Name: دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: اكتشف عملية نضج الجسيمات البلعمية في الخلايا البلعمية باستخدام التصوير الحي للخلايا والمعالجة الرقمية للصور. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الحويصلات الهضمية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر أعضاء مختبر علم الأحياء يبلوع لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم هذا العمل من خلال منحة هيلمهولتز يونغ محقق (مبادرة وصناديق شبكات للجمعية هيلمهولتز) وبرنامج منح الأولوية SPP1580 مجلس البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث، DFG).

<ol><li>Greenberg, S., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis and innate immunity.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).</li>
<li>Jutras, I., Desjardins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+at+the+crossroads+of+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity.</a> Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).</li>
<li>Iwasaki, A., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+adaptive+immunity+by+the+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of adaptive immunity by the innate immune system.</a> Science. 327, 291-295 (2010).</li>
<li>Stuart, L., Ezekowitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Blander, J. M., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+regulation+of+phagosome+maturation+and+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">On regulation of phagosome maturation and antigen presentation.</a> Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).</li>
<li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+aging+gracefully%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: aging gracefully.</a> Biochem. J. 366, 689-704 (2002).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes%3A+fusion+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes: fusion and function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Luzio, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome-endosome+fusion+and+lysosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis.</a> J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).</li>
<li>Eissenberg, L., Goldman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+lysosomes+with+phagosomes+containing+Histoplasma+capsulatum%3A+use+of+fluoresceinated+dextran%29%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran).</a> Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).</li>
<li>de Souza Carvalho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization%2C+phagolysosomal+biogenesis+and+killing+of+mycobacteria+in+enucleated+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells.</a> Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+sequential+delivery+of+fluorescent+lysosomal+probes+into+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+Fuse+with+Late+Endosomes+and%2For+Lysosomes+by+Extension+of+Membrane+Protrusions+along+Microtubules%3A+Role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP.</a> Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Huynh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAMP+proteins+are+required+for+fusion+of+lysosomes+with+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes.</a> EMBO J. 26, 313-324 (2007).</li>
<li>Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+mechanism+of+cargo+sorting+during+lysosome-phagosome+fusion+is+controlled+by+Rab34%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).</li>
<li>Snijder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+context+determines+cell-to-cell+variability+in+endocytosis+and+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection.</a> Nature. 461, 520-523 (2009).</li>
<li>Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).</li>
<li>Hemmi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Toll-like+receptor+recognizes+bacterial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.</a> Nature. 408, 740-745 (2000).</li>
<li>Underhill, D., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+key+mediators+of+microbe+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: key mediators of microbe detection.</a> Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).</li>
<li>Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+I+and+class+III+phosphoinositide+3-kinases+are+required+for+actin+polymerization+that+propels+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes.</a> J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+receptor-ligand+interactions+modulate+gene+expression+and+phagosomal+properties+during+both+early+and+late+stages+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis.</a> Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+phagosome+maturation+as+a+function+of+phagosome%2Flysosome+fusion+and+acquisition+of+hydrolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity.</a> Traffic. 6, 413-420 (2005).</li>
<li>Savina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2+controls+phagosomal+pH+to+regulate+antigen+processing+during+crosspresentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells.</a> Cell. 126, 205-218 (2006).</li>
<li>Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+phagosome+maturation+through+the+real-time%2C+spectrofluorometric+measurement+of+hydrolytic+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities.</a> Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).</li>
<li>Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Hoffmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+phagosomal+degradation+and+antigen+presentation+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).</li>
<li>Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+Responds+to+Chloride+and+pH+as+Synergistic+Cues+to+the+Immune+Status+of+its+Host+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell.</a> PLoS Pathog. 9, (2013).</li>
<li>Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytic+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).</li>
<li>Rogers, L., Foster, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).</li>
<li>Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+marches+on+its+phagosome%3A+dynamic+assays+of+phagosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).</li>
<li>Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+pH%2C+ROS+production%2C+maturation%2C+and+degradation+in+dendritic+cell+phagosomes+using+cytofluorometry-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays.</a> Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في المقطع التالي سوف نناقش الخطوات الحاسمة من طريقة عرض وحدوده. أبعد من ذلك، ونحن سوف تواصل بعض المشاكل الشائعة مع حلولها، وإدخال التعديلات الممكنة والنظر في مزايا أسلوبنا فضلا عن أساليب تكميلية مناسبة لهذا النهج. إعداد حبات، بما في ذلك اقتران مفتش على سطح حبة، أمر بالغ الأهمية، وينبغي تجنب استعمال مستحضرات أونفريش. في الإضافات إلى ذلك، فإنه أمر بالغ الأهمية أيضا أن يتم إعداد ديكستران من الأسهم المجمدة (المخفف وت...

البالعات المهنية، بما في ذلك الضامة، تلعب حاسما في الجهاز المناعي. بالإضافة إلى كونها خط الدفاع الأول في نظام المناعة الفطرية، كما أنها تلعب دورا حاسما في تفعيل المناعة التكيفية من خلال إشارات وتقديم المستضد دورا 1-3. بينما وظيفة البالعات المهنية متعددة الأوجه، يبلوع النضج هو العمود الفقري الحرجة للجراثيم ومستضد تجهيز ظيفة البالعات المهنية 4،5. على مستقبلات بوساطة الإحاطة وامتصاص هدفا البلعمية، مثل البكتيريا، ويبلوع الوليدة يمر عبر سلسلة معقدة ومنسقة جيدا من التفاعل والتبادل مع مقصورات للشبكة التقامي والعديد من العضيات الخلوية الأخرى 6. طبيعة المركبات تبادلها مع هذه الكيانات الخلوية وكذلك تنظيم وتوقيت الأحداث الانصهار يحدد اللمعية phagosomal الوسط وphagosالعمال تكوين الغشاء، وبالتالي 7، مصير يبلوع النضج 8. ويتمثل أهمية الفسيولوجية لليبلوع النضج من الاستراتيجيات المتنوعة التي تستخدمها مختلف مسببات الأمراض بين الخلايا للهروب من واعتقال أو تخريب يبلوع النضج 9. معظم هذه الاستراتيجيات بشكل مباشر أو غير مباشر منع المرحلة النهائية والحاسمة من عملية النضج يبلوع: انصهار يبلوع مع أواخر مقصورات endosomal / الليزوزومية، التي يمنحها لهم الجزء الأكبر من الانزيمات حلمهي والعوامل المضادة للبكتيريا من يبلوع ناضجة 7 ، 8،10. تحليل هذه الخطوة النهائية والحاسمة وبالتالي يمكن أن توفر لنا مؤشرات قوية حول حالة نضوج phagosomes وإذا كانت الدولة الفسيولوجية الطبيعية يجري تتأثر سلبا أو إيجابا تحت إعدادات معينة التجريبية التي يجري استخدامها. مقصورة أواخر endosomal / الليزوزومية<html> وتعتبر ليالي عموما أن تكون المقصورات محطة لمسار التقامي، الذي يعرف ومتميزة من المقصورات التقامي في وقت مبكر عن وجود مختلف، مرحلة محددة، والجزيئات علامة. على سبيل المثال الانزيمات حلمهي أو مكونات الأغشية مثل البروتينات المرتبطة غشاء الليزوزومية (مصابيح) وغيرها 11. محطة التقامي المشار المقصورات من الآن فصاعدا إلى مجرد الجسيمات الحالة أيضا بمثابة الموقع الرئيسي للمراحل النهائية من عملية الهضم في نهاية أكلة / التقامي مسار 12. بهذه الطريقة، يمكن تحميلها من خلال تحقيقات غير قابلة للهضم والإلتقام macropinocytosis من الوسط خارج الخلية ونقلها عبر مسار التقامي إلى الجسيمات الحالة، حيث يتراكم 13،14 بعد اتباع دورة محددة من امتصاص والمطاردة. وتستخدم المجسات-Fluorophore مترافق للفحص المجهري الفلورسنت مثل البوليمر العضوية ديكستران غير قابلة للهضم عادة باسم endocyticprobes 15-17. ق = &quot;jove_content&quot;&gt; في هذه الطريقة، ونحن تصف استخدام بلي مفتش المغلفة كبضاعة البلعمية للتحقيق يبلوع النضج من خلال تحليل تسليم الليزوزومية المحتويات اللمعية لphagosomes. باستخدام مسبار ديكستران-fluorophore مترافق كعلامة كشفها بسهولة من الجسيمات الحالة في نخاع العظام الحية المستمدة الضامة (BMM) والوقت الفاصل بين التصوير الفيديو مع متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي، ونحن نتابع عملية ديناميكية من تسليم البضائع في phagosomes مع ارتفاع القرار الزماني. نحن ثم تصف كيف يمكن تقييم البيانات الوقت الفاصل بين التصوير التي تم جمعها باستخدام مفتوحة المصدر ومتاحة بحرية برمجيات تحليل الصور، فيجي (أو يماغيج)، وتحليلها إحصائيا باستخدام Microsoft Excel وعرضها باستخدام برامج GraphPad بريزم 14،18. بعد وصف أسلوبنا، والتجارب مماثلة يمكن تصميم باستخدام إعدادات والعوامل المعدلة للتحقيق تأثيرها على يبلوع النضج؛ تقريبا أي بعد التمديدنوع من الخلايا البلعمية لها الأولية أو خط خلية ملتصقة، وفقدان الوراثية من التجارب ظيفة بما في ذلك الجينات خروج المغلوب وتدق إلى أسفل، المسوخ أو التعبير عن البروتينات الانصهار، الأهداف، أكلة، ومركبات الطلاء microbead، تحقيقات endosomal / الليزوزومية ومثل هذه العوامل السيتوكينات، مثبطات الكيميائية، أو سيرنا من بين أمور أخرى كلها المتغيرات التي يمكن تطبيقها على النهج الأساسي من هذا الأسلوب. نحدد الهدف والمتطلبات الأساسية لهذه الطريقة على النحو التالي: <ul type="disc" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهدف من طريقة: لتمكين الملاحظة المباشرة، الكمية والنوعية وتحليل يبلوع النضج مع القرار الزماني عالية في الخلايا الحية البلعمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البضائع البلعمية: وmicroparticle المغلفة بشكل مناسب أو الهدف البيولوجية. نحن هنا استخدام مفتش المغلفة 3 ميكرون المجهرية الدقيقة البوليسترين كروية التي يتم المنضوية بسهولة عبر FC-γ مستقبلات بوساطة البلعمة. بدلا من ذلك، أي الكائنات الحية الدقيقة أو هيئة التصنيع العسكري المغلفةroparticle التي مستقبلات البلعمية موجود على خلايا يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا البلعمية: الخلايا البلعمية تمسكا معربا عن مستقبلات البلعمية المناسبة. نحن هنا استخدام الماوس BMMs الأولية التي تعبر بجلاء المستقبلات FC-γ. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم الخلايا الجذعية (DC)، وحيدات الخلايا الظهارية أو أكلة أو طفرات وراثية أو المتغيرات خروج المغلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الليزوزومية البضائع: A التحقيق الليزوزومية fluorescently المسمى. هنا، يتم استخدام تكساس الأحمر مترافق-70،000 kiloDaltons ديكستران (Dex70kD) مثل البضائع اللمعية من الجسيمات الحالة. بدلا من ذلك، أي علامة fluorescently كشف من حجرة الخلوية أو عضية، أو التحقيق الملائمة لخصائص phagosomal مثل الحموضة أو الهادمة القدرات، يمكن أن تستخدم لدراسة تطور يبلوع النضج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العوامل المؤثرة: على سبيل المثال، يشير الجزيئات، والمركبات الكيميائية، جين تدق إلى أسفل، أو التعبير عابرة للبروتينات متحولة يمكن. هنا، لقد forgواحد استخدام مثل هذا العامل من أجل البساطة، ولكن لمثال حديث مع متحولة التعبير البروتين وتدق إلى أسفل العوامل المؤثرة يرجى الاطلاع Kasmapour وآخرون 18 أي العوامل التي يمكن أن تؤثر على البلعمة أو الظروف والتنقل من phagosomes و / أو المقصورات التي تتفاعل مع phagosomes النضج يمكن استخدامها. </li></ul>

<table><tbody><tr><td>النسور المعدلة من Dulbecco (D-MEM)</td> <td>PAA ، النمسا</td><td>E15-009</td><td></td></tr><tr><td>النسور المعدلة من Dulbecco بدون فينول أحمر (D-MEM)</td> <td>PAA ، النمسا</td><td>E15-047</td><td></td></tr><tr><td>مصل الأبقار الجنينية (FBS)</td> <td>PAA ، النمسا</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAA ، النمسا</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>PAA ، النمسا</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>البنسلين / الستربتومايسين</td><td>PAA ، النمسا</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>WillCo-dish &reg ؛ طبق زجاجي أسفل (35 مم فارغة ؛ # 1.5)</td> <td>WillCo Wells ، هولندا</td><td>GWSt-3522</td><td></td></tr><tr><td>CELLview TM طبق سفلي زجاجي ، 35 مم</td><td>Greiner Bio one ، ألمانيا</td><td>627871</td><td>البديل: متوفر على شكل</td></tr><tr><td>كريات مطاطية</td> مجزأة <td>Polysciences ، الولايات المتحدة الأمريكية</td> <td># 09850</td><td>متوفر بأقطار مختلفة ، استخدمنا 3 مو ؛ م</td></tr><tr><td>جسيمات البوليسترين الدقيقة</td><td>Kisker Biotech ، ألمانيا</td><td>PPs-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>ROTH ، ألمانيا</td><td>305.1.3</td><td></td></tr><tr><td>ماوس كامل IgG</td><td>Rockland ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>010-0102</td><td></td></tr><tr><td>EDAC crosslinker</td><td>Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>E6383-1g</td><td></td></tr><tr><td>10 ملي متر Tris</td><td>Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>حقنة 1 مل Omnifix -F</td><td>B.Braun, ألمانيا</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>26&nbsp; إبرة G (0.45 * 25 مم)</td> <td>B.Baun ، ألمانيا</td><td>4657683</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA ، النمسا</td><td>E15-039</td><td></td></tr><tr><td>مصل الحصان</td><td>Gibco ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>MES هيدرات</td><td>Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية</td><td>M2933</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & mu ؛ مرشح M مثبت على حقنة</td><td>سارتوريوس ، ألمانيا</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr></tbody></table>

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

الخلايا البلعمية تلعب دورا رئيسيا في نظام المناعة الفطرية عن طريق إزالة والقضاء على غزو الكائنات الحية الدقيقة في phagosomes بهم. يبلوع النضج هو عملية معقدة ومنظم بإحكام خلالها يبلوع الوليدة يخضع التحول جذرية من خلال التفاعلات مدبرة جيدا مع مختلف العضيات ومقصورات الخلوية في السيتوبلازم. هذه العملية، وهو أمر ضروري لوظيفة الفسيولوجية للخلايا البلعمية عن طريق تزويدها phagosomes مع ممتلكاتهم التحللي وجراثيم، ويتوج في انصهار phagosomes مع الجسيمات الحالة ونشوء حيوي من phagolysosomes الذي يعتبر المرحلة الأخيرة والحاسمة من النضج لphagosomes. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية القائمة على التحليل النوعي والكمي لعملية ديناميكية من يحلول ليبلوع تقديم المحتوى، والذي هو السمة المميزة ليحلول يبلوعي نشوء حيوي. يستخدم هذا النهج بلي مفتش المغلفة كنموذج لphagocytosis وfluorophore مترافق الجزيئات ديكستران باعتبارها اللمعية الليزوزومية التحقيق البضائع، من أجل متابعة تسليم ديناميكية من المحتويات lysosmal إلى phagosomes في الوقت الحقيقي في الضامة الحية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير والمسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. نحن هنا تصف بالتفصيل الخلفية، خطوات تحضير والإعداد خطوة بخطوة تجريبية لتمكين نشر سهلة ودقيقة لهذا الأسلوب في مختبرات أخرى. أسلوبنا وصف بسيط، قوية، والأهم من ذلك، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التفاعلات phagosomal والنضج في النظم المختلفة وتحت مختلف إعدادات التجريبية مثل استخدام مختلف أنواع الخلايا البلعمية، وفقدان وظيفة من التجارب، تحقيقات مختلفة، و جسيمات البلعمة.

يظهر إعداد الصحيح للخلايا والخرز لتصوير أمر بالغ الأهمية. الشكل 1 مخطط البذر، التحقيق التحميل والخطوات التصوير الأولي في هذا الأسلوب، استنادا لدينا بروتوكول الأمثل لBMMs. فمن الضروري إذن أن المعلمات بروتوكول يتم اختبارها والأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا وتحقيقات التي سيتم استخدامها. بعد إضافة حبات مفتش المغلفة للخلايا مسبقة، من المهم أن مجال الرؤية يتم اختيار بطريقة لتوفير أكبر عدد من الأحداث ا...

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

الهدف العام من التجربة التالية هو رصد العملية الديناميكية في الوقت الفعلي لنضج الجسيم البلعمي وتكوين الجسيم البلعمي الليزوزومي في الخلايا البلعمية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تحميل المقصورات الليزوزومية في الخلايا بسلاسل ديكستران مقترنة بفلوروفور لتمكين تصور المقصورات الليزوزومية وانتقال حمولتها اللمعية إلى الجسيمات البلعمية. وكخطوة ثانية، تُضاف جسيمات دقيقة تعمل كنموذج لعملية البلعمة.بعد ذلك، يتم تحليل وصول المواد الليزوزومية إلى الفجوات البلعمية باستخدام تصوير الخلايا الحية ومعالجة الصور الرقمية اللاحقة. ومن أجل قياس عملية نضج الفجوة البلعمية، تُظهر النتائج تأثير عوامل مختلفة على عملية نضج الفجوة البلعمية بناءً على وصول المحتوى الليزوزومي إلى الفجوات البلعمية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تقييم نضج الخلايا البلعمية في الخلايا المثبتة، في القراءة الكمية ذات الدقة الزمنية العالية. ابدأ بإذابة دكستران بوزن 70 kilodalton ووسوم Texas red (أو Dex 70 KD) في PBS بتركيز 20 mg/mL، واحفظ حصصاً منه في درجة حرارة -20 °C.بعد ذلك، قم بتخفيف المخزون من Dex 70 KD في وسط Docos الكامل لاستزراع الخلايا، أو وسط modified eagles medium، أو DMEM ليصل التركيز إلى حوالي 1 mg/mL تقريباً. قم بمعالجة الحصة المأخوذة من شريط DExT بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي 초음파 لمدة خمس دقائق. ثم قم بطرد المحلول مركزياً في جهاز طرد مركزي دقيق بأقصى سرعة لمدة خمس دقائق لإزالة أي تكتلات أو ملوثات من المحلول.انقل SuperAgent بعناية إلى أنبوب جديد مع تجنب ملامسة الراسب الموجود في القاع. ثم خفف المحلول للوصول إلى تركيز عمل نهائي قدره 20 micrograms per milliliter في وسط DMEM كامل للزراعة الخلوية ومرشح.قم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح مثبت على سرنجة بمسامية 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك، أضف 2 mL من البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر بتركيز 5 × 10⁴ خلية/mL. وفي طبق زجاجي القاع غير مطلي يحتوي على وسط DMEM، قم بحضن الخلايا لمدة 12 ساعة على الأقل عند 37 °C في جو منظم يحتوي على 5% carbon dioxide.لضمان الالتصاق والتأقلم بعد عملية الالتصاق، يتم سحب الوسط وإضافة 2 mL من وسط DMEM الخاص بخيوط DExT المدفأ مسبقاً إلى الطبق ذو القاعدة الزجاجية، ثم تُحضن الخلايا لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثماني ساعات بعد التحضين. تُغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام وسط DMEM كامل مدفأ مسبقاً. يتم سحب الوسط بعد الشطفة النهائية وإضافة 2 mL من وسط DMEM كامل.تُحضن الخلايا لمدة تتراوح من 4 إلى 12 ساعة. ثم تُغسل الخلايا بوسط DMEM كامل خالي من الفينول الأحمر ومسخن مسبقاً، ويُضاف 2 mL من وسط DMEM كامل مرشح وخالي من الفينول الأحمر قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء التصوير. بعد ذلك، تُترك كمية محددة من معلق حبيبات beet المغطاة بـ 1%IgG، والمجهزة كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق، لتصل إلى درجة حرارة الغرفة.قم بمعالجة المحلول بالموجات فوق الصوتية في حمام مائي من الموجات فوق الصوتية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، وتحت خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية، أضف من 1 إلى 6 µL من معلق الخرزات إلى الخلايا. قم بتشتيت السحابة الكثيفة من الخرزات باستخدام ماصة لخلط المعلق برفق في الطبق ذو القاعدة الزجاجية.بعد ذلك، ضع العينة تحت المجهر وقم بضبط التركيز على المنطقة المراد دراستها. وقبل البدء في التصوير بنظام الفاصل الزمني (time-lapse imaging)، قم بتحسين الإعدادات بما في ذلك المسح وسرعة التكبير والدقة، وذلك لتمكين التقاط إطار واحد كل 7 إلى 20 ثانية.قم بضبط إعدادات الإثارة والانبعاث بناءً على نظام التصوير والمجسات المستخدمة، وحسّن هذه الإعدادات لمنع حدوث تبييض ضوئي مفرط. بعد ذلك، قم بتصوير فيديو الفاصل الزمني وحفظه بتنسيق الملف الأصلي للمجهر الخاص بك. تجنب تصدير الفيديو بتنسيقات مضغوطة مثل JPG أو PNG.بعد ذلك، قم بتشغيل توزيعة Fiji و Image J التي تحتوي على حزمة لمعالجة الصور مع قوائم أدوات مُعاد تنظيمها وإضافات أصلية إضافية متاحة مجانًا.تنزيل. افتح الملف في Fiji وحدد الفيديو المراد تقييمه. ثم قم بضبط الخيارات والمرشحات ومعايير القياس كما هو مفصل في البروتوكول النصي المصاحب.بعد ذلك، قم بفحص الصور مع تحديد الإطار الذي تتشكل فيه جسيمة بلعمية من الخرزة الناشئة مكتملة التكوين، ويكون فيه الكأس الحمضي F مغلقاً. استخدم أداة التحديد البيضاوي (Oval selection tool) لتحديد منطقة اهتمام دائرية (ROI) على الخرزة المُمتصة داخلياً. تأكد من أن التحديد يتطابق بدقة مع الحافة الخارجية للخرزة.انتقل بعد ذلك إلى "analyze" وانقر على "measure" لتنفيذ عملية القياس. ستظهر النتيجة في نافذة منفصلة بعنوان "results". وفي الإطار التالي محل الاهتمام، قم بتعديل موضع ROI في حال تحركت الخرزة وكرر عملية القياس، والتي ستُضاف إلى القائمة في نافذة النتائج.يمكن تحديد كل إطار تم تحليله بناءً على القيمة الموجودة في عمود التسمية (label). بعد الانتهاء من قياس جميع الإطارات ذات الصلة، انسخ القيم من عمود الكثافة المتكاملة (int den) إلى تطبيق جداول بيانات. يوضح عمود int den شدة المنطقة المختارة.باستخدام هذه الطرق، تم التقاط صور واضحة للخلايا البلعمية المشتقة من نخاع العظم والتي تم تحميلها بمجسات خيط DExT. تعود هذه الصورة إلى الزمن صفر، وهو الوقت الذي أتمت فيه الخلية عملية امتصاص الخرزة المشفرة بـ IgG والمشار إليها هنا. الصور المعروضة هنا ملونة بألوان اصطناعية لتحسين الرؤية، وهي تصور الجسيم البلعمي من الدقيقة صفر وحتى 85 دقيقة بعد الامتصاص.تم تحديد منطقة الاهتمام (ROI) للفاجوسوم المقاس بخط متقطع، وتشير الأسهم إلى حالات توصيل وتراكم الديكستران داخل الفاجوسوم. بعد ذلك، تم إنشاء رسوم بيانية من هذه الصور تظهر اتجاهاً زمنياً واضحاً لارتباط الإشارة بالفاجوسوم بمرور الوقت. يمثل هذا الرسم البياني متوسط 10 فاجوسومات من الخليتين الموضحتين هنا.بينما تتباين شدة الإشارة المطلقة غالباً بين كل جسيم بلعمي يتم تحليله، إلا أن الاتجاه الزمني يكون عادةً متشابهاً جداً. عند إيصال Dex 70 KD إلى الجسيمات البلعمية، تم الوصول إلى مرحلة الثبات في غضون 35 إلى 40 دقيقة بعد عملية البلعمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم نضج الجسيم البلعمي باستخدام المجهر البؤري بفاصل زمني.

study-of-phagolysosome-biogenesis-in-live-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

يوضح هذا الفيديو تقنية الفحص المجهري الفلوري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) عالية الدقة للتصور في الوقت الفعلي لتكوين البلعمة وإغلاقه أثناء البلعمة بوساطة البلاعم لخلايا الدم الحمراء (RBCs) ذات القابلية IgG المرتبطة بسطح طبق زجاجي القاع. تمتد البلاعم الكاذبة حول كرات الدم الحمراء وتبتلعها داخل البلعمة ، وتفصلها عن السطح الزجاجي.

التصور القائم على الفحص المجهري TIRF لتشكيل البلعمة وإغلاقها

وصفنا طرق للفحص المجهري لقطات فيديو حية من...

الخلية الحية المجهرية فيديو البلعمة الممرض الفطرية

نصف إعدادا تجريبيا لتصور تكوين البلعمة عالية الدقة غير المسبوقة وإغلاقه في ثلاثة أبعاد في البلاعم الحية ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري الانعكاس الداخلي الكلي. يسمح بمراقبة قاعدة الكأس البلعمية ، والأرجل الكاذبة الممتدة ، بالإضافة إلى الموقع الدقيق لقص البلعمة.

&quot;يبلوع إغلاق الفحص&quot; لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

نصف طريقة لقياس سرعة تحرك البلعمة نحو مركز الخلية في الخلايا الحية المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) من النوع 1 أو بدونه ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للقرص الدوار لتحديد الخلايا المصابة بالفلورسنت والفحص المجهري للمجال الساطع للكشف عن البلعمة.

يبلوع الهجرة والسرعة تقاس في لايف الابتدائية الضامة الإنسان المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1

نصف هنا تقنية قائمة على المجهر لتصور وتحديد الشلالات المبكرة للأحداث أثناء البلعمة لمسببات الأمراض مثل الفطريات المبيضات البيضاء والجسيمات التي يزيد حجمها عن 0.5 ميكرومتر بما في ذلك الخرز الزيموزان والمغلفة ب IgG.

تصور المراحل المبكرة من البلعمة

نقدم أساليب لتقييم قدرة متجولة الضامة مورين الأولية المشتقة من نخاع العظم استخدام الحطام المسمى فلوريسسينتلي المايلين وتلطيخ الحبرية داخل الخلايا الدهنية.

في المختبر البلعمه حطام المايلين التي الضامة المشتقة من نخاع العظام

يصف لنا هنا طريقة بسيطة وسريعة لعزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة بطلاء البكتيريا مع البيوتين وستريبتافيدين.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

هنا يمكننا وصف أساليب استخدام الغزل القرص المجهري [كنفوكل] إلى أحداث متجولة واحد الصورة بالماوس الضامة البريتوني المقيم. ويمكن تمديد البروتوكولات إلى خلايا أخرى متجولة.

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

الآلية المرتبطة البلعمة في عدوى الليشمانيا لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. هنا ، نصف طرق لتقييم الأحداث المبكرة التي تحدث أثناء تفاعل الليشمانيا مع الخلايا المضيفة.

التحقيق في البلعمة من الليشمانيا باستخدام المجهر البؤري

توضح هذه الدراسة المعالجة البلعمية لجزيئات جودانتي باسما (GB) في خلايا الثدييات ، وتميز امتصاصها الخلوي ، وديناميكيات الفجوة ، والتحمض ، والتدهور. لا تعزز هذه النتائج فهمنا لآليات البلعمة الأساسية فحسب ، بل تؤسس أيضا GB كنظام نموذجي واعد لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

استكشاف الأحداث الخلوية المتسلسلة للبلعمة الناجمة عن Godanti Bhasma في خلايا الثدييات

اكتشف عملية نضج الجسيمات البلعمية في الخلايا البلعمية باستخدام التصوير الحي للخلايا والمعالجة الرقمية للصور. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الحويصلات الهضمية بدقة عالية.

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

استكشف المزيد من الفيديوهات