Name: السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية في المختبر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: اكتشف فعالية العلاج الضوئي في خلايا الساركوما العظمية باستخدام المستحضر الضوئي M-T-H-P-C. يقيس هذا البروتوكول امتصاص الخلايا للمستحضر والسمية الخلوية بعد التنشيط بالليزر.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أشكر biolitec بحوث محدودة (جينا، ألمانيا) لتتكرم تزويدنا صياغة الليبوسومال mTHPC، مع شكر خاص لسوزانا GRAFE وأرنو Wiehe لمساعدتهم والخبرة التقنية. نحن أيضا نود أن نشكر كيرستين ريدي، الذي ولدت على جزء كبير من النتائج وكان coresponsible لنشره 11. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من Schweizerischer VEREIN Balgrist، جامعة زيوريخ، وزيوريخ Krebsliga فضلا عن منحة من والتر L. ومؤسسة جوانا وولف، زيوريخ، سويسرا ومنحة من EuroNanoMed ERA-NET / الجبهة الوطنية الصومالية السويسرية المؤسسة الوطنية للعلوم 31NM30-131004/1. وأيد هذا العمل أيضا من قبل HSM برنامج (الطب متخصصة للغاية) لعلم الأورام العضلية الهيكلية من Kanton زيوريخ.

1. مقارنة بين امتصاص من mTHPC في أدنى المعنية ودرجة عالية من النقيلي وملتحقا 143B OS خطوط الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM، هام F12، والحرارة المعطل مصل العجل الجنين في نسبة 4.5:4.5:1. ملاحظة: تم حل صياغة الليبوسومال من PS mTHPC في الماء عند تركيز النهائي من 1.5 ملغ / مل mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 0.2 × 10 6 خلايا وملتحقا 143B / جيد في 6 لوحات جيدة (يثلث لكل حالة)، والسماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها. ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لخطوط الخلايا الفردية. A confluency من 80-90٪ هو أنسب وقت التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيز ثابت من mTHPC لفترات زمنية مختلفة (الوقت امتصاص التابعة)، أو مع زيادة تركيزات mTHPC خلال فترة زمنية محددة (جرعة امتصاص التابعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع mTHPC لفترة محددة عoints أو تركيزات mTHPC. ملاحظة: في هذه الدراسة، وحضنت كل من ملتحقا وخطوط الخلايا 143B مع 0.6 ميكروغرام / مل mTHPC ل0، 2.5، 5، أو 10 ساعة، أو مع 0، 0.6، 2.5، و 10 ميكروغرام / مل mTHPC لمدة 5 ساعة. قد تختلف الفترات الزمنية المطبقة وجرعات اعتمادا على خط الخلية التي يتم استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تذكر أن يعمل دائما في الظلام أو في ظروف الإضاءة خافتة لمنع التعرض للضوء المباشر للخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة الخلايا في الظروف المشار إليها، نضح المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. المقبل، فصل الخلايا مع 0.5 مل التربسين / EDTA وعدد الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد انفصال، الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق، نضح المتوسطة وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني لكثافة النهائي من 200،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها (أي 20،000 الخلايا) في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من هذه الخلايا في معمل مضان. الإعدادق لقياسات مضان mTHPC هي: 417 نانومتر للإثارة و 652 نانومتر للالانبعاثات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حساب كمية mTHPC المنضوية لكل خلية، وتطبيع وحدة مضان النسبي (RFU) لعدد الخلايا وحجم الخلايا كما يلي: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد منحنى قياسي باستخدام تركيزات مختلفة من mTHPC في برنامج تلفزيوني 0-4 ميكروغرام / مل (القياسات استخدام ثلاث نسخ). ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من الآبار باستخدام الإعدادات الموضحة في الخطوة 1.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم RFU (التي تم الحصول عليها للخلايا 20،000) من قبل المنحدر من منحنى القياسية الخطية من mTHPC، والتي تعطي تركيز mTHPC (في ميكروغرام / مل) في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم هذا التركيز mTHPC بنسبة 10 إلى الحصول على المبلغ الإجمالي للmTHPC في بئر واحدة (في ميكروغرام، وهو ما يمثل 100 ميكرولتر من تعليق خلية) وتقسم هذه القيمة عن طريق حجم 20،000 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب حجم مع صيغة لمجال: (4/3 س π) ×ص 3. الحصول على نصف قطرها ص عن طريق قياس قطرها 20 trypsinized الخلايا تحت المجهر، وتقسيم هذه القيمة بنسبة 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخيرا، وتطبيع كل القيم لتلك التي حصلت للخلايا ملتحقا بعد 10 ساعة من الحضانة (جرعة امتصاص التابعة) أو تعامل مع 10 ميكروغرام / مل mTHPC (الوقت امتصاص التابعة)، والتي تم تعيينها إلى 100٪. </li></ol> 2. قياس الضيائية من PS في المختبر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 3،000 خلية / جيدا في لوحة 96 جيدا (يثلث لكل تركيز mTHPC المستخدمة) والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها. وبالمثل إعداد إضافية وحة 96 جيدا وعلاج الخلايا كما هو موضح أدناه، ولكن ثم وضعها جانبا للتصوير النقيض المرحلة. ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لكل خط الخلية الفردية. A confluency من 50-60٪ في وقت التجربة هو المثل الاعلى. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع في اعتبارنا أن تضيف المقابلة سيطرة الظلام سمية للخلايا لكل من تركيزات mTHPC. الحد ذاتها هي الخلايا التي سيتم المحتضنة في غياب أو وجود تركيزات مختارة من mTHPC، ولكن لن تكون مضيئة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيزات مختلفة من mTHPC (0، 0.0001، 0.001، 0.01، 0.03، 0.075، 0.15، 0.3، 0.6، 1.25، 2.5، 5، و 10 ميكروغرام / مل) اعتمادا على خطوط الخلايا و الاحتفاظ بها في الظلام لمدة ساعة 5. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى القسم 1.3.2 ملاحظة: قبل فترة حضانة تعتمد الإضاءة على خط الخلية وعلى PS المستخدمة، وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار تركيزات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة في تجارب منفصلة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة للفترة الزمنية المشار إليها، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة متوسطة جديدة دون mTHPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلقاء الضوء على الخلايا مع ليزر ديود 652 نانومتر، محددة لامتصاص الطيف mTHPC (انظر الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الليزر ل21.88 ميغاواط / سم 2 قوة على ارتفاع 13.5 سم distaالامتحانات التنافسية الوطنية من الخلايا، من أجل الحصول على جرعة من الطاقة من 5 J / سم 2. إلقاء الضوء على الخلايا ل230 ثانية. لا تضيء الخلايا السيطرة سمية الظلام (مع وبدون mTHPC). ملاحظة: دائما ارتداء النظارات لحماية العينين من ضوء الليزر المستخدمة في الإثارة من PS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإضاءة، والحفاظ على الخلايا في الظلام في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في وقت لاحق، إضافة الماء نتروبلو القابلة للذوبان (WST-1) كاشف (10 μl/100 ميكرولتر من متوسطة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاث ساعات من إضافة كاشف WST-1، وقياس الامتصاصية من الآبار الفردية من لوحة 96 جيدا في 415 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حساب نسبة الخلايا على قيد الحياة، تعيين متوسط ​​القيم التي تم الحصول عليها للخلايا غير المعالجة mTHPC لكل حالة إلى 100٪ (أي مضيئة، دون mTHPC وnonilluminated، دون mTHPC). </li></ol> 3. تقدير عدد الخلايا التي كتبها العد الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 20،000 خلية / نحنليرة لبنانية في 24 لوحة جيدا والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا لمدة 5 ساعة مع mTHPC (0.001، 0.003، 0.15، 0.6، و 1.25 ميكروغرام / مل)، وتضيء لهم كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المتوسطة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين لهم وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، ونضح المتوسطة و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من متوسطة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا في غرفة نويباور. </li></ol>

<ol><li>Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer.+Basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications.</a> Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).</li>
<li>Agostinis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+of+cancer%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy of cancer: an update.</a> CA Cancer. 61, 250-281 (2011).</li>
<li>D'Adamo, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appraising+the+current+role+of+chemotherapy+for+the+treatment+of+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma.</a> Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).</li>
<li>Allison, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+meta-analysis+of+osteosarcoma+outcomes+in+the+modern+medical+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era.</a> Sarcoma. , (2012).</li>
<li>Anninga, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapeutic+adjuvant+treatment+for+osteosarcoma%3A+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand.</a> Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).</li>
<li>Bacci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+of+relapse+in+patients+with+osteosarcoma+of+the+extremities+treated+with+neoadjuvant+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy.</a> Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).</li>
<li>Briccoli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+recurrent+pulmonary+metastases+in+patients+with+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma.</a> Cancer. 104, 1721-1725 (2005).</li>
<li>Milla Sanabria, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+photodynamic+therapy+effects+on+the+cellular+and+molecular+components+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).</li>
<li>Mitra, S., Foster, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photophysical+parameters%2C+photosensitizer+retention+and+tissue+optical+properties+completely+account+for+the+higher+photodynamic+efficacy+of+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin+vs+Photofrin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin.</a> Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).</li>
<li>Ma, L., Moan, J., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+new+photosensitizer%2C+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%2C+for+use+in+photodynamic+therapy%3A+a+comparison+of+its+photobiological+properties+with+those+of+two+other+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers.</a> Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).</li>
<li>Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTHPC-mediated+photodynamic+therapy+is+effective+in+the+metastatic+human+143B+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells.</a> Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).</li>
<li>Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+sensitivity+of+microvascular+endothelial+cells%2C+fibroblasts+and+tumor+cells+after+in+vitro+photodynamic+therapy+with+meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin.</a> Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).</li>
<li>Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncologist%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy in oncology.</a> Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).</li>
<li>Burch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+canine+osseous+tumors+with+photodynamic+therapy%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي مصالح أو تضارب المصالح المالية المتنافسة.

لتحقيق السمسة الأمثل ردا على PDT، لا بد من اختيار الحق وإعدادات ضوء الليزر ومرات الحضانة. الإجراءات الموصوفة هنا هي متسقة وفعالة لتحديد امتصاص PS وقياس السمية الخلوية PDT يتسبب في المختبر. باستخدام موجات الامتصاص النوعي للPS mTHPC، يمكن تحديد امتصاص PS الخلوية بطريقة مباشرة، ويمكن تفعيل PS لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة للخلايا. باستخدام هذا الإعداد في المختبر، وجميع المعلمات مثل تركيز P...

الدولة اليوم من العلاج فن عظمية (OS)، ورم العظام الأولية، ويشمل مجموعة من المحافظين الجدد العلاج الكيميائي المواد المساعدة والجراحة. وكشف هذا نظام المعالجة زيادة في معدل بقاء المرضى الذين يعانون من مرض المترجمة من حوالي 20٪ قبل استخدام العلاج الكيميائي، لحاليا بين 60-70٪ 3، 4. ومع ذلك، في العقدين الأخيرين، فقد استقر على البقاء الإجمالي من المرضى يعانون من مرض OS المحلية 4، 5. علاوة على ذلك، 30-40٪ من هؤلاء المرضى الانتكاس في غضون 3 سنوات بعد التشخيص والاستمرار المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر أن يكون لها بقاء الفقراء من 20-30٪ 4، 6، 7. لتحسين نتائج هؤلاء المرضى، والحاجة إلى تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. العلاج الضوئي (PDT)، والعلاج المضادة للسرطان الرواية بدلا من ذلك، يستخدم ضوء طول موجة محددة لالإثارة من photosensitizer (PS)، التي تتراكم في الخلايا السرطانية بعد الحقن لها في مجرى الدم. ضوء الليزر الإثارة من PS يولد الجذور الأكسجين في وجود الأكسجين، مما يحفز رد فعل السامة للخلايا في الخلايا السرطانية وموت الخلايا. إلى جانب هذه الآلية الأولية، أثار إضافيتين PDT تسهم العمليات البيولوجية لانخفاض نمو الورم: PDT يسبب تضيق الأوعية وتكوين خثرة من الأوعية الدموية الدقيقة الورم، ونقص الأكسجة بالتالي المحلية ونقص الأكسجين داخل الورم، مما يؤدي إلى احتشاء الورم. أخيرا، أصيب PDT ويموتون الخلايا السرطانية يؤدي الى استجابة مناعية المحلية، وهي ميزة فريدة من نوعها بدلا من PDT. هذا ينطوي على نظام مكمل وتفعيل مستضد تقديم الخلايا الجذعية 8. وبالتالي، يتم تهيئة الظروف لعرض مستضدات الأورام مع تفعيل لاحقة من الخلايا اللمفاوية، مما يؤدي إلى الحصانة محددة الورم. حتى الآن، وقد استخدم لعلاج PDT عدة أنواع من أورام الأنسجة الرخوة وhyperplفي آسيا، مثل تقران سافع والمريء باريت، وأورام داخل القصبة، وسرطان المثانة، وسرطان الخلايا القاعدية، والمعالجة الملطفة لسرطان الرأس والرقبة 2. ومن المعروف أن العلاج للحث المحلية، على نطاق واسع نخر مع الآثار الجانبية قليلا فقط، وبالتالي لديه القدرة على القضاء بشكل انتقائي الأنسجة السرطانية. على الرغم من هذه المزايا، وتطبيق PDT لا تزال من الناحية الفنية أكثر تطلبا من إدارة المخدرات العلاج الكيميائي. من أجل تحقيق فعالية قصوى، وتركيز PS، وقت التعرض للضوء ومجموع نقل الطاقة الضوئية في حاجة إلى أن يكون الأمثل. ويمكن أن يتم ذلك في في التجارب المجراة، ولكن، نظرا لوجود عدد كبير من المعلمات النسبية التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل، وهو أكثر فعالية لتحديد الظروف المثلى في البداية في المختبر. في التجارب المذكورة أدناه، ونحن اختبار فعالية في المختبر من PDT باستخدام PS-5،10،15،20 tetrakis (الفوقية hydroxyphenyl) شيليأورين، يختصر mTHPC (الشكل 1A). mTHPC هو المادة الفعالة في المنتج الطبية Foscan، والذي يستخدم حاليا في العيادة لتلقي العلاج الملطفة لسرطان الرأس والرقبة. وهي واحدة من أقوى PS، الأمر الذي أدى تلف الخلايا الضخمة بالفعل في تركيزات منخفضة، وقد تبين أن تكون متفوقة على غيرها PS من حيث اختراق الأنسجة 9، 10. في امتصاص الضوء الطيف (الشكل 1B) يبين اثنين من قمم بارزة، واحد في 417 نانومتر، والثانية في 652 نانومتر، والتي تستخدم لتوطين الأنسجة تراكم PS وPDT الحث على التوالي. حاليا، صياغة الليبوسومال لmTHPC هي قيد التطوير. هنا، نحن تصف إجراءات لقياس الإقبال على هذه الصيغة الليبوسومال، وأداء PDT في اثنين من خطوط الخلايا OS الإنسان، وملتحقا النقيلي منخفضة والخلايا 143B النقيلي عالية. وقد تم الإبلاغ عن بعض البيانات المقدمة هنا في وقت سابق 11. النهج ه الموصوفة هنا تمكننا من دراسة تأثير النمط الظاهري المنتشر على PDT فعالية. 143B الخلايا، وحقن orthotopically في الأطراف الخلفية من المناعة الفئران SCID ناقصة يسبب الأورام الأولية المتفاقمة intratibial، نموذج محاكاة عن كثب مرض نقيلي الإنسان. وبالتالي، فإن التجارب في المختبر المقترحة هي مناسبة تماما لتقييم إعدادات PDT الأمثل لاستخدامها في وقت لاحق في التجارب المجراة.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA GmbH ، فرايبورغ ، ألمانيا</td><td>E15-883</td><td></td></tr><tr><td>HAM F12</td><td>PAA GmbH ، فرايبورغ ، ألمانيا</td><td>E15-817</td><td></td></tr><tr><td>مصل ربلة الساق الجنينية المعطلة</td><td>بالحرارة GIBCO ، بازل ، سويسرا</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>mTHPC</td><td>biolitec Research GmbH ، جينا ، ألمانيا</td><td></td><td>لأن هذه التركيبة الشحمية تنشأ من R & D لا يوجد رقم كتالوج متاح في الوقت الحالي. مخزون: 1.5 مجم / مل ؛ متوفر في خليط 9: 1 من ثنائي بالميتويل فوسفاتيديل كولين (DPPC) وثنائي بالميتويل فوسفاتيديل جلسرين (DPPG ؛ نقاء >99٪)</td></tr> <tr><td>قارئ لوحة Spectramax Gemini XS</td><td>الأجهزة الجزيئية ، Sunnyvale ، CA</td><td>ID # 861</td><td></td></tr><tr><td>مجهر Zeiss Observer.Z1</td><td>Axio Observer ، Axio Vision الإصدار 4.6.3 SP1 ، جينا ألمانيا</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceralas PDT 652 نانومتر ليزر</td><td>biolitec AG ، جينا ، ألمانيا</td><td>LD652nm2W400u</td><td></td></tr><tr><td>كاشف التيترازوليوم القابل للذوبان في الماء (WST)</td><td>Roche Diagnostics AG ، روتكروز ، سويسرا</td><td>1644807</td><td></td></tr></tbody></table>

السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية<em&gt; في المختبر</em

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

في السنوات الأخيرة، كان هناك صعوبة في إيجاد علاجات أكثر فعالية ضد السرطان مع أقل آثار جانبية جهازية. بالتالي العلاج الضوئي هو نهج جديدة لعلاج أكثر انتقائية الورم. العلاج الضوئي (PDT) أن يجعل من استخدام الضيائي غير سام (PS)، والتي، على تفعيل مع ضوء طول موجة محددة في وجود الأكسجين، وتولد الجذور الأكسجين التي تثير استجابة السامة للخلايا 1. على الرغم من موافقتها منذ ما يقرب من عشرين عاما من قبل ادارة الاغذية والعقاقير، وتستخدم في الوقت الحاضر PDT فقط لعلاج عدد محدود من أنواع السرطان (الجلد والمثانة) وأمراض nononcological (الصدفية، تقران سافع) 2. والميزة الرئيسية لاستخدام PDT هو القدرة على إجراء المعالجة المحلية، والذي يمنع الآثار الجانبية الجهازية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح علاج الأورام في مواقع حساسة (مثلا حول الأعصاب أو الأوعية الدموية). هنا، وهو intraoperatويعتبر تطبيق إيف من PDT في عظمية (OS)، ورم العظام، لاستهداف أقمار الورم الرئيسي خلفها الورم في الأنسجة المحيطة بعد استئصال الورم الجراحية. يهدف العلاج إلى تقليل عدد تكرار وإلى الحد من المخاطر ل(بعد عملية) ورم خبيث. في هذه الدراسة، فإننا نقدم في المختبر إجراءات PDT لإنشاء إعدادات PDT الأمثل لعلاج فعال من خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع OS التي تستخدم لإنتاج الأمراض التي تصيب البشر في نماذج الماوس OS intratibial راسخة. تم فحص امتصاص للPS mTHPC مع وأثار طيفي والضيائية مع ضوء الليزر الإثارة من mTHPC في 652 نانومتر للحث على موت الخلايا المقررة مع WST-1 فحص وفرز الخلايا على قيد الحياة. تقنيات إنشاء تمكننا من تحديد إعدادات PDT الأمثل للدراسات المستقبلية في النماذج الحيوانية. فهي أداة سهلة وسريعة لتقييم فعالية PDT <em&gt; في المختبر قبل تطبيق في الجسم الحي.

مع تقنيات ذكرت هنا، ونحن التحقيق PDT مقرها mTHPC في خلايا OS الإنسان. أولا، تم التحقيق في الوقت وامتصاص الجرعة تعتمد على mTHPC في ملتحقا النقيلي منخفضة والمنتشر في غاية خطوط الخلايا 143B OS. يمكن تقييم mTHPC امتصاص عن طريق قياس مضان من mTHPC مع معمل مضان (الشكل 2، مستنسخة بإذن من ريدي وآخرون 11). ويوضح الشكل 2A امتصاص mTHPC بطريقة تعتمد الوقت. كثافة مضان لتعليق الخلية يمثل مستويات الخلايا من mTHPC. يوضح الشكل 2B</strong...

بروتوكول ذكرت هنا يسمح تقييم فعالية العلاج الضوئي (PDT) في خطوط الخلايا وتعظيم الاستفادة من إعدادات PDT قبل تطبيق العلاج في النماذج الحيوانية.

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار الفعالية السامة للخلايا للعلاج الضوئي الديناميكي في خلايا الساركوما العظمية. يتم تحقيق ذلك عن طريق قياس امتصاص المحسس الضوئي M-T-H-P-C داخل الخلايا بواسطة خلايا الساركوما العظمية. في الخطوة الثانية ، يتم تطبيق ضوء الليزر على الخلايا لتنشيط M-T-H-P-C وإنتاج جذور الأكسجين السامة للخلايا.أخيرا ، يتم قياس عملية التمثيل الغذائي للخلية وعدد الخلايا بواسطة اختبار رباعي أوليوم واحد قابل للذوبان في الماء أو اختبار WST واحد. في النهاية ، يمكن استخدام اختبار WST ، بالإضافة إلى العد المباشر للخلايا ، لقياس السمية الخلوية للعلاج الضوئي الديناميكي على خلايا الساركوما العظمية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج الساركوما العظمية لأنها تسمح بقياس فعالية العلاج الضوئي الديناميكي في المختبر وتشبه التقنية المستخدمة حاليا في المرضى.لمقارنة امتصاص M-T-H-P-C بين خطوط خلايا الساركوما العظمية ، ابدأ بالطلاء 0.2 في 10 إلى Hoss السادس و 143 خلية B لكل بئر. في ثلاث نسخ في ستة ألواح آبار ، دع الخلايا تلتصق بين عشية وضحاها بطلاقة مشتركة تتراوح من 80 إلى 90٪ ، ثم في اليوم التالي ، احتضان الخلايا بتركيز ثابت من M-T-H-P-C لفترات زمنية مختلفة في الظلام لتقييم امتصاص الخلايا المعتمد على الوقت للحساسس الضوئي. بعد الحضانات ، قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS ، ثم افصل الخلايا ب 0.5 مل من التريبسفي EDTA وعده.بعد ذلك ، قم بتدوير الخلايا لمدة خمس دقائق عند 400 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة. استنشق الوسط وأعد تعليق الحبيبات في PBS إلى كثافة نهائية مرتين في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من 96.لوحة جيدة وقياس مضان الخلايا في مقياس الطيف الضوئي الفلوري ضبط على 417 نانومتر إثارة ، وانبعاث 652 نانومتر. ثم قم بإعداد منحنى قياسي عن طريق طلاء 100 ميكرولتر من صفر إلى أربعة ملليغرام لكل ملليتر من تركيزات M-T-H-P-C بثلاث نسخ. في صفيحة 96 بئر وقياس التألق كما هو موضح للتو لتوليد منحنى قياسي لحساب وحدة التألق النسبية لكل خلية تحتوي على بئر من اللوحة المقاسة مسبقا.لقياس السمية الضوئية لمحسس الضوء ، قم أولا بزرع 3000 خلية لكل بئر بثلاث نسخ لكل تركيز M-T-H-P-C في 96 لوحة بئر ، بما في ذلك خلايا التحكم في السمية الداكنة لكل تركيز PHOTOSENSITIZER. دع الخلايا تلتصق بين عشية وضحاها بطلاقة مشتركة تتراوح بين 50 و 60٪ في اليوم التالي. احتضان الخلايا بمجموعة من تركيزات M-T-H-P-C في الظلام لمدة خمس ساعات بعد الحضانة.قم بشفط الوسط وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS وأضف وسائط جديدة بدون M-T-H-P-C ثم خاصة بطيف امتصاص M-T-H-P-C ، مع ارتداء حماية مناسبة للعين. اضبط ليزر الصمام الثنائي 652 نانومتر على طاقة 21.88 مللي واط لكل سنتيمتر مربع على ارتفاع 13.5 سم. المسافة من الخلايا للحصول على جرعة طاقة قدرها خمسة جول لكل سنتيمتر مربع.ثم قم بإضاءة الخلايا باستثناء خلايا التحكم في السمية المظلمة لمدة 230 ثانية بعد الإضاءة. احتفظ بالخلايا في الظلام عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من الوزن ، كاشف واحد لكل 100 ميكرولتر من المتوسط بعد ثلاث ساعات من إضافة الكاشف الواحد ، وقياس امتصاص الآبار الفردية عند 415 نانومتر.أخيرا ، احسب عدد الخلايا الباقية بالإضافة إلى اختبار WST الواحد. العد المباشر للخلايا هو طريقة ثانية لقياس سمية الخلايا. لحساب النسبة المئوية للخلايا القابلة للحياة ، قم بالبذور مرتين في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل بئر في 2 24 صفيحة بئر واتركها تلتصق طوال الليل.في اليوم التالي ، احتضن الخلايا لمدة خمس ساعات في الظلام باستخدام M-T-H-P-C وأضيئها كما هو موضح للتو. احتفظ بخلايا التحكم المظلمة في الظلام بعد 24 ساعة ، واجمع المادة الطافية ، واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وعيون التربسين ، وأخيرا قم بتدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الوسط الطازج للعد. تظهر النتائج الموضحة في هذا الرسم البياني في اللوحة العلوية امتصاص M-T-H-P-C بطريقة تعتمد على الوقت مع شدة مضان لتعليق الخلية الذي يمثل المستويات داخل الخلايا ل M-T-H-P-C.في اللوحة السفلية. يمكن تقييم امتصاص M-T-H-P-C المعتمد على الجرعة عن طريق قياس مضان M-T-H-P-C باستخدام مقياس الطيف الضوئي الفلوري. يوضح هذا الرسم البياني امتصاص تركيز ثابت ل M-T-H-P-C بطريقة تعتمد على الوقت مع شدة التألق لتعليق الخلية التي تمثل المستويات داخل الخلايا ل M-T-H-P-C.في هذا الرسم البياني ، يتم توضيح امتصاص M-T-H-P-C المعتمد على الجرعة في Haass و 143 خلية B بعد حضانة لمدة خمس ساعات. كان الامتصاص في خط الخلية النقيلي العالي 143 B أعلى بكثير مما كان عليه في خط الخلية المضيفة الأبوية النقيلي المنخفض. يتم توضيح السمية الداكنة المعتمدة على الجرعة لخلايا الساركوما العظمية.تمت معالجة 143 خلية بائية بجرعات مختلفة من M-T-H-P-C ومقارنتها بالخلايا غير المعالجة ولوحظ انخفاض يعتمد على الجرعة في نشاط التمثيل الغذائي وعدد الخلايا المقاس بواسطة اختبار WST واحد. تم التعرف على انخفاض قابلية الخلية للبقاء عند تركيز M-T-H-P-C يساوي ويزيد عن 2.5 ميكروغرام لكل مليلتر. في الرسم البياني السفلي ، يتم توضيح السمية المعتمدة على الجرعة ل M-T-H-P-C.عولجت الخلايا بجرعات مختلفة من M-T-H-P-C وإضاءة لاحقة بمعدل خمسة جول لكل سنتيمتر مربع. لوحظ انخفاض تبعي في نشاط التمثيل الغذائي للخلايا بالإضافة إلى انخفاض في عدد الخلايا. مهد تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال بيولوجيا السرطان لتطبيق هذه الأساليب على نماذج الساركوما العظمية في الجسم الحي وكذلك للفحوصات قبل السريرية الأخرى.

cytotoxic-efficacy-photodynamic-therapy-osteosarcoma-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

الطب

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو طريقة غير جراحية وغير جراحية لعلاج سرطان الرئة. تتراكم المحسسات الضوئية بشكل انتقائي في أنسجة الورم وتؤدي إلى موت الخلايا السرطانية في وجود الأكسجين والطول الموجي المناسب للضوء. في فيديو البروتوكول هذا ، يتم استخدام الطريقة المستندة إلى PDT لتقييم الإمكانات السامة للضوء لمحسس ضوئي محتمل في خلايا سرطان الرئة.

فحص السمية الضوئية في المختبر: طريقة قائمة على PDT لتقييم الإمكانات السمية الضوئية لمحسس الضوء في خلايا سرطان الرئة

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو طريقة غير جراحية وغير جراحية لعلاج سرطان الرئة. تتراكم المحسسات الضوئية بشكل انتقائي في أنسجة الورم وتؤدي إلى موت الخلايا السرطانية في وجود الأكسجين والطول الموجي المناسب للضوء. يصف هذا الفيديو تحليل الفعالية المضادة للورم في الجسم الحي باستخدام المحسس الضوئي الذي يحتوي على جزيئات نانوية في فأر حامل للورم ، لتحديد الإمكانات السامة للضوء للحساسات الضوئية.

تحليل الفعالية المضادة للأورام في الجسم الحي ل PDT: تقنية لتحديد الإمكانات السامة للضوء لمستشعر بالضوء في الفئران الحاملة للورم

هنا ، يتم استخدام المراقبة في الوقت الفعلي لعملية التمثيل الغذائي للخلايا السرطانية ، جنبا إلى جنب مع نموذج الغشاء المشيمي آلانتوي لجنين الدجاج في الجسم الحي (CAM) للورم الخبيث ، لتقييم الأهداف / العوامل الجديدة المضادة للسرطان لقدرتها على توعية الخلايا السرطانية بالعلاج الكيميائي الضار بالحمض النووي.

تقييم فعالية سرطان المخدرات توعية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو خيار بديل لعلاج سرطان الرئة. لزيادة التأثير العلاجي ل PDT ، تم تطوير جزيئات نانوية تستهدف سرطان الرئة جنبا إلى جنب مع العلاج الكيميائي. تم تقييم كل من الكفاءة المضادة للسرطان في المختبر وفي الجسم الحي ل PDT مع الجسيمات النانوية المحضرة.

المضادة للسرطان فعالية من العلاج الضوئي مع النانوية المستهدفة السرطان والرئة

الحقن المباشر حويصلات خارج الخلية المستمدة من السرطان (EVs) ويؤدي إلى إعادة برمجة نخاع العظام دعم تطور الورم؛ ومع ذلك، الخلايا التي تتوسط هذا التأثير غير واضح. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق EV بوساطة الخلايا الجذعية الورم الوسيطة (MSC) التفاعلات في فيفو، يكشف عن دور حاسم للمتعلمين EV MSCs في ورم خبيث.

نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة

العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) هو إجراء طبي ينطوي على الحضانة لمناشئ التطبيقية محسس ضيائي (PS) تليها فوتواكتيفيشن الضوء المرئي للحث على المبرمج. نقدم بروتوكولا في المختبر التوقيت الصيفي الباسفيكي مصممة لمحاكاة التوقيت الصيفي الباسفيكي التي يمكن استخدامها لدراسة الاختلافات في حضانة PS والمعلمات ضوء العلاج.

نهج في المختبر للعلاج الضوئي

يصف البروتوكول الحالي حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد نماذج الفئران التي تحمل الساركوما العظمية العظمية وآفات الانبثاث الرئوي.

حقن الساركوما العظمية داخل الظنبوب لتوليد الساركوما العظمية العظمية ونماذج الفئران الخبيثة الرئوية

هنا ، نصف جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بنجاح في المختبر باستخدام ثقافة خلايا HeLa ثنائية الأبعاد و verteporfin كحساس للضوء.

جهاز علاج ضوئي ديناميكي مدمج وقائم على الصمام الثنائي الباعث للضوء لتعزيز السمية الخلوية للفيرتيبورفين في نموذج زراعة الخلايا 2D

يقدم هذا البروتوكول مجموعة من التجارب المعتمدة لتقييم الببتيدات المضادة للسرطان القابلة للتبديل الضوئي ، والتي يمكن استخدامها في الفحص قبل السريري لهذه المركبات. وهذا يشمل تقييم السمية الخلوية في مزارع الخلايا 2D و 3D ، وتقييم كفاءة الأيزوميرة الضوئية خارج الجسم الحي (الأنسجة النموذجية) ، وفعالية الجسم الحي .

التقييم في المختبر وفي الجسم الحي للمركبات النشطة بيولوجيا التي يتم التحكم فيها ضوئيا - الأدوية المرشحة المحتملة للسرطان علم الأدوية الضوئية

يصف البروتوكول الحالي طريقة إنشاء نموذج فأر xenograft (PDX) مشتق من المريض باستخدام أنسجة الساركوما العظمية البشرية.

إنشاء نموذج فأر Xenograft مشتق من المريض مع أنسجة الساركوما العظمية البشرية

اكتشف فعالية العلاج الضوئي في خلايا الساركوما العظمية باستخدام المستحضر الضوئي M-T-H-P-C. يقيس هذا البروتوكول امتصاص الخلايا للمستحضر والسمية الخلوية بعد التنشيط بالليزر.

السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية

استكشف المزيد من الفيديوهات