مراقبة المنافسة داخل الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية عن طريق Cocultivation من السلالات المسمى Fluorescently

تستخدم هذه الطريقة الزراعة المشتركة للعصيات المصنوعة من الفلورسنت لمراقبة التوسع النسيلي السريع والقضاء على الطفرات المفيدة والضارة في مجموعة الخلايا البكتيرية بمرور الوقت. أولا ، قم بإعداد الثقافات المسبقة للبكتيريا لتجربة المنافسة. امزج كميات متساوية من السلالات المصنفة بالفلورسنت وقم بزراعة البكتيريا في ظل ظروف غذائية مختلفة.

ثم اجمع العينات في نقاط زمنية مختلفة ، وقم بتخفيفها بشكل مناسب ونشر الخلايا على ألواح أجار. الآن تصور واحسب السلالات الباقية عن طريق الفحص المجهري الفلوري الاستريو. في النهاية ، يمكن للنتائج تحديد النسبة المئوية للبكتيريا الباقية فيما يتعلق بالعدد الكامل للمستعمرات التي تم تعدادها.

على عكس مراقبة المنافسة داخل الأنواع باستخدام أشرطة مختلفة للمضادات الحيوية لوضع العلامات على السلالة. في هذه الطريقة ، تكون السلالات المنافسة ذات العلامات الفلورية متساوية التوتر بالكامل تقريبا وقادرة على التخمير على نفس ألواح AGA. سيتم تقديم الإجراء المسبق من قبل لورينا ، وهي طالبة دكتوراه في مختبري ، وتلقيح أربعة ملليلتر من وسط LB بميكرولتر واحد من البكتيريا من 80 درجة مئوية تحت الصفر ، ومخزون التبريد ، وزراعة الثقافات المسبقة بين عشية وضحاها عند 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة ، وتخفيف 0.1 مل من الثقافة إلى 0.9 مل من وسط LB في 1.5 مليلتر ، وتحديد الكثافة البصرية.

ثم للحصول على مجموعات الخلايا المختلطة لتجارب المنافسة ، قم بتلقيح قوارير اهتزاز 100 مل تحتوي على 20 مل من CGLC و CGLC. الحد الأدنى من الوسط بنسبة واحد إلى واحد ، انقل 10 مل من الثقافات إلى أنابيب بلاستيكية سعة 15 مل. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 4،000 مرة من الجاذبية وتخلص من المادة الطافية.

ثم أعد تعليق الخلايا في 0.5 مل من وسط LB الطازج ، وانقل الخلايا إلى كوب تفاعل معقم سعة 1.5 مليلتر أضف 0.5 مل من الجلسرين المعقم بنسبة 50٪. امزج التعليق عن طريق دوامة صارمة وقم بتخزين العينات في فريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر. الثقافة التالية ، البكتيريا المتبقية في قوارير الاهتزاز.

احتفظ بقوارير الاهتزاز في الظلام لمنع التبييض الضوئي لعينة قوة النباتات 0.1 مل من الثقافات بعد سبع ساعات و 24 ساعة من قياس النمو ولاحظ الكثافة البصرية من واحد إلى 10 تخفيف من العينات ، مما يجعل مخزونات التبريد من العينات لتخزينها عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد جمع جميع العينات ، قم بإذابة مخزون التبريد وتخفيف الخلايا في محلول ملحي بنسبة 0.9٪ لكل لوحة سلالة. 0.1 ملليلتر من التخفيف الخامس من 10 إلى سالب على صفيحة أجار متوسطة SP ، وتوزيع الخلايا باستخدام ماصة زجاجية معقمة.

احتضن الصفائح طوال الليل عند 37 درجة مئوية في الظلام حتى تظهر مستعمرات مفردة بقلم أسود. قسم الجزء السفلي من لوحة الأجار إلى أربعة أجزاء للحصول على اتجاه أفضل أثناء عد الناجين تحت المجهر الفلوري الاستريو. الآن ، ضع اللوحة رأسا على عقب تحت المجهر واجعل المستعمرات في بؤرة التركيز باستخدام مصدر الضوء البارد.

بمجرد أن تصبح المستعمرات في بؤرة التركيز ، قم بالتبديل إلى مجموعة المرشح المناسبة ل CFP Flora four. لتصور الخلايا الباقية من السلالة المسماة CFP ، احسب الناجين من هذه السلالة عن طريق تسمية المستعمرات بقلم. ولاحظ الرقم.

قم بإزالة الملصقات بالإيثانول. ثم قم بالتبديل إلى مجموعة مرشح YFP. لتصور الخلايا الباقية من YFP المسمى السلالة.

عد الناجين مرة أخرى عن طريق تسمية المستعمرات بقلم. ولاحظ الرقم. افتح الصور من مكان واحد تم التقاطها باستخدام مجموعة مرشح CFP ومجموعة مرشح YFP.

قم بتحسين التباين والسطوع لتقليل أي تألق في الخلفية من الوسائط. انتقل إلى إحدى الصور وحدد الكل. انسخ الصورة والصقها على الصورة الأخرى.

ادمج الصور عن طريق تحديد الخيار بلون أفتح في قائمة الطبقات. في هذه التجربة ، تم تصنيف مجموعة خلايا تتكون من سلالتين من BCI باستخدام Fluor CFP و YFP لتقييم تأثير مصادر النيتروجين المختلفة على النمو عن طريق الطلاء بالتخفيف المناسب على ألواح الأجار. يمكن تحديد التركيب النسيلي لمجموعة الخلايا بمرور الوقت بدقة ببساطة عن طريق حساب مستعمرات الفلورسنت الصفراء والزرقاء.

يؤثر نشاط إنزيم نازعة هيدروجين الغلوتامات بشدة على لياقة أوتوس اعتمادا على توافر الغلوتامات الخارجية. في حالة عدم وجود الغلوتامات الخارجية ، يكون نشاط GDH عالي المستوى غير موات للبكتيريا حيث أن الإنزيمات الصخور G و B الجيدة تحلل الغلوتامات اللازمة في ابتناء. على النقيض من ذلك ، فإن تخليق اثنين من gdhs وظيفية مفيد للبكتيريا عندما تتوفر الغلوتامات الخارجية لأنه بالإضافة إلى الجلوكوز G ، يتم استخدام الغلوتامات كمصدر للكربون.

تم الحصول على نتائج مماثلة في تجربة تبديل القوالب. مرة أخرى ، تنافست البكتيريا المجهزة بنشاط GDH عالي المستوى من قبل الخلايا ذات نشاط GDH المنخفض في وسط النمو الذي يفتقر إلى الغلوتامات. على النقيض من ذلك ، تم القضاء على البكتيريا التي تصنع GDH نشط واحد فقط من الثقافة.

عندما تم استكمال الوسط بالغلوتامات ، من الواضح أن التركيب الأولي لمجموعة الخلايا المختلطة ظل ثابتا تقريبا بمرور الوقت. بغض النظر عن الفلور مجتمعة. يعد استخدام Flora Force أداة قوية لمراقبة المنافسة بين الأنواع في مجموعة الخلايا البكتيرية بمجرد إنشاء نقاط القوة المنافسة.

يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمسة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.