السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية في المختبر

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار الفعالية السامة للخلايا للعلاج الضوئي الديناميكي في خلايا الساركوما العظمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس امتصاص المحسس الضوئي M-T-H-P-C داخل الخلايا بواسطة خلايا الساركوما العظمية. في الخطوة الثانية ، يتم تطبيق ضوء الليزر على الخلايا لتنشيط M-T-H-P-C وإنتاج جذور الأكسجين السامة للخلايا.

أخيرا ، يتم قياس عملية التمثيل الغذائي للخلية وعدد الخلايا بواسطة اختبار رباعي أوليوم واحد قابل للذوبان في الماء أو اختبار WST واحد. في النهاية ، يمكن استخدام اختبار WST ، بالإضافة إلى العد المباشر للخلايا ، لقياس السمية الخلوية للعلاج الضوئي الديناميكي على خلايا الساركوما العظمية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الساركوما العظمية لأنها تسمح بقياس فعالية العلاج الضوئي الديناميكي في المختبر وتشبه التقنية المستخدمة حاليا في المرضى.

لمقارنة امتصاص M-T-H-P-C بين خطوط خلايا الساركوما العظمية ، ابدأ بالطلاء 0.2 في 10 إلى Hoss السادس و 143 خلية B لكل بئر. في ثلاث نسخ في ستة ألواح آبار ، دع الخلايا تلتصق بين عشية وضحاها بطلاقة مشتركة تتراوح من 80 إلى 90٪ ، ثم في اليوم التالي ، احتضان الخلايا بتركيز ثابت من M-T-H-P-C لفترات زمنية مختلفة في الظلام لتقييم امتصاص الخلايا المعتمد على الوقت للحساسس الضوئي. بعد الحضانات ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم افصل الخلايا ب 0.5 مل من التريبسفي EDTA وعده.

بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة. استنشق الوسط وأعد تعليق الحبيبات في PBS إلى كثافة نهائية مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من 96.

لوحة جيدة وقياس مضان الخلايا في مقياس الطيف الضوئي الفلوري ضبط على 417 نانومتر إثارة ، وانبعاث 652 نانومتر. ثم قم بإعداد منحنى قياسي عن طريق طلاء 100 ميكرولتر من صفر إلى أربعة ملليغرام لكل ملليتر من تركيزات M-T-H-P-C بثلاث نسخ. في صفيحة 96 بئر وقياس التألق كما هو موضح للتو لتوليد منحنى قياسي لحساب وحدة التألق النسبية لكل خلية تحتوي على بئر من اللوحة المقاسة مسبقا.

لقياس السمية الضوئية لمحسس الضوء ، قم أولا بزرع 3000 خلية لكل بئر بثلاث نسخ لكل تركيز M-T-H-P-C في 96 لوحة بئر ، بما في ذلك خلايا التحكم في السمية الداكنة لكل تركيز PHOTOSENSITIZER. دع الخلايا تلتصق بين عشية وضحاها بطلاقة مشتركة تتراوح بين 50 و 60٪ في اليوم التالي. احتضان الخلايا بمجموعة من تركيزات M-T-H-P-C في الظلام لمدة خمس ساعات بعد الحضانة.

قم بشفط الوسط وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وأضف وسائط جديدة بدون M-T-H-P-C ثم خاصة بطيف امتصاص M-T-H-P-C ، مع ارتداء حماية مناسبة للعين. اضبط ليزر الصمام الثنائي 652 نانومتر على طاقة 21.88 مللي واط لكل سنتيمتر مربع على ارتفاع 13.5 سم. المسافة من الخلايا للحصول على جرعة طاقة قدرها خمسة جول لكل سنتيمتر مربع.

ثم قم بإضاءة الخلايا باستثناء خلايا التحكم في السمية المظلمة لمدة 230 ثانية بعد الإضاءة. احتفظ بالخلايا في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الوزن ، كاشف واحد لكل 100 ميكرولتر من المتوسط بعد ثلاث ساعات من إضافة الكاشف الواحد ، وقياس امتصاص الآبار الفردية عند 415 نانومتر.

أخيرا ، احسب عدد الخلايا الباقية بالإضافة إلى اختبار WST الواحد. العد المباشر للخلايا هو طريقة ثانية لقياس سمية الخلايا. لحساب النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة ، قم بالبذور مرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في 2 24 صفيحة بئر واتركها تلتصق طوال الليل.

في اليوم التالي ، احتضن الخلايا لمدة خمس ساعات في الظلام باستخدام M-T-H-P-C وأضيئها كما هو موضح للتو. احتفظ بخلايا التحكم المظلمة في الظلام بعد 24 ساعة ، واجمع المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وعيون التربسين ، وأخيرا قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسط الطازج للعد. تظهر النتائج الموضحة في هذا الرسم البياني في اللوحة العلوية امتصاص M-T-H-P-C بطريقة تعتمد على الوقت مع شدة مضان لتعليق الخلية الذي يمثل المستويات داخل الخلايا ل M-T-H-P-C.

في اللوحة السفلية. يمكن تقييم امتصاص M-T-H-P-C المعتمد على الجرعة عن طريق قياس مضان M-T-H-P-C باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري. يوضح هذا الرسم البياني امتصاص تركيز ثابت ل M-T-H-P-C بطريقة تعتمد على الوقت مع شدة التألق لتعليق الخلية التي تمثل المستويات داخل الخلايا ل M-T-H-P-C.

في هذا الرسم البياني ، يتم توضيح امتصاص M-T-H-P-C المعتمد على الجرعة في Haass و 143 خلية B بعد حضانة لمدة خمس ساعات. كان الامتصاص في خط الخلية النقيلي العالي 143 B أعلى بكثير مما كان عليه في خط الخلية المضيفة الأبوية النقيلي المنخفض. يتم توضيح السمية الداكنة المعتمدة على الجرعة لخلايا الساركوما العظمية.

تمت معالجة 143 خلية بائية بجرعات مختلفة من M-T-H-P-C ومقارنتها بالخلايا غير المعالجة ولوحظ انخفاض يعتمد على الجرعة في نشاط التمثيل الغذائي وعدد الخلايا المقاس بواسطة اختبار WST واحد. تم التعرف على انخفاض قابلية الخلية للبقاء عند تركيز M-T-H-P-C يساوي ويزيد عن 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر. في الرسم البياني السفلي ، يتم توضيح السمية المعتمدة على الجرعة ل M-T-H-P-C.

عولجت الخلايا بجرعات مختلفة من M-T-H-P-C وإضاءة لاحقة بمعدل خمسة جول لكل سنتيمتر مربع. لوحظ انخفاض تبعي في نشاط التمثيل الغذائي للخلايا بالإضافة إلى انخفاض في عدد الخلايا. مهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لتطبيق هذه الأساليب على نماذج الساركوما العظمية في الجسم الحي وكذلك للفحوصات قبل السريرية الأخرى.