كفاءة الإنتاج وتنقية المؤتلف الفئران Kindlin-3 من خلايا الحشرات للدراسات البيوفيزيائية

Kindlins أساسية لالتصاق الخلية من خلال لل integrins ولكن تعرقلت الدراسات منهم من الصعوبة التي واجهتها في التعبير عنها في recombinantly المضيفين البكتيرية. نحن هنا وصف الطرق لكفاءة الإنتاج في خلايا الحشرات المصابة الفيروسة العصوية.

الهدف العام من التجارب التالية هو إنتاج كميات مليغرام من ميران كينلين ثلاثة وثقافة خلايا الحشرات بكفاءة ، والتي لا يمكن إنتاجها في مضيفات التعبير الأخرى. يتم تحقيق ذلك عن طريق COT transecting ، وهو ناقل نقل ثلاثي KINLIN جنبا إلى جنب مع فيروس باو مصمم هندسيا في المنتصف لإنشاء فيروس باو مؤتلف يحمل جين KINLIN الثلاثة. كخطوة ثانية ، يتم تضخيم الفيروس داخل خلايا الحشرات لإنتاج كمية كافية من الفيروسات للخطوات المستقبلية.

بعد ذلك ، تصاب خلايا الحشرات لإنتاج كميات كبيرة من بروتين كينلين الثلاثة للسماح لنا بالتنقية عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة السريعة. تم الحصول على النتائج التي تظهر أن كينلين الوظيفي الثالث ذو النقاء العالي يمكن إنتاجه بكميات مليغرام بناء على تحليل صفحة SDS وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل إشعال ثلاثة تعبيرات في البكتيريا هي أن التعبير عن خلايا الحشرات المصابة بالفيروس البقعي يزيد من إنتاج البروتين المؤتلف بمقدار عشرة أضعاف.

يتم زراعة خلايا SF التسع لهذا الإجراء والحفاظ عليها في حالة تعليق باستخدام وسائط SF 902 المكملة ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر من البنسلين و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. لتوليد فيروس باو ، يجب زراعة الخلايا إلى نطاق كثافة من خمسة في 10 إلى خمسة إلى واحد في 10 إلى ست خلايا لكل مليلتر. لتحضير الخلايا التسع SF للتعداء ، انظر ما يقرب من 10 إلى الخلايا الست لكل بئر من لوحة زراعة أنسجة معقمة من ستة آبار في ملليلترين من وسائط SF 902 المكملة بالبنسلين والستربتومايسين ، اترك الخلايا التسع SF لمدة 20 دقيقة تقريبا في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان للالتصاق بقاعدة الآبار البلاستيكية وبالتالي تشكيل أحادي الطبقة يتم تحقيق توليد فيروس بالو المؤتلف عن طريق سرير الأطفال ، بلازميد الحمض النووي والحمض النووي BMid على ثقافة SF تسعة أحادية الطبقة.

ناقل التعبير الخلية العصبية البابين شركة T ثلاثة لديه الفأر KINLIN ثلاثة شركة الجينات T ثلاثة. تحت سيطرة P 10 ، يمتلك المروج الفيروسي BAO تسلسلات فيروسية مرافقة للسماح بإعادة التركيب مع المنتصف الخلفي ويشفر علامة C الطرفية السادسة لتنقية المصب لكل تعداء يجعل من ميكروغرام إلى ميكروغرام من MFI T المنقى ثلاثة مع 0.5 ميكروغرام من B المنقى الأوسط و 100 ميكرولتر من SF 902 SFM بدون مضادات حيوية. هذا هو الحل أ في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف ستة ميكرولترات من تأثير الخلية في كاشفين مع 100 ميكرولتر من SF 902 SFM بدون مضادات حيوية.

لكل تفاعل تعداء ، يمكن إنشاء مزيج رئيسي هنا لتقليل معالجة السوائل إذا كانت هناك حاجة إلى العديد من الشفافية. هذا هو الحل B.امزج المحاللين A و B باستخدام ما يقرب من 200 ميكرولتر من كل تعداء ودرجة حرارة الغرفة المحتضنة لمدة 20 دقيقة لتشكيل مجمعات الحمض النووي الدهني بعد 20 دقيقة ، وتخفيف مجمعات الحمض النووي الدهنية ب 800 ميكرولتر لكل تعداء SF 902 SFM بدون مضادات حيوية. بعد ذلك، قم بسحب الوسائط أحادية الطبقة المكونة من تسعة خلايا SF بعناية وقم بسحب ماصات محلول AB وخليط الوسائط بعناية أعلى الطبقة الأحادية التسعة SF.

احتضان الخلايا المنقولة في حاضنة مرطبة عند 27 درجة مئوية طوال الليل من أجل خلق بيئة رطبة لمنع الخلايا من الجفاف. ضع طبق الآبار الستة في وعاء بلاستيكي مضاء بجانب منشفة ورقية مبللة. في اليوم التالي ، أضف ملليلترا إضافيا من SF 900 إلى SFM بدون مضادات حيوية إلى كل ثقافة أحادية الطبقة ، احتضن الخلايا عند 27 درجة مئوية لمدة خمسة أيام أخرى.

بعد خمسة أيام ، احصد فيروس باو المؤتلف مباشرة من وسط الاستزراع وانقله إلى أنبوب طرد مركزي نظيف. قم بتوضيح أي حطام من الخلايا التسعة SF عن طريق الطرد المركزي عند 1000 Gs لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، يمكن افتراض نقل الفيروس ، الذي يوجد في الأسماء الفائقة الناتجة ويشار إليه باسم P واحد إلى أنبوب نظيف P ، أن يكون له عيار فيروسي متوقع من واحد في 10 إلى سبعة PFU لكل مليلتر.

على الرغم من أنه يمكن إجراء لوحة SA إذا لزم الأمر ، قم بتخزين مخزون الفيروس P one عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى يتم استخدام الخلايا التسع SF المستخدمة لتضخيم فيروس البالو المؤتلف في المعلق يجب أن تكون بكثافة 1.4 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر ويجب أن تشغل الثقافة واحدا من 20 من إجمالي حجم القارورة. على سبيل المثال ، 50 مل في قارورة سعة لترين. بشكل عام من أجل التضخيم الأمثل لفيروس vao وإنتاج البروتين ، يجب أن تكون خلية SF التسعة موحدة في الحجم وكروية.

قم بإصابة مزرعة الخلايا التسعة SF بمخزون فيروسي P واحد في تعدد العدوى أو وزارة الداخلية 0.1 باستخدام الصيغة التالية. احتضان استزراع الحشرات المصابة P one عند 27 درجة مئوية مع الرج عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة. بعد ثلاثة أيام ، حصاد الفيروس عن طريق فصل الخلايا عن الوسائط عن طريق الطرد المركزي عند 1000 Gs لمدة خمس دقائق.

عند نقل درجة حرارة الغرفة ، قام الفيروس المصفى بإثراء الوسائط إلى أنبوب نظيف. يشار إلى هذا المخزون الفيروسي على أنه P اثنين والعيار الفيروسي المتوقع هو اثنين في 10 إلى ثمانية PFU لكل مليلتر. قم بتخزين هذا المخزون الفيروسي عند أربع درجات مئوية في الظلام حتى الاستخدام ، واحتفظ بحبيبات الخلية الناتجة عند سالب 20 درجة مئوية للتأكيد لاحقا على إنتاج الفيروس المؤتلف.

لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة حجم كاف من تسعة مزارع خلايا SF في التعليق و SF 902 s fm. مكمل ب 100 ميكروغرام لكل مليلتر بنسلين و 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتومايسين. يجب أن تكون نسبة إجمالي حجم الثقافة إلى حجم القارورة واحدا إلى خمسة.

احتضان مزارع التعليق عند 27 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى كثافة خلية مرتين في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. عندما تكون ثقافات SF التسع بكثافة مرتين في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر ، فإنها تكون جاهزة للإصابة بفيروس البالو. استكمل المزارع بتركيز نهائي من مصل الأبقار الجنينية 1٪ متبوعا بمخزون فيروسي P two.

لإعطاء وزارة الداخلية لاحتضان الثقافات المصابة عند 27 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 100 دورة في الدقيقة بعد 72 ساعة من الإصابة ، حصاد بولي هيستامين مؤتلف الموسومة بثلاثة تعبر عن تسعة خلايا SF عن طريق الطرد المركزي عند 1000 GS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتخزين حبيبات الخلية الناتجة عند سالب 20 درجة مئوية حتى الاستخدام أو عند سالب 80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. يبدأ هذا الإجراء بالذوبان على الجليد.

أصابت الكريات المجمدة لفيروس vao SF تسعة معبرة عن كينلين المؤتلف ثلاثة و Resus يعلق الكريات مع مخزن التحلل. بعد احتضان الخلايا المعلقة مع المخزن المؤقت للتحلل لمدة خمس إلى 10 دقائق ، قم بالدوامة حتى يتم تحقيق تعليق تجانس متجانس لمزيد من اضطراب الخلية. صوتنة العينة في حمام جليدي.

قم بتوضيح المحللة عن طريق الطرد المركزي عند 48،000 GS لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. قم بتحميل الأسماء الفائقة الناتجة على عمود مصيدة hist بحجم خمسة ملليلتر متوازن مسبقا مع مخزن مؤقت للتحلل عند أربع درجات مئوية بمعدل مليلتر واحد في الدقيقة. لن يتم توضيح الخطوات اللاحقة لشطف البروتين والتبادل المؤقت وتركيز البروتين هنا ولكن تم تفصيلها في المخطوطة المصاحبة.

بمجرد الحصول على محلول بروتين التبادل العازل ، قم بتطبيقه على حجم متوازن مسبقا بحجم خمسة ملليلتر ، عمود هيبارين عالي المصيدة باستخدام ACTA FPLC بمعدل 0.5 مل في الدقيقة. يتم التلميح إلى KINLIN الثلاثة المرتبط باستخدام تدرج كلوريد الصوديوم الخطي في نفس المخزن المؤقت الذي يزيد بمعدل 10 ملليمولار لكل مليلتر من علامات الهيستامين المؤتلفة. من المتوقع أن يتخلص KINLIN three عند حوالي 0.6 مولار كلوريد الصوديوم بعد تركيز البروتين ، والخطوة الأخيرة هي تبادل البروتين باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، وتطبيق البروتين المنقى على عمود SUEx S 210 30 ، وتنقية البروتينات وفقا للحجم عن طريق تطبيق المخزن المؤقت على العمود بمعدل 0.5 مل في الدقيقة.

يتم تجزئة البروتين الذي يلمح من العمود ومراقبته باستخدام المادة الماصة عند 280 نانومتر. تم التحقق من نجاح توليد الفيروس المؤتلف من خلال تقييم وجود خلايا Kinlin المؤتلفة ثلاثة و COT TRANSFECTED SF تسع خلايا بواسطة صفحة SDS والتحليل الغربي كما هو موضح في هذا الدم الغربي التمثيلي لستة ثقافات SF صغيرة الحجم باستخدام جسم مضاد مضاد للهسهسة ستة ، كان هناك شريط واضح يتوافق مع 75 كيلودالتون كان البروتين الموسوم بهسهسة مرئيا في كل عينة بمجرد تضخيم الفيروس واستخدامه للإصابة SF تسع خلايا في تجارب واسعة النطاق. تم تنقية KINLIN الثلاثة المؤتلف جزئيا بواسطة كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة.

تظهر صورة الهلام الرئيسية في هذا الشكل صفحة SDS لتقارب النيكل ، كينلين الفئران المؤتلف المنقى ، ثلاثة معبرا عنها في بروتين SF المصاب بفيروس BAO ، تم التلميح إلى البروتين الممتص بتسع خلايا باستخدام تدرج أولي موضح فوق صورة الجل. يشير MW إلى علامة الوزن الجزيئي LYS هي محللة الخلية بأكملها FT هي التدفق عبر WI هو غسل واحد و WII هو غسل اثنين. تم إجراء تحليل اللطخة الغربية أيضا باستخدام كسور الشطف لتأكيد وجود علامته المهندسة على البروتين المؤتلف.

بعد ذلك ، تم تنقية KINLIN Three المنقاة جزئيا إلى ما يقرب من التجانس عن طريق كروماتوغرافيا التبادل الأيوني باستخدام عمود الهيبارين. تظهر هذه اللوحة المظهر الجانبي الإلوسياني الذي لوحظ عند 280 نانومتر باللون الأزرق ، وتعرض ذروة متناظرة واحدة تراوغ تحت تدرج كلوريد الصوديوم الخطي الموضح باللون الأخضر ، باستخدام نطاق تركيز كلوريد الصوديوم من 0.05 مولار إلى 1.0 مولار. تظهر اللوحة السفلية نتائج تحليل صفحة SDS للشطف المجزأ الذي يوضح وجود بروتين 75 كيلودالتون Kinlin ثلاثة.

كخطوة أخيرة ، تم صقل KINLIN ثلاثة نقاء بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم لإزالة الركام وتحقيق التجانس. هذا الملف الشخصي التمثيلي للترشيح الهلامي هو من Kinlin ثلاثة المنقى باستخدام SUEx S 200 في Tris HCL ، ودرجة الحموضة 7.5 ، و 150 ملليمولار ، وكلوريد الصوديوم ، و 150 ملليمولار DTT عند 20 درجة مئوية. بناء على حجم الشطف ، يهاجر KINLIN three كما هو متوقع لبروتين 75 كيلودالتون مما يشير إلى أنه في الغالب أحادي.

يوضح هذا الشكل التالي نتائج من صفحة SDS من كينلين مؤتلف منقى عالي التركيز ، ثلاثة تسمى K ثلاثة بمعدل 14.5 ملليغرام لكل مليلتر. سيسمح إنتاج كميات مليغرام من كينلين الفأر عالي النقاء وثلاثة وثقافة خلايا الحشرات بإجراء دراسات هيكلية مكثفة وتحليل كيميائي حيوي للبروتين. كما تم إجراء مقايسة التحول الحراري القائم على الأرضية الحرارية في هذه الدراسة لتحديد المخازن المؤقتة التي كانت تستقر ل KINLIN ثلاثة.

KINLIN ثلاثة تم تخفيفه في مخازن مؤقتة مختلفة ، تتألف من شاشة ثنائية الأبعاد لتركيز الأس الهيدروجيني مقابل تركيز كلوريد الصوديوم. اللوحة العلوية عبارة عن رسم بياني ثلاثي الأبعاد لدرجات الحرارة الانتقالية وتظهر اللوحة السفلية التغير في درجة حرارة الانتقال من المتوسط المحسوب البالغ 50.4 درجة مئوية. يتم تلوين القضبان وفقا لنطاق درجات الحرارة التي تتوافق معها.

لوحظ أن KINLIN three مستقر عند تركيزات عالية من كلوريد الصوديوم ضمن نطاق PA من 7.0 إلى 9.0 مع درجة حرارة انتقال ثابتة تبلغ 55 درجة مئوية. ولوحظ أيضا أن درجة الحرارة الانتقالية لكينلين ثلاثة كانت حوالي 55 درجة مئوية ضمن نطاق PA من 7.0 إلى 7.5. بغض النظر عن تركيز كلوريد الصوديوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنتاج إشعال مؤتلف وظيفي عالي النقاء. ثلاثة للتوصيف الفيزيائي الحيوي المتعمق ومزيد من التحقيق. يمكن استخدام طرق مماثلة مع عينات البروتين الأخرى التي يصعب تحضيرها ، ونوصي بتطبيقها في مثل هذه الحالات.