيضا بتشغيل الكمبيوتر المتصل بالمجهر متحد البؤر وحدد نظام بدء التشغيل وبرنامج التصوير متحد البؤر. بعد ذلك ، قم بخفض منصة التدريج للمجهر متحد البؤر وحرك العدسات الموضوعية من موضعها. استبدل المرحلة الافتراضية بمرحلة تسخين إلكترونية.
قم بتشغيل وحدة التحكم للمرحلة الساخنة واضبط درجة الحرارة على 29.5 درجة مئوية. ضع العينة المثبتة على المسرح الساخن. حرك العدسة الموضوعية 20 × إلى موضعها وارفع منصة التدريج.
ثم قم بتنشيط باعث الضوء المرئي وتوسيط رأس الجنين في مجال الرؤية. لتنشيط قنوات التألق ، حدد الطول الموجي الفلوري المراد اكتشافه واختر جداول البحث عن الألوان لكل قناة. لكل قناة مضان ، اضبط شدة الليزر على 10.0 وجهد مضاعف الصورة بين 600 و 700.
لتقليل الخلفية وزيادة معلومات الفلورسنت التي تم جمعها ، اضبط المتوسط على اثنين أو أربعة وعمق البت على 16 بت. قم بتنشيط مكدس ZS ووحدات السلاسل الزمنية. اضبط الثقب إذا لزم الأمر.
اضبط الفاصل الزمني وطول التجربة. أدر الكاميرا إلى الوضع المباشر. اضبط التركيز وقم بزيادة شدة الليزر إذا لزم الأمر.
لرؤية التألق. اضبط التكبير/التصغير الرقمي على 0.6 للحصول على رؤية أوسع. إذا رغبت في ذلك.
ضع المرحلة بحيث تكون جميع الهياكل ذات الأهمية مرئية وهناك مجال في مجال الرؤية للنمو. التركيز ظهريا وأماميا من خلال الجنين إلى الحدود العليا والسفلية للتألق. قم بتعيين مواضع شريحة Zack الأولى والأخيرة على الأقل 100 ميكرومتر أو أكثر خارج هذه الحدود.
بعد ذلك ، قم بتعيين جدول البحث عن العرض على مؤشرات النطاق بحيث تظهر هياكل الفلورسنت بظل رمادي ويجب أن يكون باقي الحقل أزرق أو أسود. إذا لزم الأمر، قم بزيادة جهد مضاعف الصورة إلى مستوى أقل بقليل من حيث تظهر وحدات البكسل الحمراء المشبعة. إذا ظهرت هياكل الفلورسنت باللون الأحمر ، قلل من شدة الليزر و / أو الكسب حتى تصبح ظلا رماديا.
إذا لزم الأمر، اضبط الإزاحة. لذا فإن المناطق خارج العينة زرقاء. اضبط أصغر قطر يسمح بجمع الصور في الوقت المناسب.
يجب دائما ضبط الفاصل الزمني Z على المسافة المثلى المقترحة لقطر الثقب ، وإجراء عمليات مسح قصيرة لاختبار الإعدادات ، باستخدام أقل كثافة ليزر ممكنة دائما. الآن قم بتشغيل التجربة للمدة الزمنية المطلوبة. بعد ذلك ، قم بإزالة الجنين من المرحلة الساخنة وافصل زلات الغطاء ببطء ، واغمر الغطاء ، وانزلق والجنين في طبق بتري 30 ملم.
باستخدام ماصة زجاجية ، اغسل الجنين برفق من زلة الغطاء وقم بإزالة زلة الغطاء من طبق بتري. ضع الجنين في حاضنة 28.5 درجة مئوية لمواصلة التطور. في نهاية التجارب ، التقط صورا فردية من Zack لأجنة الأشقاء المثبتة على agros والتي تم تنظيمها بشكل مشابه للعينة في بداية التجارب ، ولكن تم رفعها EM وحاضنة 28.5 درجة مئوية.
قم بقياس أقواس البلعوم حسب الحاجة باستخدام برنامج متحد البؤر أو برامج معالجة التصوير الأخرى في الأجنة البرية. بعد مجموعة القمة العصبية ، تستطيل الأقواس البلعومية على طول AEs الخلفي الأمامي والبطني الظهري أثناء التحرك في الاتجاه المنقاري. في نهايته الأمامية ، يتشكل القوس البلعومي الأول من مجالات الفك العلوي والفك السفلي مفصولة بحركات مورفوجيني رئيسية للأديم الظاهر الفموي تتعطل بشكل كبير في الطفرات الملساءة.
هنا يفشل القوس البلعومي السابع في الهجرة إلى الرولي للتداخل مع المزيد من الأقواس الأمامية بعد 48 ساعة من الإخصاب. أسماك الزرد SM الخمسة لديها العديد من عيوب الوجه في الجمجمة. في هذه الصور متحد البؤر الثابتة.
تظهرالاندماجات في المجالات البطنية للقوسين الثاني والثالث بعد 32 ساعة من الإخصاب. باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني ، نقوم بتحليل تشكل الأقواس البلعومية في Smad ، تظهر خمسة اندماجات طفرية بين القوسين الثاني والثالث أولا بعد 32 ساعة من الإخصاب.
بما يتفق مع التحليل الثابت. في حين أن التعبير عن أفراد عائلة PDGF يشير إلى أنه قد يكون متورطا على نطاق واسع في تكوين القوس البلعومي ، فإن حركة الأقواس الخلفية تبدو طبيعية. في طفرات P-D-G-F-R-A ، يبدو أن تشكل القوس البلعومي الأول هو الذي يبدو معطلا على وجه التحديد.
هذا الإجراء قابل للتطبيق لتقنيات الزرد الأخرى شائعة الاستخدام مثل حقن مورفو أو توليد الفسيفساء الجينية. تسمح تحليلات الفاصل الزمني بالتحليل المباشر لعواقب هذه التلاعبات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير بفاصل زمني في الجسم الحي لأجنة أسماك الزرد المعدلة وراثيا عن طريق تخدير العينات وتركيبها بشكل صحيح وتحديد معلمات مثالية للفحص المجهري متحد البؤر.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة منهجية للتصوير المجهري الملتقط بالتباين الضوئي لتحديد خصائص التشكل الجمجمي الوجهي في أجنة أسماك الزرد. تسمح التقنية بالمراقبة في الوقت الحقيقي لحركات القوس البلعومي، مما يوفر رؤى حول الاختلافات بين الأجنة من النوع البري والأجنة الطافرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأحياء التنموي
- تقنيات التصوير
الخلفية
- التصوير المجهري الملتقط بالتباين الضوئي هو أداة قوية في علم الأحياء التنموي.
- فهم التشكل الجمجمي الوجهي أمر بالغ الأهمية للحصول على رؤى حول الاضطرابات التنموية.
- تعتبر أسماك الزرد كائنًا حيًا مثاليًا لدراسة التطور الجنيني.
- يمكن أن تكشف السلالات الطافرة عن الأساس الجيني للتغيرات المورفولوجية.
هدف الدراسة
- للمراقبة وتوصيف حركات القوس البلعومي في أسماك الزرد.
- لمقارنة الحركات التشكلية بين الأجنة من النوع البري والأجنة الطافرة.
- لتعزيز فهم التطور الجمجمي الوجهي.
الطرق المستخدمة
- تضمين أجنة أسماك الزرد المعدلة وراثيًا في جل acrost مخدر.
- وضع الأجنة في ميثيل سلولوز على شرائح المجهر.
- إغلاق الأجنة بين شرائح المجهر باستخدام الشحم الفراغي.
- استخدام التصوير المجهري الملتقط بالتباين الضوئي للتصوير في الوقت الحقيقي.
النتائج الرئيسية
- التقاط التصوير في الوقت الحقيقي لحركات الأنسجة الحيوية أثناء التطور.
- يتم ملاحظة اختلافات في تطور القوس البلعومي بين الأجنة من النوع البري والأجنة الطافرة.
- توفر التقنية رؤى حول ديناميات التشكل الجمجمي الوجهي.
- التصوير الملتقط بالتباين الضوئي متفوق على الطرق الثابتة لدراسة العمليات التنموية.
الاستنتاجات
- التصوير المجهري الملتقط بالتباين الضوئي فعال لدراسة التطور الجنيني.
- يمكن تطبيق المنهجية على خلفيات جينية مختلفة في أسماك الزرد.
- يمكن أن تفيد الرؤى المكتسبة في البحوث حول الاضطرابات التنموية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Time-lapse confocal imaging enables direct observation of dynamic tissue movements in living embryos, providing critical insights into morphogenetic processes that underlie craniofacial development. This approach supports target validation by linking genetic perturbations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system, enhancing predictive confidence in early discovery. The methodology facilitates mechanistic de-risking by allowing real-time comparison of wild-type and mutant phenotypes, informing go/no-go decisions in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing how genetic mutations disrupt pharyngeal arch morphogenesis in zebrafish.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for functional target validation through longitudinal imaging of tissue behaviors in cranial neural crest.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting varied tissue behaviors that cause craniofacial abnormalities, linking genotype to phenotype.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements of pharyngeal arch elongation and movement along anterior-posterior and dorsal-ventral axes.
- Operational Value: Enables assay standardization through consistent embryo mounting, anesthesia, and imaging parameters across experimental conditions.
- Scalability: Compatible with increasing abundance of transgenic zebrafish lines, supporting high-content screening of mutant and microinjected embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses a disease-relevant system to model craniofacial morphogenesis, with observations in smoothened and SMAD5 mutants reflecting human developmental disorder mechanisms.
- Preclinical Model: Zebrafish embryos serve as a predictive system for assessing morphogenetic disruptions prior to mammalian studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Time-lapse imaging allows detection of early phenotypic defects, such as failed rostral migration of the seventh pharyngeal arch at 48 hpf, informing early-stage de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, enabling real-time analysis of morphogenetic consequences of genetic manipulations.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by directly observing tissue movements critical to morphogenesis in wild-type and mutant embryos.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via time-lapse capture of pharyngeal arch dynamics in developing zebrafish heads.
- Analytics: Enables measurement of pharyngeal arch elongation and movement using confocal software, providing statistical outputs for comparing conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through analysis of mutant phenotypes that mirror human craniofacial disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to various genetic backgrounds and commonly used zebrafish techniques like morpholino injection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in craniofacial development through direct in vivo observation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined embryo preparation, mounting, and imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of morphogenetic disruptions, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by linking genetic perturbations to quantifiable phenotypic outcomes in a scalable model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, transgenic handling, and confocal microscopy operation.
- Dependent on instrumentation including confocal microscope with Z-stack and time-series capabilities, heated stage, and laser systems.
- Necessitates cross-team standardization of anesthesia protocols, mounting media (agarose, methylcellulose), and sealing techniques (vacuum grease, bridged cover slips).
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in adjusting embryo age-specific mounting (single/double/triple bridged slips) and imaging parameters for developmental stage.
- Includes practical limitations such as potential developmental delays from anesthesia and mounting, though reported as minimal in the source.
