Name: المحفظة المصلي من العقدية الرئوية باستخدام تفاعل الانتباج (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T15:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: اكتشف طريقة تفاعل الانتباج لتحديد الأنماط المصلية لبكتيريا Streptococcus pneumoniae باستخدام المجهر ذي التباين الطوري. هذه التقنية الذهبية تساعد الباحثين في دراسة وبائيات المكورات الرئوية بدقة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بيل وميليندا غيتس (مشروع PneuCarriage، منحة 52099) وبرنامج دعم البنية التحتية التشغيلية للحكومة فيكتوريا. بفضل ايلين دان، جانيت ستراكان، وكيم هير لقراءة نقدية للمخطوطة.

1. إعداد تعليق خلية لكتابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام العقيمة المتاح 1 ميكرولتر حلقة، واتخاذ الاجتياح صغيرة من ليلة وضحاها ثقافة نقية جديدة من المكورات الرئوية نمت على أجار الصلبة غير انتقائية الحصان الدم وتطعيم 100 ميكرولتر القلب ضخ (مرحبا) مرق. يجب أن يظهر التعليق أن يكون مجرد عكر واضح. تستنهض الهمم بلطف أنبوب ليستحلب. ملاحظة: وسائل الإعلام الأخرى مثل الدماغ القلب تسريب مرق قد تكون أيضا مناسبة. بالإضافة إلى ذلك المصل (مثل تركيز النهائي من 10٪ (V / V) مصل الحصان) والحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة قبل الاستخدام يمكن استخدامها لتعزيز التفاعل. </li></ol> 2. فحص كثافة تعليق خلية كما ستستخدم تعليق خلية أعدت في الخطوة 1.1 مثل مراقبة سلبية، وينبغي التحقق من كثافة الخلية قبل إضافة الأمصال الكتابة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حلقة 1 ميكرولتر، ونقل قطرة من اللقاح أعدت في الخطوة 1.1 في الصعود إلى غلاسق المجهر الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من ملقط، ضع ساترة دائرية صغيرة على تعليق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام إعداد المرحلة على النقيض، ومراقبة إعداد المجهر تحت التكبير 400X، للتحقق من كثافة تعليق (الشكل 1A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان اللقاح هو ثقيل جدا (الشكل 2A)، إضافة المزيد من المرق إلى تعليق خلية في الخطوة 1.1 لتخفيف ذلك. المزيج بلطف مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان اللقاح خفيفة جدا، على سبيل المثال، هناك &lt;50 الخلايا المرئية في مجال المجهرية (الشكل 2B)، إضافة المزيد من البكتيريا في إعداد تعليق خلية في الخطوة 1.1 والمزيج بلطف. ملاحظة: مع الخبرة، وكثافة تعليق الخلية يمكن الحكم عن طريق هز وعقد يصل إلى الضوء، حيث يجب أن تظهر ليكون مجرد عكر واضح. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 2،1-2،3 حتى عدد مناسب من الخلايا واضحة في مجال المجهرية. ملاحظة: الشرائح الزجاج وcoverslIPS تشكل خطرا الحادة. بعد الاستخدام، والملوثة الشرائح وcoverslips مع المواد المعدية ويجب التخلص في وعاء واقية الحادة. </li></ol> 3. الكتابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ~ 1 ميكرولتر من اللقاح استعداد (على سبيل المثال باستخدام 1 ميكرولتر حلقة) على شريحة المجهر والزجاج. تجاهل حلقة في وعاء واقية الحادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة حجم مساو (1 ميكرولتر ملء غانة) من درجة حرارة الغرفة مصل على الشريحة وتخلط جيدا مع كل من قطرات الحلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من ملقط، ضع ساترة دائرية صغيرة على التعليق، مع الحرص على عدم لمس قطرة. وضع ساترة على تعليق على الفور بعد إضافة أمصال مضادة لمنع السوائل على الشريحة من الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام المجهر، ومراقبة وقف في إطار المرحلة على النقيض مع 400X التكبير. ويلاحظ وجود رد فعل سلبي عندما الانتباج ضئيلة أو معدومة &quot;تورم&quot; من الخلايا الرئوية يمكن أن ينظر إليه في 400X التكبير، على غرار ما لوحظ في تعليق خلية المكورات الرئوية مع عدم وجود أمصال مضادة المضافة (مراقبة سلبية). ويلاحظ وجود رد فعل الانتباج إيجابية عندما تظهر خلايا الموسع أو &quot;منتفخة&quot; وأكثر وضوحا بالمقارنة مع الخلايا في السيطرة السلبية. ملاحظة: ينبغي التحقيق في التفاعلات ملتبسة أخرى، على سبيل المثال من خلال دراسة رد فعل بعد 5-10 دقيقة الحضانة في درجة حرارة الغرفة، أو بتكرار تفاعل مع أكثر مصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء الاختبار المصلي المكورات الرئوية مع المتعاقبة حمامات أمصال مضادة الفردية حتى لوحظ من ردود الفعل الإيجابية. بدلا من ذلك، وحمامات يمكن تطبيقها في &#39;جولات&#39; تبعا الإصابة المحلية من الأنماط المصلية. ملاحظة: اختبار في &quot;جولات&quot; يضمن أن تحتوي على حمامات الأجسام المضادة إلى الأنماط المصلية الأكثر شيوعا هي أول اختبار، والتقليل من الجهد والتكلفة. اختبار المتزامن لعدة برك يوفر أيضا ضوابط سلبية إضافية، والتي يمكن أن تكون مفيدة في interpretation. إذا كان كل برك في &#39;جولة&#39; خاصة سلبية، اختبار عزل مع الجولات اللاحقة من برك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار عزل باستخدام النوع المناسب أو مجموعة مصل الواردة في المسبح رد الفعل. عند الاقتضاء، استخدام عامل أمصال مضادة لمزيد من التفريق بين المصلي. ملاحظة: يتم استخدام مفاتيح لأمصال مضادة للمكورات الرئوية الموردة من قبل الشركة المصنعة في اختيار المناسبة للسباحة، نوع أو جماعة أو عامل أمصال مضادة وتفسير النتائج (بما في ذلك أي ردود فعل عبر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تم الحصول على نتائج سلبية مع جميع حمامات، اختبار عزل مع Omniserum كاشف (يحتوي على أجسام مضادة ضد الأنماط المصلية 91 21). إذا كان لا يزال لم يلاحظ رد فعل الانتباج إيجابية عند اختبار عزل المكورات الرئوية مع كاشف Omniserum، وهذا قد يكون بسبب عزل يعبر عن كبسولة ضئيلة أو معدومة، أو أن الأجسام المضادة ضد المصلي غير الممثلة في Omniserum. ويمكن أن تشمل هذه الفئة الأخيرة الأنماط المصلية الجديدة. </li> &lt;/ رأ&gt;

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4, 144-154 (2004).</li>
<li>Henrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+newly+recognized+types+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Six newly recognized types of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2759-2762 (1995).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical%2C+genetic%2C+and+serological+characterization+of+two+capsule+subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+strains%3A+discovery+of+a+new+pneumococcal+serotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biochemical, genetic, and serological characterization of two capsule subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 strains: discovery of a new pneumococcal serotype.</a> J. Biol. Chem. 287, 27885-27894 (2012).</li>
<li>Hausdorff, W. P., Bryant, J., Paradiso, P. R., Siber, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+pneumococcal+serogroups+cause+the+most+invasive+disease%3A+implications+for+conjugate+vaccine+formulation+and+use%2C+part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Which pneumococcal serogroups cause the most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use, part I.</a> Clin. Infect. Dis. 30, 100-121 (2000).</li>
<li>Johnson, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+serotypes+causing+invasive+pneumococcal+disease+among+children+under+five%3A+the+pneumococcal+global+serotype+project%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of serotypes causing invasive pneumococcal disease among children under five: the pneumococcal global serotype project.</a> PLoS Med. 8, (2010).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378, 1962-1973 (2011).</li>
<li>Obaro, S. K., Adegbola, R. A., Banya, W. A., Greenwood, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carriage+of+pneumococci+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Carriage of pneumococci after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 348, 271-272 (1996).</li>
<li>Mulholland, K., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 379, 1388-1389 (2012).</li>
<li>Austrian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quellung+reaction%2C+a+neglected+microbiologic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Mt.+Sinai.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">The quellung reaction, a neglected microbiologic technique.</a> Mt. Sinai. J. Med. 43, 699-709 (1976).</li>
<li>Konradsen, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+serotyping+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Validation of serotyping of Streptococcus pneumoniae in Europe.</a> Vaccine. 23, 1368-1373 (2005).</li>
<li>Lovgren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+international+external+quality+assurance+model+to+support+laboratory+investigation+of+Streptococcus+pneumoniae%2C+developed+for+the+SIREVA+project+in+Latin+America%2C+from%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolution of an international external quality assurance model to support laboratory investigation of Streptococcus pneumoniae, developed for the SIREVA project in Latin America, from.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 3184-3190 (2007).</li>
<li>Reasonover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+International+Circumpolar+Surveillance+interlaboratory+quality+control+program+for+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The International Circumpolar Surveillance interlaboratory quality control program for Streptococcus pneumoniae.</a> J. Clin. Microbiol. 49, 138-143 (2011).</li>
<li>Hare, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDodgy+6As%26%2334%3B%3A+differentiating+pneumococcal+serotype+6C+from+6A+by+use+of+the+Quellung+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">#34;Dodgy 6As&#34;: differentiating pneumococcal serotype 6C from 6A by use of the Quellung reaction.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1981-1982 (2009).</li>
<li>Kong, F., Gilbert, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+cpsA-cpsB+sequence+polymorphisms+and+serotype-%2Fgroup-specific+PCR+to+predict+51+Streptococcus+pneumoniae+capsular+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Using cpsA-cpsB sequence polymorphisms and serotype-/group-specific PCR to predict 51 Streptococcus pneumoniae capsular serotypes.</a> J. Med. Microbiol. 52, 1047-1058 (2003).</li>
<li>Castillo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Methods+for+the+Diagnosis+of+Meningitis+caused+by+Neisseria+meningitidis%2C+Streptococcus+pneumoniae%2C+and+Haemophilus+influenzae.+2nd+ed%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of Streptococcus pneumoniae.</a> Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenzae. 2nd ed. , World Health Organization. 73-86 (2011).</li>
<li>Kaijalainen, T., Rintamaki, S., Herva, E., Leinonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+gene-technological+and+conventional+methods+in+the+identification+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of gene-technological and conventional methods in the identification of Streptococcus pneumoniae.</a> J. Microbiol. Methods. 51, 111-118 (2002).</li>
<li>SSIDiagnostica, Neufeld antisera. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica</a> (2013).</li>
<li>Sorensen, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Typing+of+pneumococci+by+using+12+pooled+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Typing of pneumococci by using 12 pooled antisera.</a> J. Clin. Microbiol. 31, 2097-2100 (1993).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+to+pneumococcal+factor+antisera%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Key to pneumococcal factor antisera.</a> , (2013).</li>
<li>Diagnostica SSI, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+antisera+for+in+vitro+diagnostic+use%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal antisera for in vitro diagnostic use.</a> , (2011).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+diagnosis+of+Pneumococcus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Laboratory diagnosis of Pneumococcus infections.</a> Bull. World Health Organ. 23, 5-13 (1960).</li>
<li>Satzke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%3A+Updated+recommendations+from+the+World+Health+Organization+Pneumococcal+Carriage+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae: Updated recommendations from the World Health Organization Pneumococcal Carriage Working Group.</a> Vaccine. 32, 165-179 (2013).</li>
<li>Vernet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-based+diagnosis+of+pneumococcal+pneumonia%3A+state+of+the+art+and+unmet+needs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Laboratory-based diagnosis of pneumococcal pneumonia: state of the art and unmet needs.</a> Clin. Microbiol. Infect. 17, 1-13 (2011).</li>
<li>Casewell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experiences+in+the+use+of+commercial+antisera+for+the+capsular+typing+of+klebsiella+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Experiences in the use of commercial antisera for the capsular typing of klebsiella species.</a> J. Clin. Pathol. 25, 734-737 (1972).</li>
</ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

خطوة حاسمة في هذه التقنية هو ضمان ويستخدم ثقافة نقية لإعداد التعليق جنبا إلى جنب مع إضافة عدد مناسب من الخلايا البكتيرية إلى المرق. تجدر الإشارة إلى أن النمو مستعمرة والتشكل على لوحات أجار يختلف بين عزلات المكورات الرئوية المختلفة. تنتج بعض المستعمرات جافة وخشنة، والذي يمكن أن يكون صعبا لسلخ مع حلقة ولا يستحلب جيدا في المرق. لهذا السبب، فإن اكتساح أكبر من البكتيريا قد تكون مطلوبة عند إعداد تعليق خلية. في أي حال، لا بد من أن الخلايا الفردية، وليس الركام، واضحة في السيطرة السلبية حتى يمكن مقارنة حجمها النسبي للخلايا مع أمصال مضادة المضافة. بالإضافة إلى ذلك، قد يؤدي الخلايا البكتيرية كثيرة جدا في ردة فعل سلبية كاذبة، حيث وجود فائض من مستضد محفظي قد تمنع رد فعل الانتباج 10. لهذا السبب، من المهم لإنشاء تعليق البكتيرية مع كثافة الخلية مناسبة (الشكل 1). وسوسيمكن الحفاظ على التقاعد لعدة أشهر عن طريق إضافة عدة قطرات من الفورمالين المركزة. وهذا يتيح أسهل اختبار دفعة وأيضا يعقم مرق الحد من مخاطر العدوى المكتسبة من المختبرات؛ على الرغم من هذا يجب أن يكون وزنه ضد المخاطر السلامة من الفورمالين والمناولة، والتي هي سامة، أكالة، مسرطنة، توعية، والقابلة للاشتعال. بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أن بعض العزلات تظهر ردود الفعل أضعف في وجود الفورمالين (لا تظهر البيانات). ويتم فحص ردود الفعل الانتباج باستخدام المجهر. استخدام النقيض من المرحلة يعزز من وضوح الكبسولة. في بعض المختبرات، وينظر رد الفعل باستخدام زيت الغمر في 1،000 X التكبير 14، 16. بالإضافة إلى ذلك، استخدام بعض المختبرات وصمة عار مكافحة (الميثيلين الأزرق) لمواصلة تعزيز وضوح رد فعل إيجابي 10 و 16 و 22. ينظر إلى الطريقة المعروضة هنا من دون نفط طmmersion وتحت التكبير 400X 15، 17. هذه الطريقة سريعة وبسيطة وسهلة نسبيا لقراءة 23. فمن المهم للحفاظ على إجراءات جيدة لمراقبة الجودة الداخلية لضمان إجراءات أمصال مضادة والاختبار في النظام. المشاركة في برنامج لضمان الجودة الخارجية غالبا ما تكون مفيدة. وجود قيود كبيرة للتفاعل الانتباج لالمصلي من المكورات الرئوية هي التكلفة العالية للأمصال مضادة المطلوبة. ومع ذلك، وهذا هو الحد الأدنى في البروتوكول أعلاه نظرا لكمية صغيرة من مصل المستخدمة لكل رد فعل. وقد وصفت عدة طرق أخرى لالمكورات الرئوية التصنيف المصلي 23، 24. ومع ذلك، لا يزال الانتباج معيار الذهب، وتطوير أساليب جديدة يتطلب توحيد ضد رد الفعل الانتباج 23. باستخدام أمصال مضادة مناسبة، ويمكن أيضا أن تستخدم في تفاعل الانتباج لتحديد واكتب قبعات أخرىالندبة البكتيريا المنتجة 25. رد فعل الانتباج تلعب دورا محوريا في توصيف الأنماط المصلية للمكورات الرئوية الحالية والناشئة، وكذلك توفير المعلومات عن نجاعة اللقاح والتأثير طويل الأجل من التطعيم على النقل والمرض.

العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و) هي المسؤولة عن وفاة ما يقدر ب 800،000 طفل دون سن الخامسة سنويا، مع انخفاض عبء المرض في الغالب في البلدان الفقيرة في الموارد 1. الأمراض الرئوية وتتراوح في شدتها من التهابات موضعية مثل التهاب الأذن الوسطى الحاد إلى التهاب حاد تهدد الحياة مثل تعفن الدم، والتهاب السحايا والالتهاب الرئوي 2. وقد وصفت أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة من المكورات الرئوية 3، 4. لقاحات المكورات الرئوية الحالية توفير الحماية ضد الأنماط المصلية التي هي المسؤولة عن معظم الأمراض الغازية 5، 6. ومع ذلك، فقد ارتبط انتشار استخدام اللقاحات مع استبدال الأنماط المصلية تضمينها في اللقاح عن طريق الأنماط المصلية nonvaccine، سواء في النقل البلعوم وأمراض الغازية 7، 8. هذا يسلط الضوء على أهمية المصلي لالوبائيةالمراقبة وأثر اللقاح على المدى الطويل يدرس 9. طريقة المعيار الذهبي للكتابة المكورات الرئوية هو اختبار رد فعل المحفظة، والمعروفة باسم تفاعل الانتباج، وصف لأول مرة من قبل نويفلد في عام 1902 (انظر النمساوية 10). تم العثور على درجة عالية من التوافق بين المختبرات، وبين رد فعل الانتباج وأساليب أخرى المصلي 11-13. هناك العديد من الاختلافات في رد فعل الانتباج 10، 14-16. الطريقة الموضحة هنا لا تتطلب استخدام وصمة عار العداد أو عدسة الغمر النفط، بل قطرة من العينة مستعدة مختلطة مع مصل الكتابة ودرست على الفور تحت 400X التكبير. عادة ما يتم إجراء رد فعل الانتباج باستخدام أمصال مضادة متاحة تجاريا. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم أقل أمصال مضادة مقارنة مع بعض الأساليب الأخرى 16، 17، مما يجعلها أكثر فعالية من حيث التكلفة. مرة واحدة في ISOLيأكلون يتم التعرف على والمكورة الرئوية، يتم اختباره بشكل تسلسلي مع حمامات أمصال مضادة حتى لوحظ من ردود الفعل الإيجابية. كل مصل يحتوي على بركة مخاليط مختلفة من أمصال مضادة التي أثيرت ضد المكورات الرئوية الأنماط المصلية 91 18. مرة واحدة يتم تأسيس تجمع، يتم اختبار نوع الفردية والجماعية أمصال مضادة التي تم تضمينها في بركة على رد الفعل بشكل فردي في التسلسل. نوع أمصال مضادة تتفاعل عموما مع النمط المصلي واحد (على سبيل المثال نوع 1 مصل يتفاعل مع النمط المصلي 1)، في حين أن مجموعة أمصال مضادة تتفاعل مع جميع الأنماط المصلية في مجموعة معينة (مثل المجموعة 22 مصل يتفاعل مع الأنماط المصلية 22F و22A). يتم التمييز بعض الأنماط المصلية داخل مجموعات أخرى باستخدام عامل أمصال مضادة (على سبيل المثال المصلي 22F يتفاعل مع عامل 22B، ولكن ليس 22C). في هذه الحالة هو استمرار اختبار مع جميع العوامل ذات الصلة أمصال مضادة حتى يتم تحديد النمط المصلي 19، 20. رد فعل الانتباج بسيطة وسريعة 14 ويمكن القيام بها في أي ليترaboratory التي هي مجهزة تجهيزا مع المجهر نوعية جيدة ومجموعة مناسبة من أمصال مضادة.

<table><tbody><tr><td>المكورات الرئوية (Neufeld) مضاد للأمصال</td><td>SSI Diagnostica</td><td></td><td><a href = "http://www.ssi.dk/ssidiagnostica">http://www.ssi.dk/ssidiagnostica< / a> أحضر جميع مضادات الأمصال إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>المكورات الرئوية (Omni) مضاد المصل</td><td>SSI Diagnostica</td><td>2438</td><td>أحضر جميع مضادات الأمصال إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>المجهر البصري</td><td>Leica Microsystems</td><td>حلقات التلقيح المعايرة Leica DML</td><td></td></tr><tr><td>1 & micro ؛ ل</td><td>لوحات Copan</td><td>CD175S01</td><td></td></tr><tr><td>Horse Blood Agar (HBA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PP2001</td><td><a href = "http://www.thermofisher.com.au/" >http://www.thermofisher.com.au/< / a> ضعه في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام</td></tr> وحدة <tr>تحضير<td>وسائط مرق القلب (HI</td><td>) (MPU) ، جامعة ملبورن</td><td>40HIN</td><td>إحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام</td></tr><tr><td>شرائح المجهر الزجاجي 76 مم × 26 مم</td><td>Lomb Scientific</td><td>7101</td><td>خطر الأدوات الحادة: تخلص منها في حاوية أدوات حادة بيولوجية</td></tr><tr><td>أغطية زجاجية دائرية</td><td>NeuVitro</td><td>GG-5</td><td></td></tr> <tr><td>* باستثناء مضاد الأمصال ، يمكن شراء جميع المواد الأخرى من موردين</td><td></td><td></td><td></td> بديلين</tr> <tr><td>* الألواح المحضرة من دم الأغنام المفصول مناسبة ولكن صفائح الدم المحضرة من الدم الرقيق أو دم الإنسان ليست مناسبة</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; باستخدام تفاعل الانتباج

Capsular Serotyping of Streptococcus pneumoniae Using the Quellung Reaction

هناك أكثر من 90 الأنماط المصلية المحفظة مختلفة من المكورات العقدية الرئوية (المكورة الرئوية و). فضلا عن كونها أداة لفهم وبائيات المكورات الرئوية، ويمكن المصلي المحفظة توفير معلومات مفيدة لفعالية اللقاح وتأثير الدراسات. رد فعل الانتباج هو الأسلوب المعيار الذهبي لالمكورات الرئوية المحفظة المصلي. ينطوي على طريقة اختبار تعليق خلية المكورات الرئوية مع أمصال مضادة المجمعة ومحددة موجهة ضد السكاريد المحفظة. ويلاحظ ردود الفعل ضد مستضد مجهريا. بروتوكول لديه ثلاث خطوات رئيسية: 1) إعداد تعليق خلية البكتيرية، 2) خلط الخلايا وأمصال مضادة على شريحة زجاجية، و3) قراءة رد الفعل الانتباج باستخدام المجهر. رد فعل الانتباج بسيط معقول لأداء ويمكن تطبيقها في أي مكان هي المجهر مناسبة وأمصال مضادة المتاحة.

<html> يحدث رد فعل الانتباج إيجابية عندما يربط نوع محدد الضد إلى كبسولة من المكورة الرئوية، مما يؤدي إلى تغيير في معامل الانكسار في 10. عندما ينظر إليها تحت المجهر، والبكتيريا تظهر &quot;منتفخة&quot; وأكثر وضوحا 14. يبين الشكل 1A الخلايا الرئوية في مرق مرحبا. عند إضافة نوع محدد المصل المضاد للتعليق البكتيرية، المكورات الرئوية تظهر &quot;منتفخة&quot;، الانكسار وأكثر تنوعا (الشكل 1B). عدد كبير جدا من الخلايا البكتيرية تضاف إلى المرق قد يؤدي إلى تجميع الخلايا أو ردة فعل سلبية كاذبة. ويبين الشكل 2 قائح الخلايا الرئوية في مرق مرحبا التي هي &quot;ثقيلة جدا&quot; (الشكل 2A) أو &quot;خفيفة جدا&quot; (الشكل 2B). 08fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51208/51208fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. الانتباج رد الفعل السلبي والإيجابي. محضرات المصلي 9V المكورات الرئوية عزل مع عدم وجود مصل (1A) ومع مجموعة 9 مصل (1B) كان ينظر تحت التكبير 400X. يظهر هذا الأخير &quot;تورم&quot; والتقريب من الخلايا البكتيرية ينظر عادة في رد فعل الانتباج إيجابية. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51208/51208fig2.jpg" /> الشكل 2. ثقيلة جدا وخفيفة جدا قائح. محضرات تعليق خلية المكورات الرئوية التي هي ثقيلة جدا (2A) أو خفيفة جدا (2B)، عندما ينظر تحت التكبير 400X.

رد فعل الانتباج هو المعيار الذهبي لتقنية التصنيف المصلي العقدية الرئوية. هذه التقنية يستخدم المجهر وأمصال مضادة للمكورات الرئوية محددة، ويستخدم عادة في المختبرات المرجعية والبحثية في جميع أنحاء العالم.

There are over 90 different capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). As well as being a tool for understanding pneumococcal ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تحديد للنمط المصلي للمحفظة لبكتيريا streptococcus pneumoniae أو المكورات الرئوية باستخدام تفاعل التخميد (quelling reaction). يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تلقيح مرق تسريب القلب بمزرعة نقية وحديثة من المكورات الرئوية تم تحضيرها طوال الليل. وفي الخطوة الثانية، يتم نقل قطرة من اللقاح إلى شريحة مجهرية زجاجية.بعد ذلك، يُضاف مصل مضاد بحجم مساوٍ على الشريحة. وفي الخطوة النهائية، تُخلط القطرتان معاً وتوضع شريحة غطاء فوق المعلق. وفي النهاية، يمكن فحص المعلق تحت مجهر تباين الأطوار لملاحظة تفاعل Quell للرئة سواء كان إيجابياً أو سلبياً.توضح هذه الطريقة المعيار الذهبي لتحديد النمط المصلي للمكورات الرئوية. وتتميز هذه الطريقة بكونها بسيطة وسهلة التنفيذ والتفسير. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً هاماً، حيث قد يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه التقنية صعوبة في التعرف على كثافة الخلايا المناسبة لإجراء اختبار التراص (quellung test).ابدأ باستخدام عروة معقمة تستخدم لمرة واحدة بسعة 1 µL لأخذ مسحة صغيرة من مزرعة نقية حديثة من المكورات الرئوية (pneumococci) نمت طوال الليل على طبق أغار دم الحصان غير الانتقائي، ثم قم بتلقيح المكورات الرئوية في 100 µL من مرق تسريب القلب. يجب أن يظهر المعلق عكراً بشكل مرئي بالكاد، ثم قم برج الأنبوب برفق لاستحلاب محلول الخلايا. استخدم عروة جديدة بسعة 1 µL لنقل قطرة من اللقاح إلى شريحة مجهر زجاجية.بعد ذلك، ضع غطاء شريحة دائري صغير فوق المعلق، وافحص كثافة المعلق تحت مجهر تباين الأطوار بقوة تكبير 400 مرة. إذا كان اللقاح كثيفاً جداً، خفف معلق الخلايا بمزيد من المرق واخلط الخلايا بلطف مرة أخرى؛ أما إذا كان اللقاح خفيفاً جداً، فعلى سبيل المثال، إذا كان هناك أقل من 50 خلية مرئية، أضف المزيد من البكتيريا إلى معلق الخلايا واخلطها بلطف مرة أخرى.مع اكتساب الخبرة، يمكن تقدير كثافة معلق الخلايا عن طريق رج المعلق ورفعه في مواجهة الضوء، حيث يجب أن يظهر عكراً بشكل مرئي بالكاد. وعند فحص محلول الخلايا تحت المجهر، يجب أن تكون كثافته تقريباً بهذا المستوى.بمجرد الوصول إلى التخفيف الأمثل للخلايا البكتيرية، انقل حوالي 1 µL من اللقاح إلى شريحة المجهر الزجاجية. باستخدام عروة جديدة، أضف حجماً مساوياً في درجة حرارة الغرفة.ضع المصل المضاد على الشريحة واخلط القطرتين معًا جيدًا. وباستخدام الحلقة، ضع فوراً غطاءً شرائحياً صغيراً فوق المعلق، مع الحرص على عدم لمس القطرة بالملقط. ثم افحص المعلق تحت مجهر تباين الطور كما تم توضيحه للتو.يتم ملاحظة تفاعل كويل (Quell reaction) سلبي عندما لا يُلاحظ تورم في الخلايا العقدية الرئوية أو يكون تورمها طفيفاً، وهو ما يماثل العينة الضابطة السلبية التي تكون عبارة عن معلق للخلايا العقدية الرئوية دون إضافة أي أمصال مضادة. أما تفاعل كويل الإيجابي فيحدث عندما يرتبط الجسم المضاد النوعي بالمحفظة الخاصة بالمكورات الرئوية، مما يؤدي إلى تغيير في معامل انكسارها.عند الفحص باستخدام تباين الطور، تظهر البكتيريا متورمة وأكثر وضوحاً. تذكر عند تنفيذ هذا الإجراء أنك تتعامل في الواقع مع كائنات حية دقيقة؛ ولذلك، يجب توخي الحذر واتباع الممارسات المختبرية الجيدة، وارتداء الملابس الواقية، واستخدام معدات المختبر المناسبة، والتخلص من جميع المعدات والكواشف في نهاية العملية بشكل آمن.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون 10 دقائق تقريبًا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الإجراء، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تحديد النمط المصلي لبكتيريا pneumococcus باستخدام تفاعل qua lung. وتعد هذه التقنية مهمة لفهم وبائيات المكورات الرئوية، سواء في حالة الاستعمار الأنفي البلعومي أو في الأمراض الغازية.

capsular-serotyping-streptococcus-pneumoniae-using-quellung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

وصفت وسيلة فعالة لتقييم التعرض سطح البروتينات البريميات. وهو مصمم خصيصا لطريقة لتجنب اضطراب الغشاء الخارجي للخلايا هشة البريميات. هذا الأسلوب يتطلب العمل من الضوابط سلبية عديدة لتقييم سلامة الغشاء الخارجي ونوعية رد فعل الأجسام المضادة.

المناعية مضان الفحص من البروتينات السطحية المعرضة للالبريميات

نحن تصف PCR متعددة للكشف السريع لserovars السالمونيلا الملهبة enterica ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية. يمكن التعرف على السالمونيلا serovars محددة من خلال استهداف متعددة PCR لتسلسل الجينات وفريدة من نوعها إلى الكتلة الحيوي O - مستضد وفلاجيلين لضرب مصلي معين. يتم تعيين ضرب مصلي ثم إلى عزل السالمونيلا استنادا إلى مظهر معين amplicons الحجم ، (PCR المنتج) المقابلة لأليل الهدف.

وPCR لتحديد Allelotyping السالمونيلا enterica serovars الملهبة ، الهدار ، هايدلبرغ ، والتيفية الفأرية

يتم وصف استعمار البلعوم الأنفي المورين مع الالتهاب الرئوي العقدي والاستخراج اللاحق للخلايا الملتصقة أو المجندة. تتضمن هذه التقنية مسح البلعوم الأنفي وجمع السائل من خلال nares وهي قابلة للتكيف مع قراءات مختلفة ، بما في ذلك تحديد كمية الخلايا التفاضلية وتحليل تعبير مرنا في الموقع.

توصيف الاستجابات الالتهابية خلال الاستعمار داخل الشرج مع الالتهاب الرئوي العقدي

نعرض مقايسة تفاعل البوليميراز المتسلسل البسيطة متعددة الإرسال للفحص السريع والكتابة لأنواع المكورات العنقودية المكورات العنقودية (SCCmec) من النوع I-V للمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ، ونوفر بعض الخطوات الحيوية والفروق الدقيقة الإجرائية التي تجعلها ناجحة في تكييف هذا الاختبار مع المختبرات الفردية.

?????? PCR ????? ??????? ?? ?????????? ????? ???????? ????? ?? ????? ??? ?????? ?? ????????? ??????<em&gt; ???????? ????????? ???????</em

اختبار تراص اللاتكس هو طريقة بسيطة وسريعة وغير مكلفة للالتصنيف المصلي العقدية الرئوية، وكما تم تطبيقها على نطاق واسع في علم الأحياء الدقيقة التشخيصي. تصف هذه المخطوطة إنتاج في المنزل من الكواشف تراص اللاتكس، وإجراءات مراقبة الجودة وتطبيق هذه التقنية لالمصلي المكورات الرئوية.

المحفظة المصلي من<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; من جانب تراص اللاتكس

تشكل المكورات العقدية الرئوية آفات مجهرية منفصلة غير قيحية في القلب. الموضح هو بروتوكول نموذج الفئران لتكوين الآفة الدقيقة القلبية. يتم توفير تعليمات حول تصور الآفات الدقيقة باستخدام الفحص المجهري ، والتمييز بين الآفات الدقيقة المبكرة والمتأخرة ، وطرق الكشف عن إعادة تشكيل القلب في قلوب النقاهة.

التصور<em&gt; العقدية الرئوية</em&gt; داخل القلب Microlesions وإعادة عرض القلب لاحقا

هذا الإنزيم قتل أوبسونوفاجوسيتيك يستخدم لمقارنة قدرة الخلايا المناعية متجولة التجاوب وتقتل البكتيريا التي تستند إلى معالجات مختلفة و/أو شروط. كلاسيكي، هذا التحليل بمثابة المعيار الذهبي لتقييم الوظائف المستجيب للأجسام المضادة التي أثيرت ضد بكتيريا طاهية.

أوبسونوفاجوسيتيك قتل المقايسة لتقييم الاستجابات المناعية ضد مسببات الأمراض البكتيرية

يتم تطبيق التوسع في الشفرة الوراثية لإدخال حمض أميني غير طبيعي يحمل مجموعة وظيفية بيولوجيا على بروتين حامل في موقع محدد. كما تستخدم وظيفة بيولوجياً في اقتران انتقائي للموقع من مستضد الكربوهيدرات لتوفير لقاح جليكوكونجوجيت متجانس.

متجانسة جليكوكونجوجيت التي تنتجها الجمع بين دمج الأحماض الأمينية غير الطبيعية وكليك الكيمياء لأغراض لقاح

هنا ، نصف سلالة S. pneumoniae من النمط المصلي 1 519/43 التي يمكن تعديلها وراثيا باستخدام قدرتها على الحصول بشكل طبيعي على الحمض النووي والبلازميد الانتحاري. كدليل على المبدأ ، تم إجراء طفرة متجانسة في جين pneumolysin (رقائق).

بناء الطفرات في سلالة العقدية الرئوية من النمط المصلي 1 519/43

في عدوى الميكوبلازما الرئوية ، يمكن أن تؤدي اختبارات الأمصال إلى نتائج جيدة ، ولكن مع خصوصية منخفضة بسبب التفاعل المتقاطع المناعي. يضمن ELISA الذي يلتقط المستضد الداخلي ، الموصوف في هذه الورقة ، خصوصية عالية للأنواع وقد ثبت أنه اختبار فحص موثوق به للتشخيص الدقيق للمتفطرة الرئوية.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بإنزيم التقاط المستضد للكشف المحدد عن الميكوبلازما الرئوية

اكتشف طريقة تفاعل الانتباج لتحديد الأنماط المصلية لبكتيريا Streptococcus pneumoniae باستخدام المجهر ذي التباين الطوري. هذه التقنية الذهبية تساعد الباحثين في دراسة وبائيات المكورات الرئوية بدقة.

المحفظة المصلي من

استكشف المزيد من الفيديوهات