Name: تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: اكتشف طريقة تمدد الخلايا اللاصقة على غشاء PDMS المرن باستخدام تقنية النمط الدقيق. تتيح هذه الطريقة دراسة استجابة الخلايا للقوى الميكانيكية أثناء الانقسام.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

تأسست هذا العمل من قبل معهد كوري، باريس، فرنسا. تم تصميم نقالة الميكانيكية من قبل داميان كوفيلير (معهد كوري) ويتم تصنيعها من قبل GREM (MECANIQUE-grem.com). تم تطوير الزخرفة على PDMS بواسطة عمار Azioune (جامعة بوردو الثاني).

1. التخميل من PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قطعة من PDMS حوالي 35 ملم × 20 ملم من ورقة قدمت قبل (على سبيل المثال، GelPak، كما هو موضح في الجدول المواد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجزء العلوي والسفلي من طبقات واقية من البلاستيك (إذا لزم الأمر) واستخدام ملاقط لوضع PDMS في البلاستيك (وليس الثقافة الخلية المعالجة) طبق بيتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل PDMS مع الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق على محور دوار في 30 التذبذبات / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجف السطح بواسطة الهواء المتدفقة على ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيء مع الأشعة فوق البنفسجية العميقة (λ = 180 نانومتر) لمدة 5 دقائق على مسافة من المصابيح فوق البنفسجية من حوالي 5 سم (انظر ورقة مواد مرجعية مصباح، وسوف تختلف المعلمات للمصابيح مختلفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 200 ميكرولتر من الحل EDC / NHS لكل PDMS قطعة (هذا يجب أن يكون مستعدا تماما قبل الاستخدام لأن التفاعل من الحل يضمحل في غضون ساعة). ل1 مل من 0.05 M MES + 0.5 M كلوريد الصوديوم العازلة في درجة الحموضة 6.0، إضافة 11.5 ملغ من سلفو-NHS و 19.2 ملغ من EDC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقلPDMS صحائف من طبق بيتري إلى غطاء طبق بتري، الذي لم مضيئة. وهذا يضمن أن محيط PDMS هي مسعور جدا وتسهيل الخطوة التالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحل EDC / NHS واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف EDC / NHS بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة PLL-G-PEG حل (0.5 ملغ / مل في HEPES 10 ملي درجة الحموضة 8.6)، واحتضان بين عشية وضحاها من 3 إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف PLL-G-PEG بالماء. PDMS تخميلها (بين functionalized مع PLL-G-PEG) يمكن تخزينها لعدة أيام في 4 درجات مئوية. </li></ol> 2. الزخرفة من PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ ورقة PDMS ووضعه على الضوئية الكوارتز الاصطناعية التي تحمل microfeatures عن الزخرفة (انظر الشكل 1). وضع الجانب PDMS تحمل PLL-G-PEG التي تواجه الجانب الكروم من الضوئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضيء لمدة 7 دقائق عن طريق الضوئية على مسافة من المصابيح فوق البنفسجية من حوالي 5 سم.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماء على قناع + PDMS وقشر PDMS ببطء بعيدا عن قناع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الحل فبرونيكتين في 50 ملغ / مل في المنطقة العازلة HEPES في درجة الحموضة 8.6 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. فمن الممكن استخدام البروتينات ECM الآخرين، ولكن هذه لم يتم اختبارها مع هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف مع برنامج تلفزيوني. </li></ol> 3. تركيب جهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل PDMS تخميلها سابقا على الجهاز تمتد (انظر مناقشة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق جانب واحد من PDMS إلى جزء ثابت من نقالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الجانب الآخر إلى الجزء المتحرك من دون تحامل نقالة الكثير من ورقة PDMS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع مستطيل من PDMS (22 ملم × 19 ملم) في PDMS طعنة سميكة وقطع مستطيل آخر داخل من أجل الحصول على بركة (أو الإطار) التي من شأنها الإبقاء على الخلايا وسائل الإعلام (انظر الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة سيليكون الشحوم تحت هذا PDMS بركة ووضعه على رأس ورقة PDMS لإنشاء ميدالبوتاسيوم الاحتفاظ بركة. فإن الشحوم تسمح مزلق من تجمع أكثر من ورقة PDMS أثناء التمدد. </li></ol> 4. الزخرفة خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من 50٪ confluency الثقافة قارورة مع Versene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا و resuspend لهم بتركيز 200،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من تعليق خلية في بركة (انظر مناقشة للحصول على تفاصيل إضافية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ربط أنماط 10-30 دقيقة (اعتمادا على نوع من الخلايا، RPE-1 الخلايا سوف يستغرق 10 دقيقة وخلايا هيلا 20 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف تدفق الخلايا العائمة مع معايرتها المتوسطة (المتوسطة تتوازن في حاضنة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا تنتشر لساعة قليلة على أنماط (RPE-1 سوف تحتاج ما لا يقل عن 2 ساعة؛ خلايا هيلا سوف تحتاج 3 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ساترة على رأس تجمع لتجنب تسرب التبخر والمتوسطة في حال وقوع PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجهاز على مجهر مقلوب وبدء التصوير. تجنب استخدام الغمر النفط أوبjectives لأنها سوف لا تعمل بسبب مشاكل التركيز. </li></ol> 5. تمديد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره المسمار المصغر حين تصحيح الموقف في المرحلة س، ص، ض، ومحور (أساسا خ). موقف المرحلة يحتاج إلى تصحيح لمواجهة اتساع PDMS وفقدان التركيز. (انظر &quot;خلال تمتد&quot; الفقرة في المناقشة). </li></ol>

<ol><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 265-275 (2006).</li>
<li>Terenna, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+mechanisms+redirecting+cell+polarity+and+cell+shape+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical mechanisms redirecting cell polarity and cell shape in fission yeast.</a> Curr. Biol. 18 (22), 1748-1753 (2008).</li>
<li>Guillot, C., Lecuit, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanics+of+epithelial+tissue+homeostasis+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanics of epithelial tissue homeostasis and morphogenesis.</a> Science. 340 (6137), 1185-1189 (2013).</li>
<li>Bosveld, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+morphogenesis+by+Fat%2FDachsous%2FFour-jointed+planar+cell+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway.</a> Science. 336 (6082), 724-727 (2012).</li>
<li>Farhadifar, R., Roper, J. C., Aigouy, B., Eaton, S., Julicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Curr. Biol. 17, 2095-2104 (2007).</li>
<li>Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+anisotropy+of+cortical+forces+orienting+Drosophila+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis.</a> Nat. Cell Biol. 10, 1401-1410 (2008).</li>
<li>Mitrossilis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+response+to+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell response to stiffness.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (38), 16518-16523 (2010).</li>
<li>Irimia, D., Charras, G., Agrawal, N., Mitchison, T., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polar+stimulation+and+constrained+cell+migration+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Polar stimulation and constrained cell migration in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 12, 1783-1790 (2007).</li>
<li>Fink, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+forces+control+mitotic+spindle+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">External forces control mitotic spindle positioning.</a> Nat. Cell. Biol. 13 (7), 771-778 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Azioune, A., Carpi, N., Tseng, Q., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+micropatterns%3A+A+direct+printing+protocol+using+deep+Uvs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein micropatterns: A direct printing protocol using deep Uvs.</a> Methods Cell Biol. 97, 133-146 (2010).</li>
<li>Azioune, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+method+for+high-throughput+surface+patterning+of+deformable+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Robust method for high-throughput surface patterning of deformable substrates.</a> Langmuir. 27 (12), 7349-7352 (2011).</li>
<li>Carpi, N., Piel, M., Azioun, A., Cuvelier, D., Fink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+on+silicon+elastomer+%28PDMS%29+with+deep+UVs%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Micropatterning on silicon elastomer (PDMS) with deep UVs.</a> Protoc. Exch. , (2011).</li>
<li>Sinha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+respond+to+mechanical+stress+by+rapid+disassembly+of+caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cells respond to mechanical stress by rapid disassembly of caveolae.</a> Cell. 144 (3), 402-413 (2011).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

على الرغم من أن هذه التقنية قد استخدمت عدة مرات ويتم اختبارها بدقة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل التجربة. حول PDMS: لهذا العمل، GelPak، ورقة PDMS رقيقة متوفرة تجاريا، استخدمت. بدلا من ذلك ورقة PDMS يمكن أن يلقي مباشرة من PDMS المزيج. ونحن نوصي باستخدام GelPak لأنه أكثر استنساخه، وأقل عرضة للكسر مقارنة PDMS العرف. <p...

الخلايا تتكون الأنسجة في الكائنات العليا تخضع لتوترات الميكانيكية وقوات تمتد القادمة سواء من البيئة الخارجية أو من الخلايا المحيطة 1،2. الخلايا يجب أن تتكيف مع ومقاومة هذه القوى من أجل الحفاظ على سلامة الأنسجة. هذه القوات مهمة للأنسجة التشكل خلال 3،4 التنمية. تطبيق القوى الميكانيكية على الخلايا المستزرعة هو وسيلة لمحاكاة ما يمكن أن يحدث في الأنسجة، ولكن مع مراقبة كمية ومستقلة عن شكل الخلية وتشوه الخلايا 5،6. لهذا، يمكن استخدام عدة تقنيات. يمكن للمرء أن تضغط على الخلايا (خلية كاملة أو جزء منه)، على سبيل المثال باستخدام AFM أو مشتقات 7،8 أو تمتد الركيزة الخلايا تنمو على. الطريقة الموضحة في هذه الورقة يوضح كيفية تمتد ركيزة الطائرة مطلي مع الخلايا. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل لتقييم دور القوات التي تمارس على مخلايا الثدييات itotic 9. الخلايا الإنقسامية البقاء على اتصال من خلال الركيزة الألياف التراجع وتمتد الغشاء تمارس القوة على تلك الألياف، والتي أثارت بدورها دوران المغزل الإنقسامية. مصلحة الجمع بين micropatterns لاصقة وتمتد هو تحقيق مراقبة مستقلة من القوات وشكل الخلايا الفردية. فمن الممكن على سبيل المثال أن تمتد خلية بيضوي الشكل في شكل دائري تماما الخواص، في حين يتم تطبيق تمتد ذو محورين. إذا لم يتم platted الخلايا على micropatterns، ذو محورين تمتد النتائج في استطالة الخلية، مع معظم الخلايا وجود محور طويل تتماشى مع محور التمدد. ومن ثم من الصعب فصل أثر محاذاة المحور الطويل وتأثير امتداد تطبيقها على الخلايا. الجهاز هو مناسبة لأي التصوير الخلية الحية، بما في ذلك وقت طويل مضي فلوري المجهر، والمخدرات يمكن أن تضاف أثناء التجربة. طريقة UVs وmicropatterning عميق 10وقد وصفت بالتفصيل في Azioune وآخرون وصفت 11 الزخرفة على PDMS في Azioune وآخرون 12 الحاضر تمتد البروتوكول هو نسخة من الفيديو كاربي وآخرون 13

<table><tbody><tr><td>GelPak</td><td>GelPak</td><td>PF-60-X4</td> سمك <td>/ الالتصاق المختلفة متوفرة. قد يكون أحد البدائل هو إلقاء PDMS &nbsp الخاص بك. نفسك.</td></tr><tr><td>شحم السيليكون</td><td>GE Bayer سيليكون</td><td>Baysilone-paste</td><td>هذا جهاز متوافق حيويا</td></tr><tr>جهاز<td>تمتد</td><td>GREM m & eacute. نقالة canique</td><td>2011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDC (N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & prime ؛ -ethylcarbodiimide hydrochloride)</td> <td>Sigma</td><td>3450</td><td>مستقر 6 أشهر عند -20 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide ملح الصوديوم)</td><td>Sigma</td><td>56485</td><td>حماية من الرطوبة</td></tr><tr><td>Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 مجم)SurfaceSolutions</td> <td>(زيورخ)</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>قناع ضوئي من الكوارتز الاصطناعي</td><td>Toppan</td><td></td><td>خذ قناع ضوئي ثنائي قياسي في Quartz</td></tr><tr><td>Fibronectin من بلازما البقر</td><td>Sigma</td><td>F1141</td> <td>& nbsp ؛</td></tr></tbody></table>

تمتد خلايا micropatterned على غشاء pdms

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

القوى الميكانيكية المبذولة على الخلايا و / أو الأنسجة تلعب دورا رئيسيا في عمليات عديدة. قمنا بتطوير جهاز لتمتد الخلايا مطلي على PolyDiMethylSiloxane (PDMS) الغشاء، متوافقة مع التصوير. هذا الأسلوب هو استنساخه وتنوعا. يمكن micropatterned الغشاء PDMS من أجل حصر الخلايا أو الأنسجة لهندسة محددة. فإن الخطوة الأولى هي لطباعة micropatterns على الغشاء PDMS مع تقنية الأشعة فوق البنفسجية العميقة. الغشاء PDMS ثم يتم تركيبه على محفة الميكانيكية. A غرفة لا بد على رأس الغشاء مع الشحوم حيويا للسماح مزلق أثناء التمدد. هي المصنفة الخلايا ويسمح لنشر لعدة ساعات على micropatterns. يمكن أن تمتد العينة وغير المتمدد عدة مرات مع استخدام المسمار المصغر. يستغرق أقل من دقيقة لتطبيق تمتد إلى أقصى مداها (حوالي 30٪). لا تتضمن هذه التقنية المعروضة هنا جهاز بمحركات، وهو أمر ضروري لpplying دورات تمتد المتكررة بسرعة و / أو الكمبيوتر التي تسيطر عليها وتمتد، ولكن هذا يمكن تنفيذها. تمتد من الخلايا أو الأنسجة يمكن أن تكون ذات فائدة للأسئلة المتعلقة القوات الخلية، استجابة الخلية لإجهاد ميكانيكي أو التشكل الأنسجة. وهذا عرض فيديو تظهر كيفية تجنب المشاكل النموذجية التي قد تنشأ عند القيام هذا النوع من التجربة التي تبدو بسيطة.

<html> تقنية الواردة في هذا البروتوكول الفيديو يسمح تطبيق القوات على التراجع من ألياف خلايا الثدييات الإنقسامية. في الواقع، أثناء انقسام الخلية، في مرحلة الإنقسامية، خلايا الثدييات تتراجع لتأخذ شكل كرة وتترك وراءها الكابلات أكتين رقيقة تحيط بها غشاء التي تعلق على الركيزة. هذه الكابلات (ألياف التراجع)، هي ذكرى هندسة الخلية قبل الخوض في الانقسام. جعل micropatterns مع الأشعة فوق البنفسجية العميقة من خلال الضوئية على PDMS رقيقة (الشكل 1) يسمح للسيطرة هندسية من التصاق ا...

يقدم هذا المخطوط تقنية لتطبيق أو إطلاق القوات على الخلايا أو الأنسجة الملتصقة باستخدام أحادي الاتجاه تمتد.

تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمديد خلايا ذات نمط محدد على غشاء مرن من البولي داي ميثيل سيلوكسان أو PDMS. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شريحة PDMS، يتبعها تطبيق نمط دقيق على الـ PDMS. بعد ذلك، يتم تركيب شريحة الـ PDMS ذات النمط الدقيق على جهاز التمديد، ثم يوضع فوقها حوض لاحتجاز الوسط الزرعي.بعد ذلك، تُزرع الخلايا على سطح ورقة PDMS ذات النمط الدقيق وتُترك لتلتصق بالنمط قبل الشطف لإزالة الخلايا غير الملتصقة. تتمثل الخطوة النهائية في تسليط استطالة على ورقة PDMS التي تحتوي على الخلايا لشد الخلايا. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفيديو لإظهار أن تسليط القوى على ألياف التراجع للخلايا الثديية في مرحلة الانقسام أثناء شد الخلايا يؤدي إلى تشوه الخلية.يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الميكانيكا الحيوية، مثل ما هي تأثيرات القوى الخارجية على العمليات الخلوية مثل الانقسام؟ لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما أردنا تطبيق قوى على خلية في طور الانقسام؛ لنبدأ بقص قطعة من PDMS تبلغ أبعادها 35 في 20 مليمتر تقريبًا من ورقة جاهزة. وهنا، يتم استخدام ورقة PDMS رقيقة متوفرة تجاريًا لأنها أكثر قابلية للتكرار وأقل عرضة للكسر مقارنة بـ PDMS المصنع حسب الطلب.قم بإزالة طبقات البلاستيك الواقية العلوية والسفلية، واستخدم الملاقط لوضع الـ PDMS في طبق بتري بلاستيكي. بعد ذلك، اغسل الـ PDMS باستخدام 70% ethanol لمدة خمس دقائق على جهاز تدوير (rotator) بمعدل 30 oscillations per minute. بعد عملية الغسيل، جفف السطح عن طريق تمرير تيار هوائي فوقه.بعد ذلك، قم بتسليط الأشعة فوق البنفسجية العميقة على PDMS لمدة خمس دقائق من مسافة تبلغ حوالي خمسة سنتيمترات من مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول E-D-C-N-H-S كما هو موضح في البروتوكول النصي. يجب تحضير المحلول مباشرة قبل الاستخدام لأن تفاعلية المحلول تتناقص في غضون ساعات قليلة.انقل شرائح PDMS من طبق بتري إلى غطاء طبق بتري، والذي لم يتعرض للإضاءة. سيضمن ذلك أن تكون المنطقة المحيطة بـ PDMS كارهة للماء بشدة، مما يسهل الخطوة التالية.قم بنقل محلول E-D-C-N-H-S باستخدام الماصة فوق الـ PDMS واتركه ليتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، اشطف الفائض من E-D-C-N-H-S باستخدام الماء.بعد ذلك، أضف محلول PEG المطعّم بـ PLL واحضنه لمدة تتراوح من ثلاث ساعات إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد انتهاء الحضن، اغسل فائض PEG المطعّم بـ PLL من الـ PDMS باستخدام الماء. وبذلك يصبح الـ PDMS الآن خاملًا أو مفعلاً بـ PEG المطعّم بـ PLL، ويمكن تخزينه لعدة أيام في درجة حرارة 4 °C. ولتنميط الـ PDMS، ضع شريحة PDMS فوق قناع ضوئي من الكوارتز الاصطناعي يحتوي على الميزات الدقيقة الخاصة بالتنميط.ضع جانب الـ PDMS الذي يحمل الـ PEG المطعّم بالـ PLL مواجهاً للجانب الكرومي من القناع الضوئي. ثم قم بالتسليط الضوئي لمدة سبع دقائق من خلال القناع الضوئي على مسافة تبلغ حوالي خمسة سنتيمترات من مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. بعد عملية التسليط الضوئي.أضف الماء فوق القناع وPDMS، ثم قم بإزالة PDMS ببطء من القناع. قم بتثبيت PDMS الذي تم خمله سابقاً على جهاز الشد. ثبّت أحد جانبي PDMS في الجزء الثابت من جهاز الشد. وثبّت الجانب الآخر في الجزء المتحرك من جهاز الشد دون الضغط بشكل مفرط على رقاقة PDMS.إذا تم تثبيت الـ PDMS بإحكام زائد، فسيقل طوله، وقد يؤدي ذلك إلى التمزق لأن الشد سيكون أكبر عند نفس مسافة التمدد. تأكد من ربط البراغي جيداً، وإلا ستنزلق ورقة الـ PDMS بمجرد بدء التمدد، أو في مرحلة لاحقة أثناء التجربة. بعد ذلك، قم بتحضين الـ PDMS مع محلول الفيبرونكتين لمدة ساعة واحدة.في درجة حرارة الغرفة، يمكن استخدام بروتينات مصفوفة خارج خلوية أخرى، ولكن لم يتم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول. وكخطوة نهائية، اشطف الـ PDMS بمحلول ملحي منظم بالفوسفات. بعد ذلك، قم بقص مستطيل من الـ PDMS من شريحة PDMS سميكة.ثم قم بقص مستطيل آخر في الداخل. ومن أجل إنشاء حوض يحتفظ بالخلايا والوسط، أضف شحم السيليكون تحت قطعة الـ PDMS المقصوصة مستطيلِيًّا هذه، ثم ضعها فوق ورقة الـ PDMS لإنشاء حوض للاحتفاظ بالوسط. سيتيح الشحم انزلاق الحوض فوق ورقة الـ PDMS أثناء التمديد لتنميط الخلايا.أولاً، قم بفصل الخلايا من دورق زراعة عند درجة تلاقي 50%. وبمجرد أن تصبح الخلايا في حالة تعليق، استخدم الماصة لسحبها ودفعها عدة مرات باستخدام طرف سعة 200 µL لتفكيك التجمعات، مما يضمن ارتباط الخلايا الفردية بالنمط. بعد ذلك، أضف 1 mL من معلق الخلايا إلى الحوض.اترك الخلايا ترتبط بالأنماط لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة، وذلك حسب نوع الخلية، في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C. وبمجرد التصاق الخلايا بالأنماط، اغسل الخلايا العائمة بلطف باستخدام وسط متوازن لإزالتها.قم بإزالة الوسط باستخدام ماصة شفط مع إضافة الوسط في الوقت ذاته. من الضروري الحفاظ على تدفق كافٍ لغسل الخلايا غير الملتصقة مع إبقاء الخلايا مغمورة في الوسط. بعد ذلك، ضع شريحة غطاء فوق الحوض لتجنب التبخر وتسرب الوسط في حال انكسار PDMS، واترك الخلايا لتنتشر لبضع ساعات على الأنماط.ثم ضع الجهاز على مجهر مقلوب وابدأ بالتصوير. تجنب استخدام العدسات الشيئية ذات الغمر الزيتي لأنها لن تعمل بسبب مشاكل في التركيز. لتمديد خلايا النمط الدقيق، أدر المسمار الميكرومتري مع تصحيح موضع المنصة في المحاور x وy وZ.يجب تصحيح موضع المنصة لمواجهة اتساع مادة PDMS وفقدان التركيز. سمحت التقنية المعروضة في هذا البروتوكول المرئي بتسليط قوى على ألياف الارتداد في الخلايا الثديية أثناء الانقسام الفتيلى عن طريق تمديد الركيزة عند بداية الطور الاستوائي. تم سحب بعض ألياف الارتداد هذه بعيداً عن جسم الخلية، مما أدى إلى تسليط قوة ميكانيكية على قشرة الخلايا المنقسمة؛ ولتحقيق ذلك، يتم زرع الخلية على نمط بيضاوي قبل عملية التمديد.يتم إجراء عملية التشكيل من خلال تمديد مادة PDMS أثناء طبع الأنماط المستديرة عبر القناع الضوئي. وبعد التمديد، يتم تمديد الركيزة بحيث يصبح النمط دائرياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع الخلايا على أنماط كلية (macro patterns) ثم تطبيق قوى تمديد على الركيزة.

stretching-micropatterned-cells-on-a-pdms-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

نقدم في هذه المقالة منصة تمتد الرواية التي يمكن استخدامها لتحقيق استجابات خلية واحدة إلى مجمع متباين الخواص الميكانيكية تشوه ذو محورين وتحديد الخواص الميكانيكية للالأنسجة البيولوجية.

A منصة رواية تمتد للتطبيقات في الخلايا والأنسجة Mechanobiology

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديهم القدرة الذاتية للتمييز وتنظيم الذات في أنماط النسيج متميزة. على الرغم من أن هذا يتطلب عرض التدرجات البيئية المكانية. نقدم الاستنسل micropatterning كوسيلة من وسائل بسيطة وقوية لتوليد التدرجات الكيميائية الحيوية والميكانيكية للسيطرة على أنماط التمايز hPSC.

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

يتم تقديم بروتوكول لإنتاج مساحة كبيرة من الركيزة النانوية من قوالب صغيرة ذات منقوشة نانوية لدراسة التعديل الطوبوغرافي النانوي لسلوك الخلية.

توسيع Nanopatterned ركائز باستخدام تقنية غرزة لNanotopographical التحوير سلوك الخلية

يصف هذا التقرير تقنية بسيطة وسهلة الأداء ، باستخدام فراغ الضغط المنخفض ، لملء قنوات الموائع الدقيقة بالخلايا والركائز للبحث البيولوجي.

منهج تنوعا من الزخرفة البروتينات والخلايا

نقدم هنا، بروتوكول يصف تلفيق قناة المط، مزدوج، الجهاز رقاقة موائع جزيئية خلية الثقافة الأجهزة لأتصدى وظائف الجهاز-مستوى المختبر.

تصنيع قابلة المط ومزدوجة القناة، رقائق موائع جزيئية الجهاز

هنا نقدم بروتوكولا لخلايا الخلايا الدقيقة بدقة خلية واحدة باستخدام التصاق مبرمجة الحمض النووي. يستخدم هذا البروتوكول منصة تصوير ضوئي على سطح المقعد لإنشاء أنماط أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي على شريحة زجاجية ثم تسميات أغشية الخلايا مع أوليغونوكليوتيدات تكميلية متاحة تجاريا. التهجين من oligos النتائج في التصاق الخلايا المبرمجة.

بسيطة، بأسعار معقولة، ونمط وحدات من الخلايا باستخدام الحمض النووي

نحن نصف التحسينات التي أدخلت على طريقة قياسية لقياس قوى الجر الخلوي ، استنادا إلى طباعة التلامس الدقيق مع خطوة نقش طرح واحدة من صفائف نقطية من بروتينات المصفوفة خارج الخلية على الهلاميات المائية اللينة. تسمح هذه الطريقة بتصنيع أبسط وأكثر اتساقا لأنماط الجزر ، وهو أمر ضروري للتحكم في شكل مجموعة الخلايا.

توليد النمط لمجهر الجر المجهري

تقليديا ، يتم إجراء زراعة الخلايا على ركائز مستوية تحاكي بشكل سيئ البيئة الطبيعية للخلايا في الجسم الحي. هنا نصف طريقة لإنتاج ركائز زراعة الخلايا مع الهندسة المنحنية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية والبروتينات خارج الخلية ذات النمط المجهري ، مما يسمح بإجراء تحقيقات منهجية في الاستشعار الخلوي لهذه الإشارات خارج الخلية.

توليد البيئات الدقيقة الخلوية متعددة الإشارات عن طريق التنميط الضوئي بالأشعة فوق البنفسجية لركائز زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد

يصف هذا البروتوكول طريقة نقش خلية خالية من الحبر وخالية من الملصقات ومستقلة عن الركيزة وعالية الإنتاجية تعتمد على تأثير أرخميدس المغناطيسي.

نمط الخلية باستخدام استراتيجية أرخميدس المغناطيسية

هنا ، نقدم جهاز تمدد متساوي المحور متعدد الاستخدامات يتم تشغيله بالهواء المضغوط ومتوافق مع الفحص المجهري عالي الدقة.

جهاز تمدد متساوي المحور للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية عالية التكبير

نقدم منصة فحص صلابة ديناميكية وقابلة للانعكاس مصنوعة باستخدام مطاط أسطوانة سيليكون فائق النعومة (بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان ، PDMS) مع جزيئات الحديد المدمجة. هذا الاختبار الجديد مناسب لدراسة التغيرات الفيزيائية الناشئة المعتمدة على الوقت في الأنماط الظاهرية للخلايا ، بما في ذلك توجيه الاتصال. هنا ، نقيس محاذاة خلايا عضلة القلب للفئران حديثي الولادة عند تصلب المصفوفة باستخدام المغناطيسية.

اللدائن المغناطيسية الريولوجية الممنقوشة لدفع التغييرات في محاذاة خلايا عضلة القلب

اكتشف طريقة تمدد الخلايا اللاصقة على غشاء PDMS المرن باستخدام تقنية النمط الدقيق. تتيح هذه الطريقة دراسة استجابة الخلايا للقوى الميكانيكية أثناء الانقسام.

تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

استكشف المزيد من الفيديوهات