كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

الهدف العام من التجارب التالية هو إنتاج كميات بمقياس المليجرام من Miran Kinlin three في مزارع خلايا حشرية، والتي لا يمكن إنتاجها في مضيفات تعبير أخرى. ويتم تحقيق ذلك عن طريق COT transecting، ناقل نقل KINLIN three مع bao virus back mid مهندس وراثياً لإنشاء recombinant bao virus يحمل جين KINLIN three. وفي خطوة ثانية، يتم تضخيم الفيروس داخل الخلايا الحشرية لإنتاج كمية كافية من الفيريونات للخطوات المستقبلية.

بعد ذلك، يتم إصابة خلايا حشرية لإنتاج كميات كبيرة من بروتين Kinlin three لتمكيننا من تنقيته عبر الكروماتوغرافيا السائلة السريعة. وأظهرت النتائج أنه يمكن إنتاج بروتين kinlin three وظيفي وبدرجة نقاء عالية بكميات تقاس بالمليغرام، وذلك بناءً على تحليل SDS page وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تعبير kinlin three في البكتيريا، في أن التعبير في الخلايا الحشرية المصابة بفيروس baculovirus يزيد من إنتاج البروتين المؤتلف بمقدار عشرة أضعاف.

تُزرع خلايا SF nine لهذا الإجراء وتُحفظ في حالة تعليق باستخدام وسط SF 902 المكمل بـ 100 micrograms per milliliter من البنسلين و 100 micrograms per milliliter من الستريبتومايسين. ولإنتاج فيروس bao، يجب زراعة الخلايا حتى تصل كثافتها إلى نطاق يتراوح بين 5 × 10⁵ إلى 1 × 10⁶ خلية لكل milliliter. ولتحضير خلايا SF nine لعملية عفن الخلية (transfection)، يتم استزراع ما يقرب من 1 × 10⁶ خلية في كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة المعقمة ذات الستة آبار في 2 milliliters من وسط SF 902 المكمل بالبنسلين والستريبتومايسين، ثم تُترك خلايا SF nine لمدة 20 دقيقة تقريباً في درجة حرارة الغرفة داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood) لتلتصق بقاعدة الآبار البلاستيكية وبذلك تشكل طبقة أحادية. ويتم إنتاج فيروس balo المؤتلف عن طريق عفن الخلية المشترك (cotransecting) للحمض النووي البلازميدي (plasmid DNA) والحمض النووي BMid على مزرعة من الطبقة الأحادية لخلايا SF nine.

يحتوي ناقل التعبير papine neuron firm T three على جين KINLIN three الخاص بالفأر في صورته firm T three. ويخضع هذا الجين لتحكم المحفز الفيروسي P 10 BAO، كما يمتلك تسلسلات bao فيروسية محيطة للسماح بإعادة الاندماج مع الـ back mid، ويقوم بتشفير علامة hiss six عند الطرف الكربوكسيلي (C terminal) لأغراض التنقية اللاحقة. ولكل عملية ترانسفكشن، يتم تحضير من 1 إلى 2 ميكروغرام من MFI T three المنقى مع 0.5 ميكروغرام من B mid المنقى و 100 ميكرولتر من SF 902 SFM الخالي من المضادات الحيوية؛ ويمثل هذا المحلول A. وفي أنبوب منفصل، يتم تخفيف 6 ميكرولتر من cell effect in two reagent في 100 ميكرولتر من SF 902 SFM الخالي من المضادات الحيوية.

لكل تفاعل ترنسفكشن (transfection)، يمكن إعداد مزيج رئيسي هنا لتقليل عمليات مناولة السوائل في حال تطلب الأمر إجراء عمليات ترنسفكشن متعددة. هذا هو المحلول B. اخلط المحلولين A و B باستخدام 200 µL تقريباً من كل منهما لكل عملية ترنسفكشن، ويُحضن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتكوين معقدات الليبيد والحمض النووي (lipid DNA complexes). بعد مرور 20 دقيقة، خفف معقدات الليبيد والحمض النووي بإضافة 800 µL لكل عملية ترنسفكشن من وسط SF 902 SFM الخالي من المضادات الحيوية. بعد ذلك، اسحب بعناية وسط الطبقة الأحادية من خلايا SF9، ثم انقل بعناية باستخدام الماصة مزيج المحلول AB والوسط فوق الطبقة الأحادية من خلايا SF9.

حضّن الخلايا التي تم نقل الجينات إليها (transfected cells) في حاضنة رطبة عند 27 درجة مئوية طوال الليل، وذلك لتوفير بيئة رطبة تمنع جفاف الخلايا. ضع طبق الستة آبار داخل حاوية بلاستيكية ذات غطاء بجانب منشفة ورقية مبللة. وفي اليوم التالي، أضف 1 mL إضافي من SF 900 to SFM الخالي من المضادات الحيوية إلى كل مستنبت أحادي الطبقة (monolayer culture)، وحضّن الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة خمسة أيام أخرى.

بعد مرور خمسة أيام، يتم حصاد فيروس bao المؤتلف مباشرة من وسط الزرع ونقله إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. يتم تصفية أي بقايا من خلايا SF nine عن طريق الطرد المركزي عند 1000 Gs لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، يُنقل الفيروس الموجود في السائل الطافي الناتج، والذي يُرمز له بـ P1، إلى أنبوب نظيف. ويمكن افتراض أن جيل فيروس P1 لديه عيار فيروسي متوقع يبلغ 1×10⁷ PFU/mL.

على الرغم من إمكانية إجراء تحليل البقع (plaque SA) عند الحاجة، إلا أنه يجب تخزين المخزون الفيروسي P one في درجة حرارة أربع درجات Celsius في الظلام حتى وقت الاستخدام. يجب أن تكون خلايا SF nine المستخدمة لتضخيم فيروس balo المؤتلف في المعلق بكثافة 1.4 × 10⁶ خلية/ml، ويجب أن يشغل المزرعة جزءاً واحداً من 20 من إجمالي حجم الدورق؛ على سبيل المثال، 50 ml في دورق سعة لترين. وبشكل عام، ولتحقيق التضخيم الأمثل لفيروس vao وإنتاج البروتين، يجب أن تكون خلايا SF nine متجانسة في الحجم وكروية الشكل.

قم بإصابة مستنبت خلايا SF nine بمخزون الفيروس P one بتعدد عدوى (multiplicity of infection) أو MOI قدره 0.1 باستخدام الصيغة التالية. حضّن مستنبت الحشرة المصاب بـ P one عند درجة حرارة 27 °C مع الرج بسرعة 100 RPM لمدة 72 ساعة. وبعد ثلاثة أيام، قم بحصاد الفيروس عن طريق فصل الخلايا عن الوسط باستخدام الطرد المركزي بسرعة 1000 Gs لمدة خمس دقائق.

عند درجة حرارة الغرفة، انقل الوسط المخصب للفيروس المصفى إلى أنبوب نظيف. يُرمز لهذا المخزون الفيروسي بالرمز P two، وعيار الفيروس المتوقع هو 2 × 10⁸ PFU/ml. احفظ هذا المخزون الفيروسي عند درجة حرارة 4 °C في الظلام حتى وقت الاستخدام، واحتفظ بكريات الخلايا الناتجة عند درجة حرارة -20 °C للتأكيد اللاحق على إنتاج الفيروس المؤتلف.

لبدء هذا الإجراء، قم بزراعة حجم كافٍ من مستنبتات خلايا SF nine في معلق SF 902 s fm، مضافاً إليها 100 micrograms per milliliter من البنسلين و 100 micrograms per milliliter من الستريبتومايسين. يجب أن تكون نسبة إجمالي حجم المزرعة إلى حجم الدورق هي 1:5.

حضّن مزارع التعليق عند 27 درجة مئوية مع الرج بسرعة 100 RPM حتى تصل كثافة الخلايا إلى 2 × 10⁶ خلية/مل. عندما تصل مزارع SF9 إلى كثافة 2 × 10⁶ خلية/مل، تصبح جاهزة للإصابة بفيروس balo. أضف إلى المزارع مصل جنين البقر بتركيز نهائي قدره 1%، يليه المخزون الفيروسي P2.

للحصول على تعددية عدوى (MOI) تبلغ 1، يتم تحضين المزارع المصابة عند 27 درجة مئوية مع الرج بسرعة 100 RPM. بعد 72 ساعة من العدوى، يتم حصاد خلايا SF nine التي تعبر عن البروتين lin-3 المؤشب بمتعدد الهيستيدين عن طريق الطرد المركزي عند 1000 GS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تُخزن كتلة الخلايا الناتجة عند -20 درجة مئوية حتى وقت الاستخدام أو عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأمد. تبدأ هذه العملية بالإذابة على الثلج.

يتم إعادة تعليق الكريات المجمدة من خلايا SF nine المصابة بفيروس vao والمعبرة عن بروتين kinlin three المأشوب باستخدام محلول التحلل. وبعد تحضين الخلايا المعاد تعليقها في محلول التحلل لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق، يتم استخدام جهاز الرج (vortex) حتى يتم الحصول على معلق متجانس من أجل مزيد من تكسير الخلايا. ثم تُعرّض العينة للموجات فوق الصوتية (sonication) في حمام ثلجي.

قم بتصفية الراشح عن طريق الطرد المركزي عند 48, 000 GS لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. قم بتحميل الرائق الناتج على عمود hist trap بحجم خمسة ملليلتر، تمت موازنته مسبقاً باستخدام محلول التحلل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، وبمعدل تدفق قدره واحد ملليلتر في الدقيقة. لن يتم عرض الخطوات اللاحقة الخاصة بشطف البروتين وتبادل المحلول المنظم وتركيز البروتين هنا، ولكنها مفصلة في المخطوطة المرفقة.

بمجرد الحصول على محلول البروتين بعد تبديل المنظم، يتم تحميله على عمود HiTrap Heparin HP بحجم 5 mL سبق موازنته، باستخدام جهاز ACTA FPLC وبمعدل تدفق قدره 0.5 mL/min. يتم شطف بروتين KINLIN 3 المرتبط باستخدام تدرج خطي من كلوريد الصوديوم في المنظم نفسه، بحيث يزداد بمعدل 10 mM/mL للوسوم الهيستيدينية المؤتلفة. ومن المتوقع أن يتم استخلاص KINLIN 3 عند تركيز 0.6 M تقريبًا من كلوريد الصوديوم. بعد تركيز البروتين، تتمثل الخطوة النهائية في تبديل المنظم باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم؛ حيث يتم تحميل البروتين المنقى على عمود Superdex 200 10/300 GL، وتنقى البروتينات وفقًا للحجم عن طريق تمرير المنظم عبر العمود بمعدل 0.5 mL/min.

يتم تجزئة البروتين المستخلص من العمود ومراقبته باستخدام الامتصاص عند 280 نانومتر. وقد تم التحقق من نجاح توليد الفيروسات المعاد تركيبها من خلال تقييم وجود Kinlin 3 المعاد تركيبه في خلايا SF nine التي تم نقل الجينات إليها (transfected) بواسطة SDS page وتحليل Western، كما يظهر في تحليل Western الممثل لست مزارع صغيرة من خلايا SF nine باستخدام جسم مضاد anti hiss six. حيث ظهر نطاق واضح يتوافق مع بروتين hiss tagged بكتلة 75 كيلو دالتون في كل عينة بمجرد تضخيم الفيروس واستخدامه لإصابة خلايا SF nine في تجارب واسعة النطاق. تم تنقية KINLIN 3 المعاد تركيبه جزئيًا باستخدام كروماطوغرافيا الألفة للمعدن المثبت (immobilized metal affinity chromatography).

تُظهر صورة الهلام (gel) الرئيسية في هذا الشكل تحليل SDS page لبروتين kinlin three الفأري المؤتلف المنقى بواسطة ألفة النيكل، والذي تم التعبير عنه في خلايا SF nine المصابة بفيروس BAO. تم استرداد البروتين الممتز باستخدام تدرج إ出した (elution gradient) الموضح فوق صورة الهلام. يشير MW إلى علامة الوزن الجزيئي، وLYS إلى مستخلص الخلايا الكامل، وFT إلى تدفق المرور، وWI إلى الغسلة الأولى، وWII إلى الغسلة الثانية. كما تم إجراء تحليل Western blot باستخدام كسور الاسترداد لتأكيد وجود علامة his المهندسة على البروتين المؤتلف.

بعد ذلك، تم تنقية بروتين KINLIN three المنقى جزئياً بشكل أكبر للوصول إلى درجة نقاء تقارب التجانس عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني باستخدام عمود هيبارين. يوضح هذا اللوح ملف الشطف الملحوظ عند 280 nanometers باللون الأزرق، والذي يظهر قمة واحدة متماثلة تخرج تحت تدرج خطي من كلوريد الصوديوم مشار إليه باللون الأخضر، باستخدام نطاق تركيز لكلوريد الصوديوم من 0.05 molar إلى 1.0 molar. ويوضح اللوح السفلي نتائج تحليل SDS page لكسور الشطف، مما يثبت وجود بروتين Kinlin three بوزن 75 kilodalton.

كخطوة أخيرة، تم تنقية KINLIN three بشكل دقيق باستخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي لإزالة التجمعات وتحقيق التجانس. يمثل ملف شطف ترشيح الهلام هذا بروتين Kinlin three المنقى باستخدام SUEx S 200 في محلول Tris HCL بـ pH 7.5 و 150 millimolar من كلوريد الصوديوم و one millimolar من DTT عند 20 degrees Celsius. وبناءً على حجم الشطف، يهاجر KINLIN three كما هو متوقع لبروتين بحجم 75 kilodalton، مما يشير إلى أنه يتواجد بشكل أساسي في صورة أحادية (monomeric).

يوضح الشكل التالي نتائج الفصل الكهربائي باستخدام SDS-PAGE لبروتين kinlin three المؤتلف والمنقى بتركيز عالٍ، والمشار إليه بالرمز K3، بتركيز 14.5 mg/mL. سيتيح إنتاج كميات بالمليجرام من بروتين kinlin three الكامل والمنقى بدرجة عالية من الفئران باستخدام زراعة خلايا الحشرات إجراء دراسات هيكلية مكثفة وتحليلات كيميائية حيوية للبروتين. كما أُجري في هذه الدراسة اختبار إزاحة حرارية (thermo shift assay) يعتمد على جهاز thermo floor لتحديد أي المحاليل المنظمة كانت أكثر استقراراً لبروتين KINLIN three.

تم تخفيف البروتين KINLIN three في محاليل منظمة مختلفة، بما يشمل مسحاً ثنائي الأبعاد لدرجات pH مقابل تركيز كلوريد الصوديوم. يمثل اللوح العلوي مخططاً بيانياً ثلاثي الأبعاد لدرجات حرارة الانتقال، بينما يوضح اللوح السفلي التغير في درجة حرارة الانتقال مقارنة بالمتوسط المحسوب البالغ 50.4 °C. تم تلوين الأعمدة وفقاً لنطاق درجات الحرارة التي تقابلها.

لُوحظ أن KINLIN three كان مستقراً عند تركيزات عالية من كلوريد الصوديوم ضمن نطاق PA من 7.0 إلى 9.0 مع درجة حرارة انتقال ثابتة تبلغ 55 درجة مئوية. كما لُوحظ أن درجة حرارة انتقال Kinlin three كانت حوالي 55 درجة مئوية ضمن نطاق PA من 7.0 إلى 7.5، وذلك بغض النظر عن تركيز كلوريد الصوديوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج بروتين ريكومبينانت وظيفي عالي النقاوة، وذلك من أجل التوصيف البيوفيزيائي المتعمق ومزيد من الاستقصاء. يمكن استخدام مناهج مماثلة مع عينات بروتينية أخرى يصعب تحضيرها، ونوصي بتطبيقها في مثل هذه الحالات.