مكافحة النووية عن طريق فحص الأجسام المضادة التهاب الكبد-2 خلايا

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام مقايسة التألق المناعي غير المباشر للكشف عن الأجسام المضادة للنواة. ويتحقق ذلك عن طريق تحضين مصل المريض مع شرائح ركيزة hep two. يتم غسل مصل المريض غير المرتبط، ثم تُحضن الأجسام المضادة الذاتية المرتبطة مع مرافق محدد مُعلم بالفلوريسين، وبعد ذلك يتم غسل الكاشف غير المرتبط.

عند فحصها عبر مجهر فلوري، ستظهر العينات الإيجابية للأجسام المضادة الذاتية فلورة خضراء تفاحية تقابل مناطق الخلية أو النوى التي ارتبطت بها الأجسام المضادة الذاتية بنمط فلورة يشير إلى وجود المستضد. وفي النهاية، يمكن استخدام وجود arna للمساعدة في تشخيص أمراض النسيج الضام. وتتمثل الميزة الرئيسية لطريقة التألق المناعي غير المباشر مقارنة بالطرق الأخرى مثل مقايسة Eliza ذات الطور الصلب، في أن ركيزة خلايا Hep two تحتوي على أكثر من 100 مستضد يتم التعبير عنها في تكوينها الأصلي.

يتيح ذلك تحديد جميع الأجسام المضادة من فصيلة O ذات الصلة سريرياً تقريباً، وهو أمر غير ممكن باستخدام تقنيات الوجه الصلب نظراً لأن طريقة التألق المناعي غير المباشر هي تقنية متخصصة للغاية. يحتاج الأفراد الجدد في هذه الطريقة إلى الوقت والممارسة ليصبحوا متقنين لإجراءات معالجة الشرائح. كما أن تفسير الصور المجهرية وتعلم تحديد الأنماط ذات الصلة مهارة تتطلب وقتاً لإتقانها.

باستخدام الكواشف والأدوات المناسبة، تكون النتائج أكثر اتساقاً وأسهل في التفسير. ستقوم كاساندرا براينت، وهي تقنية من مختبر تطوير المقايسات المناعية الفلورية، بشرح الإجراء. قم بإخراج الكواشف من العبوات واترك كل مادة لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم جهز الكواشف وخفف مصل المريض وفقاً للنشرة الإرشادية؛ علماً بأن الشرائح تحمل رموزاً شريطية (barcodes) ويمكن دمجها بسهولة في الأنظمة الآلية.

يوضح هذا الإجراء عملية معالجة الشرائح يدويًا. ومع ذلك، قد تختار المختبرات ذات الإنتاجية العالية استخدام معدات آلية لمعالجة الشرائح تتميز بقدرات مسح الرموز الشريطية (barcode). وتتصل أجهزة Inova عبر شبكة ذكية مركزية تتيح التحكم في نتائج سير العمل وإعداد التقارير.

من أجل اختبار التألق المناعي غير المباشر (IFA). يؤدي هذا إلى تحديد إيجابي لهوية المريض بدءاً من مرحلة المعالجة والقضاء على أخطاء النسخ والأخطاء ذات الصلة. ضع قطرة واحدة من الضابط الموجب وقطرة واحدة من الضابط السالب على الشريحة المناسبة.

باستخدام الماصة، يتم توزيع 20 إلى 25 µL من مصل المريض المخفف في الآبار المتبقية. يتم معالجة شريحة واحدة في كل مرة. توضع الشريحة في وعاء تلوين يحتوي على منشفة ورقية مبللة في القاع، ثم يُغطى الوعاء وتُحضن الشريحة لمدة 30 دقيقة.

ستمنع الظروف الرطبة جفاف الركيزة، الأمر الذي قد يؤدي إلى ظهور تلوين اصطناعي. وخلال فترة الحضن هذه، سترتبط الأجسام المضادة للنواة الموجودة في مصل المريض بالمستضدات الخاصة بالخلايا المثبتة في كل بئر. وبعد انتهاء فترة الحضن، يتم شطف المصل باستخدام تدفق لطيف من محلول الغسيل المنظم لتجنب إتلاف الركيزة.

قم بإمالة الشريحة قليلاً بحيث لا يوجه التدفق مباشرة نحو الركيزة. سيساعد هذا التوجيه للشرائح أيضاً في منع تداخل العينات بين الآبار. تخلص من فائض محلول الغسل عن طريق النقر الخفيف، ثم ضع الشريحة في وعاء كوبلاند يحتوي على محلول الغسل.

يجب أن تكون مدة الحضن لخطوة الغسيل خمس دقائق تقريبًا. أخرج الشرائح من محلول الغسيل المنظم وقم بالنقر عليها برفق. ولإزالة محلول الغسيل الزائد، ضع قطرة واحدة من المتقارن الفلوري في كل بئر.

لاختبار NA، يوصى باستخدام مرافق محدد لـ IgG FC. تُحضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في حاوية مرطبة، مع التأكد من إعادة وضع غطاء التلوين. يعد المرافق حساساً للضوء، وسيعمل الغطاء على حماية الشرائح من التعرض للضوء.

خلال فترة الحضن هذه، سيرتبط المقترن بالأجسام المضادة للنوى الخاصة بالمريض والتي ارتبطت مسبقاً بمستضدات الخلية. وينتج عن ارتباط هذا المقترن ظهور الفلورة في الآبار بعد عملية الحضن. اغسل الشريحة باستخدام محلول الغسيل المنظم.

كما سبق، ضع غطاء شريحة على منشفة ورقية وقم بوضع وسط التثبيت في خط مستمر على الحافة السفلية لغطاء الشريحة. أخرج كل شريحة من محلول الغسل وقم بالنقر على الشريحة برفق. ولإزالة محلول الغسل الزائد، لامس الحافة السفلية للشريحة بحافة غطاء الشريحة.

اخفض الشريحة برفق فوق غطاء الشريحة بحيث يتدفق وسط التثبيت الموجود على غطاء الشريحة إلى الحافة العلوية للشريحة دون تكوّن فقاعات هوائية؛ حيث إن توزيع الكمية المثالية من وسط التثبيت هو تقنية تتطلب الممارسة لإتقانها. عند فحص الشرائح باستخدام مجهر فلوري موجود في غرفة مظلمة، يجب إجراء مسح للبئر بالكامل باستخدام عدسة شيئية 20 x أو 25 x. ولتقييم توزيع الخلايا وتجانس الفلورة، يتم الانتقال إلى عدسة شيئية 40 x.

لإجراء التفسير النهائي فيما يتعلق بالإيجابية والنمط، انظر إلى الضوابط الموجبة والسالبة. قد لا يظهر الضابط السالب مظلماً تماماً، ولكنه غالباً ما يظهر تألقاً غير محدد بمستوى منخفض. أما الضابط الموجب فسيظهر تألقاً أخضر تفاحياً ساطعاً في النواة.

يمكن تصنيف الإيجابية باستخدام مقياس درجة التفاعلية من واحد زائد إلى أربعة زائد. وبالإضافة إلى التفسير اليدوي، يمكن تحميل الشرائح وفحصها بواسطة المجهر الفلوري الآلي. ولا يلزم وجود غرفة مظلمة.

بعد إنشاء المشروع من خلال اختيار نوع الشريحة المناسب، يقوم الجهاز بالتقاط وتخزين صور رقمية عالية الدقة للخلايا في كل بئر. بالإضافة إلى ذلك، يقوم برنامج Nova view بقياس شدة الضوء الفلوري وتصنيف النتائج كإيجابية أو سلبية، كما يوفر خاصية التعرف على الأنماط للعينات الإيجابية. ويقوم المشغل باستعراض الصور على شاشة كمبيوتر عالية الدقة، مما يسمح بالتفسير النهائي، والمراجعة، وتأكيد نتائج Nova View.

يمكن إصدار تقارير النتائج بناءً على النتائج المؤكدة. يؤدي ارتباط الأجسام المضادة الذاتية بتركيبات البروتينات المكونة داخل النواة إلى ظهور خمسة أنماط نووية رئيسية، تشمل النمط المتجانس، والمنقط، والمركز السنتروميري، والنووي، والنقط النووي. ولتحديد النمط المتجانس كما هو موضح هنا، يتم تحديد الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي أو الخلايا المنقسمة.

تظهر الخلايا في مرحلة الانقسام الفتيلي تألقاً متجانساً وكثيفاً، والذي غالباً ما يكون أكثر وضوحاً مما هو عليه في الخلايا الساكنة. يجب أن تكون نوى الخلايا الساكنة متجانسة مع تلوين منتشر. ومن المرجح أن يكون هذا النمط المميز ناتجاً عن أجسام مضادة ذاتية للحمض النووي DNA مزدوج السلسلة.

تتمثل إحدى الخصائص الرئيسية للنمط المنقط في مظهر "شق العملة المعدنية" لخلايا الانقسام الفتيلي في الطور الاستوائي. تكون المنطقة الكروموسومية في هذه الخلايا سلبية. أما الخلايا الساكنة فتظهر نمطاً منقطاً في جميع أنحاء النوى.

يمكن تعريف النمط المنقط بأنه خشن أو ناعم. وينتج التنقيط الخشن عن الأجسام المضادة الذاتية لـ SM و RNP. أما التنقيط الناعم فيمكن أن يكون ناتجاً عن الأجسام المضادة الذاتية لـ S-S-A-S-S-B وكذلك RNA polymerase.

يُشار إلى نمط DFS باسم النمط المنقط الدقيق والكثيف، وهو يشير إلى وجود أجسام مضادة ذاتية لـ DFS 70. تظهر الخلايا في طور الانقسام صبغاً منقطاً، بينما تظهر الخلايا في حالة الراحة نقاطاً دقيقة موزعة بشكل موحد في جميع أنحاء النواة. في هذه الحالات، يجب إجراء اختبارات تأكيدية نظراً لأن الأجسام المضادة ذاتية DFS 70 منتشرة لدى الأفراد الأصحاء مقارنة بالمرضى الذين يعانون من أمراض النسيج الضام.

لتحديد نمط السنتومير، قم بمسح الآبار وتحديد الخلايا في طور الانقسام أو الخلايا المنقسمة. تحتوي الخلايا المنقسمة على بقع منفصلة عديدة مرتبطة ببعضها البعض ارتباطاً وثيقاً، وغالباً ما تُسمى شريط الطور الاستوائي. أما الخلايا في طور الراحة فتظهر فيها ما يقرب من 40 إلى 60 بقعة منفصلة موزعة في جميع أنحاء النواة.

يرتبط نمط السنترومير بالأجسام المضادة الذاتية لبروتينات السنترومير مع النمط النويي. ويكون تلوين المنطقة الكروموسومية في الخلايا الانقسامية متغيراً. كما يرتبط النمط النويي بتلوين متجانس أو منقط للنوى، إلى جانب تلوين ضعيف أو منقط أو متجانس لسيتوبلازم النواة في نوى الخلايا الساكنة.

يرتبط هذا النمط بالأجسام المضادة الذاتية لـ RNA polymerase three fibrillin والأجسام المضادة PM SCL. أما نمط النقاط النووية فيرتبط بالخلايا الانقسامية ذات الطور الاستوائي السلبي، ووجود نقاط قليلة ومتميزة في نوى الخلايا في حالة الراحة. وغالباً ما يكون هذا النمط المميز نتيجة للأجسام المضادة الذاتية لـ SP 100 PML أو P 80 colan.

ترتبط هذه الأجسام المضادة بتليف الكبد الصفراوي الأولي والتهاب الكبد المناعي الذاتي. وفي الصورة الموضحة، يُظهر نمط النقاط النووية تلوناً سيتوبلازمياً ناتجاً عن أجسام مضادة ذاتية لمستضدات الميتوكوندريا. ويعد الكشف عن الأجسام المضادة للنواة والتعرف على نمطها أداة مهمة للمساعدة في تشخيص المرضى.

إن فهم أهمية الأنماط المختلفة يُمكّن السريريين وموظفي المختبر من إجراء اختبارات المتابعة المناسبة. وتتمثل أهم العوامل لتحديد أنماط الأجسام المضادة للنواة بشكل صحيح في اختيار ركيزة خلوية عالية الجودة ومعالجة الشرائح بتقنية جيدة ومتسقة. ويتم قراءة الشرائح تقليدياً باستخدام المجهر الفلوري في غرف مظلمة، ويقوم بذلك تقنيون مدربون على دراية بالأنماط المختلفة في سياق الدورة الخلوية ومورفولوجيا الخلية.

في السنوات القليلة الماضية، تم تطوير أنظمة تصوير رقمية للقراءة الآلية للشرائح، حيث تعمل هذه الأدوات على أتمتة سير العمل وزيادة اتساق القراءة والتفسير. علاوة على ذلك، فإن استخدام الشرائح ذات الرموز الشريطية (barcoded slides) يضمن إمكانية تتبع العينات طوال العملية، مما يلغي أخطاء النسخ المحتملة ويعزز سلامة البيانات وأمان المرضى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ كل خطوة من خطوات إجراء التألق المناعي غير المباشر وكيفية تحديد أنماط الأجسام المضادة للنوى ذات الصلة سريرياً.