تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمديد خلايا ذات نمط محدد على غشاء مرن من البولي داي ميثيل سيلوكسان أو PDMS. ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير شريحة PDMS، يتبعها تطبيق نمط دقيق على الـ PDMS. بعد ذلك، يتم تركيب شريحة الـ PDMS ذات النمط الدقيق على جهاز التمديد، ثم يوضع فوقها حوض لاحتجاز الوسط الزرعي.

بعد ذلك، تُزرع الخلايا على سطح ورقة PDMS ذات النمط الدقيق وتُترك لتلتصق بالنمط قبل الشطف لإزالة الخلايا غير الملتصقة. تتمثل الخطوة النهائية في تسليط استطالة على ورقة PDMS التي تحتوي على الخلايا لشد الخلايا. وفي النهاية، يُستخدم المجهر الفيديو لإظهار أن تسليط القوى على ألياف التراجع للخلايا الثديية في مرحلة الانقسام أثناء شد الخلايا يؤدي إلى تشوه الخلية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الميكانيكا الحيوية، مثل ما هي تأثيرات القوى الخارجية على العمليات الخلوية مثل الانقسام؟ لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما أردنا تطبيق قوى على خلية في طور الانقسام؛ لنبدأ بقص قطعة من PDMS تبلغ أبعادها 35 في 20 مليمتر تقريبًا من ورقة جاهزة. وهنا، يتم استخدام ورقة PDMS رقيقة متوفرة تجاريًا لأنها أكثر قابلية للتكرار وأقل عرضة للكسر مقارنة بـ PDMS المصنع حسب الطلب.

قم بإزالة طبقات البلاستيك الواقية العلوية والسفلية، واستخدم الملاقط لوضع الـ PDMS في طبق بتري بلاستيكي. بعد ذلك، اغسل الـ PDMS باستخدام 70% ethanol لمدة خمس دقائق على جهاز تدوير (rotator) بمعدل 30 oscillations per minute. بعد عملية الغسيل، جفف السطح عن طريق تمرير تيار هوائي فوقه.

بعد ذلك، قم بتسليط الأشعة فوق البنفسجية العميقة على PDMS لمدة خمس دقائق من مسافة تبلغ حوالي خمسة سنتيمترات من مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير محلول E-D-C-N-H-S كما هو موضح في البروتوكول النصي. يجب تحضير المحلول مباشرة قبل الاستخدام لأن تفاعلية المحلول تتناقص في غضون ساعات قليلة.

انقل شرائح PDMS من طبق بتري إلى غطاء طبق بتري، والذي لم يتعرض للإضاءة. سيضمن ذلك أن تكون المنطقة المحيطة بـ PDMS كارهة للماء بشدة، مما يسهل الخطوة التالية.

قم بنقل محلول E-D-C-N-H-S باستخدام الماصة فوق الـ PDMS واتركه ليتحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التحضين، اشطف الفائض من E-D-C-N-H-S باستخدام الماء.

بعد ذلك، أضف محلول PEG المطعّم بـ PLL واحضنه لمدة تتراوح من ثلاث ساعات إلى ليلة كاملة في درجة حرارة الغرفة؛ وبعد انتهاء الحضن، اغسل فائض PEG المطعّم بـ PLL من الـ PDMS باستخدام الماء. وبذلك يصبح الـ PDMS الآن خاملًا أو مفعلاً بـ PEG المطعّم بـ PLL، ويمكن تخزينه لعدة أيام في درجة حرارة 4 °C. ولتنميط الـ PDMS، ضع شريحة PDMS فوق قناع ضوئي من الكوارتز الاصطناعي يحتوي على الميزات الدقيقة الخاصة بالتنميط.

ضع جانب الـ PDMS الذي يحمل الـ PEG المطعّم بالـ PLL مواجهاً للجانب الكرومي من القناع الضوئي. ثم قم بالتسليط الضوئي لمدة سبع دقائق من خلال القناع الضوئي على مسافة تبلغ حوالي خمسة سنتيمترات من مصابيح الأشعة فوق البنفسجية. بعد عملية التسليط الضوئي.

أضف الماء فوق القناع وPDMS، ثم قم بإزالة PDMS ببطء من القناع. قم بتثبيت PDMS الذي تم خمله سابقاً على جهاز الشد. ثبّت أحد جانبي PDMS في الجزء الثابت من جهاز الشد. وثبّت الجانب الآخر في الجزء المتحرك من جهاز الشد دون الضغط بشكل مفرط على رقاقة PDMS.

إذا تم تثبيت الـ PDMS بإحكام زائد، فسيقل طوله، وقد يؤدي ذلك إلى التمزق لأن الشد سيكون أكبر عند نفس مسافة التمدد. تأكد من ربط البراغي جيداً، وإلا ستنزلق ورقة الـ PDMS بمجرد بدء التمدد، أو في مرحلة لاحقة أثناء التجربة. بعد ذلك، قم بتحضين الـ PDMS مع محلول الفيبرونكتين لمدة ساعة واحدة.

في درجة حرارة الغرفة، يمكن استخدام بروتينات مصفوفة خارج خلوية أخرى، ولكن لم يتم اختبارها باستخدام هذا البروتوكول. وكخطوة نهائية، اشطف الـ PDMS بمحلول ملحي منظم بالفوسفات. بعد ذلك، قم بقص مستطيل من الـ PDMS من شريحة PDMS سميكة.

ثم قم بقص مستطيل آخر في الداخل. ومن أجل إنشاء حوض يحتفظ بالخلايا والوسط، أضف شحم السيليكون تحت قطعة الـ PDMS المقصوصة مستطيلِيًّا هذه، ثم ضعها فوق ورقة الـ PDMS لإنشاء حوض للاحتفاظ بالوسط. سيتيح الشحم انزلاق الحوض فوق ورقة الـ PDMS أثناء التمديد لتنميط الخلايا.

أولاً، قم بفصل الخلايا من دورق زراعة عند درجة تلاقي 50%. وبمجرد أن تصبح الخلايا في حالة تعليق، استخدم الماصة لسحبها ودفعها عدة مرات باستخدام طرف سعة 200 µL لتفكيك التجمعات، مما يضمن ارتباط الخلايا الفردية بالنمط. بعد ذلك، أضف 1 mL من معلق الخلايا إلى الحوض.

اترك الخلايا ترتبط بالأنماط لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة، وذلك حسب نوع الخلية، في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C. وبمجرد التصاق الخلايا بالأنماط، اغسل الخلايا العائمة بلطف باستخدام وسط متوازن لإزالتها.

قم بإزالة الوسط باستخدام ماصة شفط مع إضافة الوسط في الوقت ذاته. من الضروري الحفاظ على تدفق كافٍ لغسل الخلايا غير الملتصقة مع إبقاء الخلايا مغمورة في الوسط. بعد ذلك، ضع شريحة غطاء فوق الحوض لتجنب التبخر وتسرب الوسط في حال انكسار PDMS، واترك الخلايا لتنتشر لبضع ساعات على الأنماط.

ثم ضع الجهاز على مجهر مقلوب وابدأ بالتصوير. تجنب استخدام العدسات الشيئية ذات الغمر الزيتي لأنها لن تعمل بسبب مشاكل في التركيز. لتمديد خلايا النمط الدقيق، أدر المسمار الميكرومتري مع تصحيح موضع المنصة في المحاور x وy وZ.

يجب تصحيح موضع المنصة لمواجهة اتساع مادة PDMS وفقدان التركيز. سمحت التقنية المعروضة في هذا البروتوكول المرئي بتسليط قوى على ألياف الارتداد في الخلايا الثديية أثناء الانقسام الفتيلى عن طريق تمديد الركيزة عند بداية الطور الاستوائي. تم سحب بعض ألياف الارتداد هذه بعيداً عن جسم الخلية، مما أدى إلى تسليط قوة ميكانيكية على قشرة الخلايا المنقسمة؛ ولتحقيق ذلك، يتم زرع الخلية على نمط بيضاوي قبل عملية التمديد.

يتم إجراء عملية التشكيل من خلال تمديد مادة PDMS أثناء طبع الأنماط المستديرة عبر القناع الضوئي. وبعد التمديد، يتم تمديد الركيزة بحيث يصبح النمط دائرياً. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زرع الخلايا على أنماط كلية (macro patterns) ثم تطبيق قوى تمديد على الركيزة.