Name: تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: تعلم تصوير متحد البؤر الزمني لدراسة تكوّن الجمجمة في أجنة الزرد. تتيح هذه الطريقة مراقبة حركات القوس البلعومي في الوقت الفعلي ومقارنة الأنماط البرية والمتحورة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر ميليسا غريفين وجينا Rozacky لرعايتهم الأسماك الخبراء. الحركة الديمقراطية الشعبية وذلك بفضل EGN لكتابة المساعدة، والكرم، والصبر. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01DE020884 لJKE.

1. تربية الحيوان والمسخ جمع أليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع وتولد الزرد كما هو موضح 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كانت الأليلات الطافرة الزرد المستخدمة في هذه الدراسة pdgfra b1059 16، B1100 smad5 22، وSMO b577 23. مصادر لهذه السلالات الزرد تشمل ZIRC. </li></ol> 2. إعداد حلول وتطبيقات ملاحظة: جميع الحلول والأدوات يمكن أن يتم في وقت مبكر وتخزينها لاستخدامها في المستقبل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وسائل الإعلام الجنين (EM) كما هو موضح سابقا 21. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 4 ز / L MS-222 (تريكين). حل 4 غ فوسفات الصوديوم (نا 2 هبو 4) في 450 مل من الماء المعقم. إضافة 2 غ MS-222 إلى الحل. ضبط درجة الحموضة إلى 7،0-7،2 داخل. إضافة الماء المعقم إلى وحدة تخزين ما مجموعه 500 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: جعل 4 جرام / لتر زيت القرنفل. تزن 0.2 غرام زيت القرنفل النقي في أنبوب 50 مل المخروطية. إضافة EM إلى وحدة تخزين ما مجموعه 50 مل. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 3٪ methylcelluloحد ذاتها. جلب 50 مل من EM + 0.1 M HEPES ليغلي. إزالة من الحرارة. ضجة في 1.5 غرام ميثيل حتى الحل هو متجانس. تخزين عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 0.2٪ الاغاروز. إضافة 0.1 غ الاغاروز إلى 50 مل EM. جلب EM ليغلي في الميكروويف أو على موقد والتحقق من أن الاغاروز قد حلت. قسامة في 500 مجلدات ميكرولتر في أنابيب microcentrifuge وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يمكن تعديل وحدات التخزين حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المساعر الشعرية. ضع قطرة من الغراء عظمى داخل أنبوب شعري 0.9 ملم معرف. إدراج طول 4-5 سم من 6 £ اختبار حيدة خط الصيد داخل الأنبوب الشعرية مثل أن ما يقرب من 3-4 ملم من خط يمتد إلى أبعد من نهاية الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل اثنين coverslips سدها في العينة. سوبر الغراء 22 × 22-1 غطاء زجاجي على كل نهاية 24 × 60-1 غطاء زجاجي وترك الوسط المجانية. جعل الفردي (1 غطاء زجاجي صغير في النهاية) لأجنة أقل من يوم من العمر، يتضاعف (2 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة 03:59 دAYS القديمة، أو مثلثات (3 أكواب غطاء صغير على رأس كل منهما الآخر في النهاية) لأجنة خمسة أيام أو أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حقنة 10 مل مع ارتفاع الشحوم فراغ. ملاحظة: يقدم فراغ الشحوم كما تسرب لمنع الجفاف العينات على مدى فترات طويلة من الزمن، ولها قدرة منخفضة السمية مقارنة المواد المانعة للتسرب أكثر تقلبا. </li></ol> 3. تصاعد الأجنة الزرد لمتحد البؤر المجهري (انظر الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة مخدر. تذوب قسامة من 0.2٪ الاغاروز بواسطة الميكروويف في 20 ثانية فترات حتى السائل تماما. مزيج 8 ميكرولتر من MS-222 في 192 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز أو 5 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل في 195 ميكرولتر من 0.2٪ الاغاروز. المحافظة في 42 ° C كتلة التدفئة. ملاحظة: التعرض الطويل لMS-222 يسبب تأخر النمو أقوى من زيت القرنفل يفعل في الزرد الجنينية 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر: dechorionate يدويا الأجنة وراثيا لم يفقس ليتم تحليلها فقط قبل التحليل. باستخدام ملقط، الشركة المصرية للاتصالات ببطءع المشيماء مفتوحة حتى يتم تحرير الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الأجنة الزرد. إضافة 1 مل من الأسهم 4 ز / L من MS-222-24 مل من وسائل الإعلام الجنين. بدلا من ذلك، إضافة 390 ميكرولتر من 4 جرام / لتر زيت القرنفل إلى 24 مل من الماء الأسماك 24. ملاحظة: الأفعال زيت القرنفل ببطء حتى تنفيذ هذه الخطوة لا يقل عن 15-20 دقيقة قبل الوقت الفاصل بين المجهري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حبة من الشحوم فراغ حول مركز الفضاء من ساترة تواجه التصاعدي سدها. دفع ببطء الشحوم فراغ من حقنة، مما يجعل على نحو سلس، وحبة مستمرة المجاور لوالداخل من الجسور وحافة ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنتشر دائرة من 4٪ ميثيل في منتصف ساترة سدها باستخدام قضيب خشبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الجنين المراد تصويره. عندما يتم تخدير الجنين استدراجه حتى في ماصة الزجاج. عقد ماصة صعودا عموديا للسماح للجنين أن تنزل الى القاع من السائل في ماصة. نقل ماصة في الحل الاغاروز والسماح لإسقاط الجنينفي الاغاروز. لا طرد السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة. رسم بعض الحلول الاغاروز والجنين في ماصة. طرد الجنين في قطرة من حل الاغاروز على أعلى من ميثيل. استخدام لعبة البوكر الشعرية لدفع الجنين نحو الانخفاض على ميثيل وتوجيه الجنين كما تريد للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان واحد ساترة سد على رأس شنت واحد، أسفل. تنطبق حتى الضغط على كلا الجانبين لل coverslips محصورة حتى الجسور إجراء اتصال مباشر والأختام قطرة الاغاروز لكلا coverslips. تحقق من أن الجنين هو المنحى بشكل صحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرك قضيب خشبي على طول الزجاج للتخفيف من الشقوق والفجوات في حبة الشحوم فراغ. يمحو الشحوم الزائدة من الحواف. </li></ol></li></ol> 4. الوقت الفاصل بين متحد البؤر التصوير من اسماك الزرد المعدلة وراثيا الأجنة (وقد تم تحسين هذا البروتوكول لزايس LSM 710 المجهر متحد البؤر بنايمكن تعديلها للاستخدام مع أنظمة أخرى جي برامج التصوير ZEN، و.) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل المعدات. بدوره على المجهر متحد البؤر وأية أجهزة ليزر الخارجية. بدوره على جهاز كمبيوتر متصل المجهر متحد البؤر. برامج التصوير المفتوحة متحد البؤر وحدد &quot;نظام تشغيل&quot; لتفعيل ضوابط الحصول على الصور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مرحلة ساخنة. خفض منصة انطلاق المجهر متحد البؤر ونقل العدسات الهدف للخروج من الموقف. استبدال الافتراضي مع المرحلة مرحلة ساخنة الإلكترونية. تشغيل وحدة تحكم للمرحلة ساخنة وضبط درجة الحرارة ل29.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينة في مجال الرؤية. وضع العينة التي شنت على خشبة المسرح. تحريك عدسة الهدف 20X في الموقف ورفع منصة انطلاق. تنشيط باعث الضوء المرئي وننظر من خلال العدسات. توسيط رأس الجنين في مجال الرؤية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد إعدادات التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل قنوات مضان من خلال تحديدالطول الموجي الفلورسنت ليتم الكشف عن واختيار لون الجداول البحث (طرفية) لكل قناة. إذا لزم الأمر، استخدام عناصر التحكم اليدوي في البرنامج لتشغيل الليزر المطلوبة (على سبيل المثال 561 نانومتر لRFP). لكل قناة مضان، تعيين كثافة الليزر إلى 10.0 والجهد مضخم (HV أو مكسب) بين 600-700. تعيين المتوسط ​​إلى 4 وعمق بت إلى 16 بت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل Z-مكدس والوقت وحدات السلسلة. تعيين الثقب لقرار Z-5 ميكرون أو أصغر، وتعيين Z-الفاصل إلى مسافة الأمثل المقترحة. ملاحظة: بشكل عام، 5 ميكرون Z-قرار يسمح كل صورة Z-مكدس التي سيتم جمعها بسرعة كافية ل&quot;لقطة&quot; من الجنين عند نقطة زمنية معينة بينما حل أيضا الخلايا الفردية. تخفيض المتوسط ​​أيضا يقلل من مقدار الوقت لكل صورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الفاصل الزمني المطلوب الوقت بين الصور (عادة 10-20 دقيقة) ويبلغ طول التجربة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين الموضعيةالمعلومات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتحول الكاميرا إلى وضع الحية. ضبط التركيز وزيادة كثافة الليزر إذا لزم الأمر لمعرفة مضان. ضبط الزوم الرقمي إلى 0.6 للحصول على عرض أوسع، إذا رغبت في ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع المرحلة بحيث كل الهياكل التي تهم واضحة، وهناك غرفة في مجال الرؤية لظهريا ثمرة والأمامية. التركيز من خلال الجنين الى الحدود العليا والدنيا من مضان. تعيين المناصب شريحة Z-كومة الأول والأخير لا يقل عن 100 ميكرون أو أكثر وراء هذه الحدود. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسين كثافة مضان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين طرفية عرض يتراوح المؤشر. يجب أن تظهر الآن الهياكل الفلورسنت الأبيض، وينبغي أن تكون بقية مجال الرؤية الأزرق (أي الكشف عن) أو أسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زيادة HV / أرباح إلى مستوى أقل بقليل حيث المشبعة (الأحمر) بكسل تظهر. إذا لزم الأمر، وضبط تعويض ذلك لم يتم الكشف عن أغلبية الخلفية (الأزرق). ملاحظة: أصغر قطر الثقب وزيادة كثافة الليزر على حد سواء تحسين صورة مواطنهيجب أن تبقى inition، ولكن كثافة الليزر منخفض للحفاظ على الأنسجة الحية. زيادة HV / ربح وقطر الثقب (&lt;5 ميكرومتر) أفضل بشكل عام إلى زيادة كثافة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على قطر الثقب واسعة بما يكفي لجمع الصور في الوقت المناسب، حيث بلغ متوسطها إلى 4 مجموعات. وينبغي دائما أن يتم تعيين الفاصل الزمني Z لبعد المسافة المثلى المقترحة لقطر الثقب. القيام بمسح قصيرة (المتوسط ​​= 1) مع إعدادات مختلفة، واستخدام الحد الأدنى من كثافة الليزر الذي يحقق الدقة المطلوبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل التجربة لمدة من الوقت المطلوب. بعد ذلك، وإزالة الجنين من مرحلة ساخنة وفصل ببطء لل coverslips. يغرق ساترة والجنين في EM في 30 ملم طبق بيتري. باستخدام ماصة الزجاج غسل بلطف الجنين الخروج من ساترة وإزالة ساترة من طبق بيتري. وضع الجنين في الحاضنة 28.5 درجة مئوية إلى مواصلة تطوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قارن النمو. في نهاية التجربة، واتخاذ الفردية زينب صالحوأثيرت الصور تك الأجنة الأخوة محمولة الاغاروز التي نظمت على غرار العينة في بداية التجربة، ولكن في EM في حاضنة 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الأقواس البلعومية، حسب الحاجة. قياسات لا يمكن أن يؤديها في بعض الأجنحة البرمجيات متحد البؤر. أجريت القياسات وجدت هنا باستخدام Fiji25 عن طريق استيراد وZ-إسقاط الملفات. LSM من الأطر الفردية. </li></ol>

<ol><li>Trainor, P. A., Melton, K. R., Manzanares, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+plasticity+of+neural+crest+cells+and+their+roles+in+jaw+and+craniofacial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Origins and plasticity of neural crest cells and their roles in jaw and craniofacial evolution.</a> Int. J. Dev. Biol. 47, 541-553 (2003).</li>
<li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Wada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Roessler, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+human+sonic+hedgehog+gene+cause+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the human sonic hedgehog gene cause holoprosencephaly.</a> Nat. Genet. 14, 357-360 (1996).</li>
<li>Jeong, J., Mao, J., Tenzen, T., Kottmann, A. H., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+in+the+neural+crest+cells+regulates+the+patterning+and+growth+of+facial+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling in the neural crest cells regulates the patterning and growth of facial primordia.</a> Genes Dev. 18, 937-951 (2004).</li>
<li>Hu, D., Marcucio, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SHH-responsive+signaling+center+in+the+forebrain+regulates+craniofacial+morphogenesis+via+the+facial+ectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A SHH-responsive signaling center in the forebrain regulates craniofacial morphogenesis via the facial ectoderm.</a> Development. 136, 107-116 (2009).</li>
<li>Cordero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+perturbations+in+sonic+hedgehog+signaling+elicit+the+spectrum+of+holoprosencephaly+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Temporal perturbations in sonic hedgehog signaling elicit the spectrum of holoprosencephaly phenotypes.</a> J. Clin. Invest. 114, 485-494 (2004).</li>
<li>Westphal, H., Beachyr, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclopia+and+defective+axial+patterning+in+mice+lacking+Sonic+hedgehog+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cyclopia and defective axial patterning in mice lacking Sonic hedgehog gene function.</a> Nature. 383, 3(1996).</li>
<li>Moore-Scott, B. A., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+Sonic+hedgehog+along+the+anterior-posterior+axis+regulates+patterning+of+pharyngeal+pouch+endoderm+and+pharyngeal+endoderm-derived+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of Sonic hedgehog along the anterior-posterior axis regulates patterning of pharyngeal pouch endoderm and pharyngeal endoderm-derived organs.</a> Dev. Biol. 278, 323-335 (2005).</li>
<li>Swartz, M. E., Nguyen, V., McCarthy, N. Q., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hh+signaling+regulates+patterning+and+morphogenesis+of+the+pharyngeal+arch-derived+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hh signaling regulates patterning and morphogenesis of the pharyngeal arch-derived skeleton.</a> Dev. Biol. 369, 65-75 (2012).</li>
<li>Balczerski, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Sphingosine-1-phosphate+signaling+mutants+reveals+endodermal+requirements+for+the+growth+but+not+dorsoventral+patterning+of+jaw+skeletal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Sphingosine-1-phosphate signaling mutants reveals endodermal requirements for the growth but not dorsoventral patterning of jaw skeletal precursors.</a> Dev. Biol. , (2011).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> Int. J. Dev. Biol. 50, 511-521 (2006).</li>
<li>Alexander, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+roles+for+BMPs+and+Endothelin+1+in+patterning+the+dorsal-ventral+axis+of+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Combinatorial roles for BMPs and Endothelin 1 in patterning the dorsal-ventral axis of the craniofacial skeleton.</a> Development. 138, 5135-5146 (2011).</li>
<li>Zuniga, E., Rippen, M., Alexander, C., Schilling, T. F., Crump, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+regulates+distinct+roles+of+BMP+and+Endothelin+1+signaling+in+dorsoventral+patterning+of+the+facial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 regulates distinct roles of BMP and Endothelin 1 signaling in dorsoventral patterning of the facial skeleton.</a> Development. 138, 5147-5156 (2011).</li>
<li>Swartz, M. E., Sheehan-Rooney, K., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+a+palatogenic+gene+program+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Examination of a palatogenic gene program in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 240, 2204-2220 (2011).</li>
<li>Eberhart, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Mirn140+modulates+Pdgf+signaling+during+palatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Mirn140 modulates Pdgf signaling during palatogenesis.</a> Nat. Genet. 40, 290-298 (2008).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF+alpha+receptor+is+required+for+neural+crest+cell+development+and+for+normal+patterning+of+the+somites%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The PDGF alpha receptor is required for neural crest cell development and for normal patterning of the somites.</a> Development. 124, 2691-2700 (1997).</li>
<li>Tallquist, M. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+autonomous+requirement+for+PDGFRalpha+in+populations+of+cranial+and+cardiac+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell autonomous requirement for PDGFRalpha in populations of cranial and cardiac neural crest cells.</a> Development. 130, 507-518 (2003).</li>
<li>Ho, L., Symes, K., Yordan, C., Gudas, L. J., Mercola, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+PDGF+A+and+PDGFR+alpha+mRNA+in+Xenopus+embryos+suggests+signalling+from+neural+ectoderm+and+pharyngeal+endoderm+to+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Localization of PDGF A and PDGFR alpha mRNA in Xenopus embryos suggests signalling from neural ectoderm and pharyngeal endoderm to neural crest cells.</a> Mech. Dev. 48, 165-174 (1994).</li>
<li>Liu, L., Korzh, V., Balasubramaniyan, N. V., Ekker, M., Ge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor+A+%28pdgf-a%29+expression+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor A (pdgf-a) expression during zebrafish embryonic development.</a> Dev. Genes Evol. 212, 298-301 (2002).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3B+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Brachydanio+rerio%29%22">The Zebrafish Book; A guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio)</a>. , (1993).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Lovely, C. B., Dixon, M. J., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+and+Shh+Signaling+Mediate+the+Expression+of+satb2+in+the+Pharyngeal+Arches%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Bmp and Shh Signaling Mediate the Expression of satb2 in the Pharyngeal Arches.</a> PloS one. 8, e59533(2013).</li>
<li>Varga, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+smoothened+functions+in+ventral+neural+tube+specification+and+axon+tract+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish smoothened functions in ventral neural tube specification and axon tract formation.</a> Development. 128, 3497-3509 (2001).</li>
<li>Grush, J., Noakes, D. L. G., Moccia, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+clove+oil+as+an+anesthetic+for+the+zebrafish%2C+Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The efficacy of clove oil as an anesthetic for the zebrafish, Danio rerio.</a> 1, 46-53 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Crump, J. G., Maves, L., Lawson, N. D., Weinstein, B. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Fgfs+in+endodermal+pouch+formation+influences+later+craniofacial+skeletal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An essential role for Fgfs in endodermal pouch formation influences later craniofacial skeletal patterning.</a> Development. 131, 5703-5716 (2004).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derive+from+the+more+apical+daughter+in+asymmetric+divisions+in+the+zebrafish+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube.</a> Nat. Neurosci. 13, 673-679 (2010).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر هو أداة قوية لتحليل التنمية. هنا، علينا أن نظهر فائدة الأسلوب في دراسة البلعوم القوس التشكل في الزرد التي هي متحولة لمسارات الإشارات الهامة باستخدام الخلايا المعدلة وراثيا التي تصف قمة العصبية. بالإضافة إلى مستوى الأنسجة التحليلات، تحليلات مرور الوقت تنطبق أيضا على تحليلات على نطاق الخلوية 28. ويمكن أيضا أن تدمج العديد من الطرق المستخدمة على نطاق واسع في الزرد تجارب المجهري الوقت الفاصل، بما في ذلك Microinjection من morpholinos، mRNAs...

التشكل القحفي معقدة عملية متعددة الخطوات التي تتطلب التفاعلات المنسقة بين أنواع خلايا متعددة. مشتق غالبية الهيكل العظمي القحفي من الخلايا العصبية قمة، وكثير منها يجب أن يهاجر من الظهرية الأنبوب العصبي في الهياكل عابرة يسمى الأقواس البلعومية 1. كما هو الحال مع العديد من الأنسجة، التشكل من الهيكل العظمي القحفي هو أكثر تعقيدا مما يمكن أن يكون مفهوما من قبل صور ثابتة الأجنة في نقاط محددة الوقت التنموية. على الرغم من أنها لأداء تستغرق وقتا طويلا، ويوفر في الجسم الحي الوقت الفاصل بين المجهري نظرة المستمر في الخلايا والأنسجة الجنين النامي. كل صورة في سلسلة الوقت الفاصل بين يقرض السياق إلى الآخرين، ويساعد تحرك المحقق نحو استنتاج سبب حدوث ظاهرة بدلا من استنتاج ما يحدث في ذلك الوقت. في الجسم الحي التصوير هو بالتالي أداة قوية لنهج وصفي التجريبية لتفكيك مسارات التي توجه التشكل. ودانيو rerio الزرد هو نموذج الجيني شعبية من التطور الجنيني الفقاريات، وبشكل خاص مناسبة تماما لفي الجسم الحي التصوير من التشكل. الحديثة، وأساليب مريحة لنقل الجينات والتعديل الجيني تتقدم بسرعة عدد الأدوات المتاحة للباحثين الزرد. هذه الأدوات تحسين أساليب قوية بالفعل للتلاعب الجيني والمجهري. في الجسم الحي التصوير من النسيج تقريبا أي في أي سياق الوراثية المطلوب تقريبا هو اقرب الى الواقع من الخيال. وتسترشد الحركات التخلق من الأقواس البلعومية بواسطة إشارات التفاعلات بين قمة العصبية وظهائر المجاورة، سواء الأديم الظاهر الأديم الباطن و. هناك العديد من الجزيئات يشير أعرب عنها ظهائر والتي هي ضرورية لدفع التشكل من عناصر الهيكل العظمي القحفي. بين هذه الجزيئات يشير، سونيك القنفذ (شش) هو و أهمية حاسمةأو تطوير القحفي 2-8. وأعرب عن شش كل من الأديم الظاهر الأديم الباطن الفم والبلعوم 2،6،9،10. التعبير عن شش في الأديم الباطن ينظم الحركات التخلق من الأقواس 10، الزخرفة من قمة العصبية داخل الأقواس 10، ونمو الهيكل العظمي القحفي 11. BMP يشير أيضا أهمية حاسمة للتنمية القحفي 12، ويمكن تغيير التشكل من الأقواس البلعومية. BMP إشارات ينظم ظهري / بطني الزخرفة من قمة داخل الأقواس البلعومية 13،14. تعطل smad5 في الزرد يسبب تشوهات الحنك الشديد وفشل الغضاريف وميكل لتندمج بشكل مناسب في خط الوسط 15. بالإضافة إلى ذلك، عرض المسوخ أيضا تخفيضات والانصهار في العناصر الغضروف بطني، مع الثانية 2، 3 الثالثة، وأحيانا عناصر ال 4 البلعوم القوس تنصهر في خط الوسط 15. هذه اندماج توحي بقوة تلك BMP إشارات يوجه التشكل من هذه العناصر البلعوم. PDGF إشارات ضرورية للتنمية القحفي، ولكن لديها أدوار معروفة في البلعوم القوس التشكل. كلا الماوس والمسوخ Pdgfra الزرد ديك عميقة clefting midfacial 16-18. على الأقل في الزرد ويرجع ذلك إلى فشل السليم الهجرة الخلية قمة العصبية 16 هذا clefting midfacial. تستمر الخلايا العصبية للتعبير عن قمة pdgfra بعد أن تكون قد دخلت الأقواس البلعومية. بالإضافة إلى ذلك، يتم التعبير بروابط PDGF بواسطة ظهائر الوجه وداخل الأقواس البلعومية 16،19،20، وبالتالي PDGF الإشارات ويمكن أيضا أن تلعب دورا في التشكل من الأقواس البلعومية التالية الهجرة. ومع ذلك، يحلل من التشكل من الأقواس البلعومية في المسوخ pdgfra لم يتم تنفيذها. هنا، علينا أن نظهر في الجسم الحي المجهري متحد البؤر من pharyngulمرحلة-الزرد المعدلة وراثيا ووصف التشكل من الأقواس البلعومية خلال هذه الفترة. نحن كذلك إظهار السلوكيات الأنسجة التي تتأثر الطفرات التي تعطل BMP و PDGF، وشش مسارات الإشارات.

<table><tbody><tr><td>6 رطل اختبار خط الشعيرات الأحادية</td><td>كورتلاند لاين</td><td>شركة SLB16</td><td></td></tr><tr><td>Agarose I</td><td>Amresco</td><td>0710</td><td></td></tr><tr><td>ليزر الأرجون</td><td>LASOS Lasertechnik GmbH</td><td>LGN 3001</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الكالسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب شعرية ، 100 مم ، 0.9 مم معرف</td><td>FHC</td><td>30-31-0</td><td></td></tr> زيت <tr><td>القرنفل</td><td>Hilltech كندا ، إنك.</td><td>HB-102</td><td></td></tr><tr><td>شحم عالي الفراغ</td><td>داو كورنينج</td><td>2021846-0807</td><td></td></tr><tr><td>حاضنة حمام جاف</td><td>Isotemp فيشر Scientific</td><td>2050FS</td><td></td></tr><tr><td>مجهر المسح بالليزر</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات المغنيسيوم سداسي هيدرات</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>غطاء مجهر زجاجي ، 22 × 22-1</td><td>فيشر Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>غطاء مجهر زجاجي ، 24 × 60-1</td><td>فيشر ساينتفيك</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد البوتاسيوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>M-11321</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>فيشر Scientific</td><td>M-11624</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة</td><td>سيجما ألدريتش</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>TempController 2000-2</td><td>PeCon GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical، Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4d متحد البؤر المجهري

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

الوقت الفاصل بين التصوير هو الاسلوب الذي يسمح لمراقبة مباشرة لعملية التشكل، أو جيل من الشكل. بسبب درجة وضوحها البصرية وقابليته للتلاعب الجيني، أصبح الجنين الزرد كائن نموذج شعبية مع الذي لإجراء تحليل الوقت الفاصل بين التشكل في الأجنة الحية. التصوير متحد البؤر من جنين الزرد الحية يتطلب أن الأنسجة من الاهتمام هو المسمى باستمرار مع علامة فلوري، مثل التحوير أو صبغ حقن. يطالب العملية أن الجنين هو تخدير والذي عقد في مكان في مثل هذه الطريقة التي التنمية الصحية العائدات بشكل طبيعي. يجب أن يتم تعيين المعلمات من أجل التصوير لحساب نمو ثلاثي الأبعاد، وتحقيق التوازن بين مطالب حل الخلايا الفردية حين الحصول على لقطات سريعة من التنمية. نتائجنا تثبت القدرة على أداء على المدى الطويل في مجال التصوير المجراة من الأجنة الزرد المسمى مضان وللكشف عن السلوكيات الأنسجة المتنوعة فيقمة الجمجمة العصبية التي تسبب تشوهات القحفي. تأخر في النمو الناجمة عن التخدير وتركيب هي الحد الأدنى، والأجنة دون أن يمسهم سوء من قبل العملية. يمكن إرجاع الأجنة الوقت الفاصل بين تصوير والمتوسطة السائل وبعد ذلك تصويرها أو ثابتة في نقطة لاحقة في عملية التنمية. مع وفرة متزايدة من خطوط الزرد المعدلة وراثيا ورسم الخرائط مصير تتميز جيدا وتقنيات زرع، والتصوير أي نوع من الأنسجة المطلوب هو ممكن. على هذا النحو، والوقت الفاصل بين التصوير في الجسم الحي يجمع بقوة مع الأساليب الوراثية الزرد، بما في ذلك تحليل الأجنة متحولة وmicroinjected.

في البرية من نوع الأجنة بعد السكان قمة العصبية، الأقواس البلعومية استطال على طول الأمامي / الخلفي وظهري / بطني محاور بينما تتحرك في اتجاه منقاري (فيلم 1). في 30 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، وطول الأمامي / الخلفي من أول القوس البلعومية ما بين 1،8-1،9 مرات ظهري / بطني ذروته. ظهري / بطني استطالة العائدات بشكل مطرد، وأسرع من تمديد الأمامي / الخلفي حتى 36.5 HPF. من هنا، ظهري / بطني الهضاب ارتفاع حوالي 104 ميكرون من خلال 48 HPF. تواصل تمديد الأمامي / الخلفي خلال 48 HPF، مع ط...

الوقت الفاصل بين التصوير متحد البؤر هي تقنية قوية مفيدة لوصف التطور الجنيني. هنا، نحن تصف منهجية وتميز التشكل القحفي في البرية من نوع، وكذلك pdgfra، smad5، وSMO الأجنة متحولة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو رصد وتوصيف حركات القوس البلعومي في رأس جنين سمكة الزيبرا النامي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق غمر جنين سمكة الزيبرا المعدل وراثياً في هلام أكروست المخدر. والخطوة الثانية هي تثبيت الجنين المغمور في الأجاروز داخل قطرة من ميثيل السليلوز على شريحة مجهرية.بعد ذلك، يتم ختم الجنين بين شريحتين مجهريتين باستخدام الشحم المفرغ من الهواء. وفي النهاية، يُستخدم المجهر البؤري بنظام التصوير الزمني لإظهار الفروق بين أسماك zebrafish من النوع البري والنوع الطافر، وكذلك الحركات المورفوجينية للأقواس البلعومية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق التصوير الساكن في أنها ترصد تطور الأقواس البلعومية في الوقت الفعلي، مما يتيح للباحث ملاحظة حركات الأنسجة الحاسمة لعملية التخلق الشكلي بشكل مباشر.لصنع شريحة غطاء جسرية، استخدم الغراء السريع (super glue) لتثبيت غطاء زجاجي مقاس 22 × 22 على كل طرف من أطراف غطاء زجاجي مقاس 24 × 60، مع ترك المنتصف خالياً. قم بتجهيز شرائح فردية للأجنة التي يقل عمرها عن يوم واحد.استخدم شرائح غطاء مزدوجة للأجنة التي يتراوح عمرها من يوم إلى أربعة أيام، أو شرائح ثلاثية للأجنة التي يبلغ عمرها خمسة أيام أو أكثر. واستخدم شريحتين غطاء جسريتين لكل عينة. الآن، املأ حقنة سعة 10 milliliter بشحم الفراغ العالي.قم بتحضير مخدر طازج في 0.2%liquid aros وحافظ عليه في كتلة تسخين بدرجة حرارة 42 degree Celsius. لإزالة الغشاء الكوريوني يدوياً عن الأجنة المعدلة وراثياً غير المفقسة، قم بتمزيق Corian ببطء حتى يتحرر الجنين. والآن انقل الأجنة المغلفة إلى وسط نظيف يحتوي على MS 2 22 والمخدر.لتحضير شريحة غطاء جسرية، ادفع شحم التفريغ ببطء من المحقنة، بحيث تشكل خطاً مستمراً وناعماً بجوار وداخل الجسور وحافة شريحة الغطاء. وزع دائرة من 4%Methylcellulose في منتصف الجسر وصولاً إلى شريحة الغطاء. وعندما يتم تخدير الجنين، اسحبه إلى داخل ماصة زجاجية.أمسك الماصة بشكل رأسي للسماح للجنين بالهبوط إلى قاع السائل داخل الماصة. بعد ذلك، حرك الماصة داخل محلول agro واترك الجنين يسقط في aros دون دفع السائل للخارج. ثم اسحب كمية من محلول agro والجنين إلى داخل الماصة.بعد ذلك، قم بإخراج الجنين في قطرة من محلول aro فوق مادة الميثيل سليلوز. اضغط على الجنين لأسفل باتجاه الميثيل سليلوز وقم بتوجيهه بالشكل المطلوب للتصوير من أجل تثبيت العينة.ضع غطاء شريحة جسرياً واحداً فوق الغطاء المثبت بحيث يكون موجهاً لأسفل. اضغط بشكل متساوٍ على كلا جانبي غطائي الشريحة المتراكبين حتى يحدث تلامس مباشر بين الجسور ويُغلق قطرة agros على كلا غطائي الشريحة. تحقق من توجيه الجنين بشكل صحيح.قم بتمرير أداة تطبيق خشبية على الزجاج لتسوية الشقوق والفجوات في شحم الفراغ. امسح أي شحم زائد من الحواف. قم بتشغيل المجهر البؤري وأي أجهزة ليزر خارجية.قم بتشغيل الكمبيوتر المتصل بالمجهر البؤري (confocal microscope)، ثم اختر بدء تشغيل النظام وبرنامج التصوير البؤري. بعد ذلك، اخفض منصة العينات في المجهر البؤري وقم بإبعاد العدسات الشيئية عن موضعها. استبدل المنصة الافتراضية بمنصة إلكترونية مدفأة.قم بتشغيل وحدة التحكم في المنصة المسخنة واضبط درجة الحرارة على 29.5 °C. ضع العينة المثبتة على المنصة المسخنة. حرك العدسة الشيئية 20x إلى الموضع الصحيح وارفع منصة العينات.قم بعد ذلك بتنشيط باعث الضوء المرئي ومركز رأس الجنين في مجال الرؤية. ولتنشيط قنوات الفلورة، اختر الطول الموجي الفلوري المراد رصده وحدد جداول البحث عن الألوان لكل قناة. وبالنسبة لكل قناة فلورة، اضبط شدة الليزر على 10.0 وجهد المضخم الضوئي بين 600 و700.لتقليل التشويش الخلفي وزيادة المعلومات الفلورية التي يتم جمعها، اضبط المتوسط (averaging) على اثنين أو أربعة، وعمق البت (bit depth) على 16 bit. قم بتنشيط وحدات ZS stack والسلاسل الزمنية (time series). واضبط ثقب الدبوس (pinhole) إذا لزم الأمر.قم بتعيين الفاصل الزمني ومدة التجربة. حوّل الكاميرا إلى وضع البث المباشر. اضبط التركيز وزد من شدة الليزر إذا لزم الأمر.لرؤية الفلورة، اضبط التكبير الرقمي على 0.6 للحصول على عرض أوسع، إذا رغبت في ذلك.قم بضبط وضعية المنصة بحيث تكون جميع التراكيب المستهدفة مرئية، مع ترك مساحة في مجال الرؤية للسماح بالنمو. قم بضبط التركيز ظهرياً وأمامياً عبر الجنين وصولاً إلى الحدود العليا والسفلى للفلورية. حدد مواضع أول وآخر شريحة Zack بحيث تكون بعيدة عن هذه الحدود بمسافة 100 µm أو أكثر.بعد ذلك، اضبط جدول البحث الخاص بالعرض (LUT) على مؤشرات النطاق بحيث تظهر الهياكل الفلورية بدرجة من درجات اللون الرمادي، بينما يكون باقي الحقل باللون الأزرق أو الأسود. إذا لزم الأمر، زد جهد مضاعف التصوير الضوئي إلى مستوى يقل مباشرة عن النقطة التي تظهر عندها بكسلات حمراء مشبعة. إذا ظهرت الهياكل الفلورية باللون الأحمر، فقلل من شدة الليزر و/أو الكسب حتى تصبح بدرجة من درجات اللون الرمادي.قم بضبط الإزاحة إذا لزم الأمر، بحيث تظهر المناطق خارج العينة باللون الأزرق. اضبط القطر على أصغر قيمة تسمح بجمع الصور في الوقت المناسب.يجب ضبط فاصل Z دائمًا على المسافة المثلى المقترحة لقطر الثقب الدبوسي، مع إجراء عمليات مسح قصيرة لاختبار الإعدادات، واستخدام أدنى كثافة ليزر ممكنة دائمًا. الآن، قم بتشغيل التجربة للمدة الزمنية المطلوبة. بعد ذلك، قم بإزالة الجنين من المنصة المسخنة وفصل الشرائح الغطائية ببطء، ثم اغمر الشريحة الغطائية والجنين في طبق بتري سعة 30 مليمتر.باستخدام ماصة زجاجية، اغسل الجنين برفق لإزالته من شريحة التغطية، ثم قم بإزالة شريحة التغطية من طبق بتري. ضع الجنين في حاضنة بدرجة حرارة 28.5 °C لمواصلة نموه. في نهاية التجارب، التقط صور Zack فردية لأجنة شقيقة مثبتة على شريحة agarose تكون في نفس المرحلة العمرية للعينة عند بدء التجارب، ولكن تم تربيتها في حاضنة بدرجة حرارة 28.5 °C.قم بقياس الأقواس البلعومية حسب الحاجة باستخدام برنامج المجهر البؤري أو أي برنامج آخر لمعالجة الصور في أجنة النوع البري. بعد استيطان الخلايا العصبية العرفية، تستطيل الأقواس البلعومية على طول المحاور الأمامية الخلفية والظهرية البطنية بينما تتحرك في اتجاه منقاري. وفي نهايتها الأمامية، يشكل القوس البلعومي الأول نطاقات فكية علوية وسفلية يفصل بينهما الأديم الظاهر الفموي؛ وتتعطل الحركات المورفوجينية الرئيسية هذه بشكل كبير في طفرات smoothened.هنا يفشل القوس البلعومي السابع في الهجرة بشكل صحيح للتداخل مع الأقواس الأكثر أمامية بحلول 48 ساعة بعد الإخصاب. تعاني طفرات Zebrafish SM five من عيوب عديدة في الوجه والجمجمة. في هذه الصور المجهرية البؤرية الساكنة.تظهر الاندماجات في النطاقات البطنية للقوسين الثاني والثالث بحلول 32 ساعة بعد الإخصاب. وباستخدام المجهر البؤري بالفاصل الزمني، نقوم بتحليل التشكل الحيوي للأقواس البلعومية. وفي طفرات Smad five، تظهر الاندماجات بين القوسين الثاني والثالث لأول مرة عند 32 ساعة بعد الإخصاب.يتفق هذا مع التحليل الساكن. وبينما يشير تعبير أفراد عائلة PDGF إلى احتمال مشاركتها بشكل واسع في تكوين القوس البلعومية، فإن حركة الأقواس الخلفية تبدو طبيعية. أما في طفرات P-D-G-F-R-A، فإن تكوين القوس البلعومية الأولى هو الذي يبدو مختلاً بشكل محدد.هذا الإجراء قابل للتطبيق مع تقنيات أخرى شائعة الاستخدام في أسماك الزيبرفيش، مثل الحقن بالمورفولينو أو توليد الفسيفساء الجينية. وتسمح تحليلات التصوير بالفاصل الزمني بالتحليل المباشر لنتائج هذه المعالجات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير بالفاصل الزمني في الجسم الحي لأجنة أسماك الزيبرفيش المعدلة وراثياً، وذلك من خلال تخدير العينات وتثبيتها بشكل صحيح وضبط المعلمات المثالية للمجهر البؤري.

analyzing-craniofacial-morphogenesis-zebrafish-using-4d-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

يوصف التصوير التنمية الدماغية في الزرد اليرقات. كما يتم توفير التقنيات اللازمة لتسهيل 3D التصوير وتعديل وضع الدماغية باستخدام العلاجات الكيميائية.

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

أصبح التصور من البيانات التجريبية عنصرا أساسيا في تقديم النتائج للمجتمع العلمي. جيل من يعيش تسجيل الوقت الفاصل بين الأجنة المتزايد يساهم في تحسين العرض وفهم العمليات التنموية المعقدة. هذا البروتوكول هو دليل خطوة بخطوة لوضع العلامات الخليوي عبر photoconversion من البروتين Kaede الذي في الزرد.

التصور التنمية الجمجمة في sox10: Kaede الذي الزرد المعدلة وراثيا عن طريق الخط الوقت الفاصل بين متحد البؤر المجهري

منذ فترة طويلة افترض تنظيم خلية من خلايا العظام القحفي ولكن لم تصور مباشرة. وضع العلامات خلية متعددة الأطياف والحية على الهواء مباشرة   التصوير يسمح التصور من سلوك الخلية الحيوي في الفك السفلي الزرد. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول للتلاعب Zebrabow الأسماك المعدلة وراثيا ومراقبة مباشرة إقحام خلية والتغيرات المورفولوجية للغضروفية في غضروف ميكل.

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

هنا ، نقدم طريقة تركيب متعددة الاستخدامات تسمح بالتصوير بفاصل زمني طويل الأمد لنمو الجسم الخلفي لأجنة أسماك الزرد الحية دون الإخلال بالتطور الطبيعي.

تنوعا تصاعد الطريقة على المدى الطويل التصوير التنمية الزرد

تم تنفيذ مزيج من التقنيات البصرية المتقدمة في ليزر المسح المجهري مع الطول الموجي الفوتوني متعدد الأسفار الإثارة منذ وقت طويل لالتقاط التصوير عالية الدقة، ثلاثي الأبعاد، في الوقت الحقيقي للهجرة crest العصبي في تيراغرام (sox10:EGFP) والأجنة الزرد تيراغرام (foxd3:GFP).

تصوير مرور الوقت فوتون متعددة لتصور التنمية في الوقت الحقيقي: التصور لترحيل الخلايا العصبية كريست في الأجنة الزرد

في التصوير الحي هو أداة قوية يمكن استخدامها للتحقيق في الآليات الخلوية الكامنة وراء تطوير الجهاز العصبي. هنا نحن نصف تقنية لاستخدام الوقت الفاصل الكونستوب المجهري لتصور أعداد كبيرة من الخلايا متعددة الألوان بقوس قزح المسمى في الوقت الحقيقي داخل الجهاز العصبي حمار وحشي النامية.

تصور الدماغ النامية في سمك الحمار الوحشي المعيشة باستخدام Brainbow والوقت الفاصل Confocal التصوير

يصف هذا البروتوكول نهجا لوضع العلامات في توتو والتصوير متعدد الأبعاد لسمك الحمار الوحشي في وقت مبكر من نمو العين. نحن نصف وضع العلامات والتضمين والتصوير رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر confocal المسح بالليزر ، واعتبارات لتحسين الحصول على مجموعات البيانات لتشريح آليات مورفوجينيسيس كوب البصرية.

4-التصوير الأبعاد من زيبرافيش كأس البصرية Morphogenesis

يقدم البروتوكول الموصوف هنا إجراء بسيطا وسهل المتابعة لتلطيخ وتشريح الغضاريف القحفية الوجهية في يرقة سمك الزرد البالغة من العمر 5 أيام. يمكن استخدامه لدراسة تشريح وشكل وحجم هذه الهياكل في ظل ظروف النمو المختلفة.

تشريح الأنسجة القحفية الوجهية لسمك الزرد عند تلطيخها باللون الأزرق ألسي

يصف هذا العمل بروتوكولا لقياس شكل الغضروف الجمجمي الوجهي باستخدام برامج حرة (tpsDigs2، MorphoJ، وPAST) لقياس التغيرات في بنية الوجه في يرقات سمك الزرد.

تحليلات مورفومترية للشكل: صندوق أدوات برنامج التحليل لقياس شكل الجمجمة الوجهية في سمك الزرد

تعلم تصوير متحد البؤر الزمني لدراسة تكوّن الجمجمة في أجنة الزرد. تتيح هذه الطريقة مراقبة حركات القوس البلعومي في الوقت الفعلي ومقارنة الأنماط البرية والمتحورة.

تحليل الجمجمة التشكل في الزرد عن طريق 4D متحد البؤر المجهري

استكشف المزيد من الفيديوهات