دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

الهدف العام من التجربة التالية هو التقاط العملية الديناميكية في الوقت الفعلي لنضج البلعمة والتكوين الحيوي للبلعمة في الخلايا البلعمة. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل المقصورات الليزوزومية للخلايا بخيط dex المترافق الفلوري لتمكين تصور المقصورات الليزوزومية ونقل حمولتها اللمعية إلى البلعمة. كخطوة ثانية ، تتم إضافة الجسيمات الدقيقة ، والتي تعمل كنموذج بلعمة.

بعد ذلك ، يتم تحليل توصيل المواد الليزوزومية إلى البلعمة باستخدام تصوير البيع المباشر ومعالجة الصور الرقمية اللاحقة. من أجل تحديد عملية نضج البلعمة ، تظهر النتائج تأثير العوامل المختلفة على عملية نضوج البلعمة بناء على توصيل المحتوى الليزوزومي إلى البلعمة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية ، مثل تقييم نضوج البلاعم في الخلايا الثابتة هي القراءة الكمية بدقة زمنية عالية ابدأ بإذابة تكساس الأحمر المسمى 70 كيلودالتون DExT أو Dex 70 KD في PBS عند 20 ملليغرام لكل مليلتر وتخزين الحصص عند 20 درجة مئوية تحت الصفر.

بعد ذلك ، قم بتخفيف مخزون Dex 70 KD في زراعة الخلايا الكاملة Docos أو وسط النسور المعدلة أو DMEM إلى ما يقرب من ملليغرام واحد لكل مليلتر. قم بتوصيل حبلا DExT في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة خمس دقائق. ثم قم بالطرد المركزي للمحلول في جهاز طرد مركزي دقيق بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق لإزالة أي كتل أو ملوثات من المحلول.

انقل SuperAgent بحذر إلى أنبوب جديد مع تجنب الحبيبات الموجودة في الأسفل. ثم قم بتخفيف المحلول إلى تركيز عمل نهائي يبلغ 20 ميكروغرام لكل مليلتر في ثقافة الخلية الكاملة. DMEM والتصفية.

عقم المحلول من خلال مرشح مثبت على حقنة 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، انظر ملليلترين من ضامة الفأر المشتقة من نخاع العظم بتركيز خمسة في 10 للخلايا الرابعة لكل مليلتر. في DMEM في طبق زجاجي غير مطلي ، احتضن الخلايا لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية في جو مخزن بثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

لضمان التعلق والتأقلم بعد التعلق ، قم بشفط الوسط وأضف ملليلترين من حبلا DExT قبل الحرب DMEM إلى الطبق السفلي الزجاجي ، ثم احتضان الخلايا لمدة ساعتين إلى ثماني ساعات بعد الحضانة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام DMEM الكامل. استنشق الوسط بعد الشطف النهائي وأضف ملليلترين من DMEM الكامل.

احتضان الخلايا لمدة أربع إلى 12 ساعة. ثم اشطف الخلايا باستخدام DMEM كامل خال من الفينول الأحمر ، وأضف ملليلترين من DMEM الخالية من الفينول الأحمر الكامل قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء التصوير. بعد ذلك ، أحضر حصة من معلق البنجر المطلي ب 1٪ IgG المحضر كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب إلى درجة حرارة الغرفة.

قم بتوصيل المحلول في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم تحت خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية ، أضف واحدا إلى ستة ميكرولتر من تعليق الخرزة إلى الخلايا. انشر سحابة الخرز الكثيفة باستخدام ماصة لخلط المعلق برفق في الطبق السفلي الزجاجي.

ثم أحضر العينة إلى المجهر وركز على المنطقة التي تهمك. قبل التصوير بفاصل زمني. قم بتحسين الإعدادات بما في ذلك المسح الضوئي وتكبير السرعة والدقة حتى تتمكن من التقاط إطار واحد كل سبع إلى 20 ثانية.

اضبط إعدادات انبعاث الإثارة بناء على نظام التصوير والمجسات المستخدمة وقم بتحسين الإعدادات لمنع التبييض المفرط للصور. ثم التقط فيديو الفاصل الزمني واحفظه بتنسيق الملف الأصلي للمجهر. تجنب تصدير الفيديو بتنسيقات مضغوطة مثل JPG أو PNG.

بعد ذلك ، قم بتشغيل توزيع Fiji و Image J الذي يحتوي على حزمة معالجة الصور مع قوائم الأدوات المعاد تنظيمها والمكونات الإضافية الأصلية المتاحة مجانا. تحميل. افتح الملف في فيجي وحدد الفيديو المراد تقييمه. ثم قم بتعيين الخيارات والمرشحات ومعلمات القياس كما هو مفصل في بروتوكول النص المصاحب.

بعد ذلك ، امسح الصور مع ملاحظة الإطار الذي يتشكل فيه البلعمة الوليدة الكاملة وإغلاق الكوب الحمضي F. استخدم أداة التحديد البيضاوي لتحديد منطقة دائرية ذات اهتمام أو عائد استثمار على الخرزة الداخلية. تأكد من أن التحديد يناسب الحافة الخارجية للحبة بإحكام.

ثم انتقل إلى التحليل وانقر فوق قياس لتنفيذ القياس. سيتم عرض النتيجة في نافذة منفصلة بعنوان النتائج. في إطار الاهتمام التالي ، اضبط موضع عائد الاستثمار في حالة تحرك الخرزة وكرر القياس ، والذي ستتم إضافته إلى القائمة في نافذة النتائج.

يمكن تحديد كل إطار تم تحليله استنادا إلى القيمة الموجودة في عمود التسمية. بعد الانتهاء من قياس جميع الإطارات ذات الصلة ، انسخ القيم من عمود int den إلى تطبيق جدول بيانات. يصور العمود int den شدة المنطقة المحددة.

باستخدام هذه الطرق ، تم التقاط صور واضحة للضامة المشتقة من نخاع العظم والتي تم تحميلها بمجسات حبلا DExT. هذه الصورة من الوقت صفر ، وهو فقط عندما أكملت الخلية امتصاص حبة IgG المشفرة المشار إليها هنا. كانت الصور المعروضة هنا ملونة زائفة لتحسين الرؤية وتصور البلعمة من صفر إلى 85 دقيقة بعد امتصاصها.

يتم تحديد البلعمة المقاسة ، عائد الاستثمار بالخط المتقطع ويتم الإشارة إلى حالات تسليم ديكستران وتراكمه في البلعمة بواسطة الأسهم. ثم تم إنشاء الرسوم البيانية من هذه الصور وتظهر اتجاها زمنيا واضحا لارتباط الإشارة بالبلعمة بمرور الوقت. يمثل هذا التمثيل البياني ما معدله 10 بلعمات من الخليتين الموضتين هنا.

في حين أن شدة الإشارة المطلقة غالبا ما تختلف بين كل بلعمة تم تحليلها ، فإن الاتجاه الزمني عادة ما يكون متشابها جدا. تسليم Dex 70 دينار كويتي إلى البلعمة ، تم الوصول إلى هضبة في غضون 35 إلى 40 دقيقة بعد البلعمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم نضج البلعمة باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني.