رصد الجمعية ليفرز البكتيرية الفوعة عن طريق عامل يشابك بمواقع محددة

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص ديناميكيات تفاعلات البروتين البروتيني داخل الخلية الحية. يتم تحقيق ذلك من خلال التعبير أولا عن بروتين مثير للاهتمام في الإشريكية القولونية ، ودمج الحمض الأميني التناظري بنزويل فينيل ألانين في البروتين في موقع معين وإجراء وضع العلامات الراديوية لمطاردة النبض لتمييز مجموعة صغيرة من جزيئات البروتين المركبة بشكل متزامن. كخطوة ثانية.

تشعيع أجزاء الخلايا التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة أثناء المطاردة لتحفيز تكوين روابط تساهمية بين البروتين محل الاهتمام وأي عوامل يتفاعل معها. البروتينات التالية هي ترسيب مناعي بأجسام مضادة محددة ويتم حلها عن طريق الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد SDS من أجل تحديد العوامل المتفاعلة ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر التغيرات في التفاعلات بين البروتين محل الاهتمام والعوامل الأخرى داخل الخلايا بمرور الوقت بناء على التغيرات في الحركة الكهربية لمنتجات الربط المتقاطع. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل الترسيب المناعي المشترك أو الربط الكيميائي المتقاطع ، هي قدرتها على توليد معلومات زمنية حول التفاعلات التي تحدث بين بقايا معينة في بروتين محل اهتمام وجزيئات أخرى.

هذه البيانات ذات قيمة خاصة عند دراسة تطور البروتين من خلال مسار تجميع متعدد الخطوات وتحديد وسيطات التجميع. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تحسينها للاستخدام في الإشريكية القولونية ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا في أنظمة أخرى ، بما في ذلك البكتيريا والخميرة وخلايا الثدييات الأخرى. يمكن العثور على تفاصيل إعداد الثقافة في بروتوكول النص.

قم بإعداد خمسة ملليلتر من M تسعة وسط يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، وجميع الأحماض الأمينية el باستثناء الميثيونين والسيستين والمضادات الحيوية تبدأ الثقافات بين عشية وضحاها عن طريق إضافة الإشريكية القولونية المحولة مع البلازميد الذي يشفر للبروتين محل الاهتمام مع طفرة العنبر والبلازميد الذي يشفر لنظام قمع العنبر يحتضن عند 37 درجة مئوية. في يوم التجربة ، أضف كمية مناسبة من الخلايا من الثقافة الليلية إلى قارورة إرلينماير سعة 250 مليلتر تحتوي على 50 مل من متوسط M تسعة ومضادات حيوية للحصول على كثافة بصرية عند 550 نانومتر من 0.03. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مهتز.

عندما تصل الثقافات إلى مرحلة السجل المبكرة إلى المتوسطة ، أضف 50 ميكرولترا من بنزويل فينيل ألانين أو BPA إلى كل مزرعة. أضف BPA قطرة واحدة في كل مرة أثناء تحريك القارورة لتجنب هطول الأمطار. بعد ذلك ، أضف أي محفزات مطلوبة لدفع التعبير عن متحور الكهرمان.

استمر في احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية خلال فترة الحث البالغة 30 دقيقة. قم بتسمية ستة أنابيب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر يمكن التخلص منها مع النقطة الزمنية وإما بالإضافة إلى الأشعة فوق البنفسجية أو ناقص الأشعة فوق البنفسجية. ضع الأنابيب الملصقة على الجليد.

ضع صفيحة ثقافة من ستة آبار فوق دلو ثلج ثان مملوء بالثلج. قم بتشغيل مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبل خمس دقائق من وضع العلامات اللاسلكية. ثم أضف ما يقرب من ملليلترين من الثلج إلى كل أنبوب يسمى ناقص الأشعة فوق البنفسجية وإلى اثنين من الآبار في اللوحة متعددة الآبار.

من الضروري تهوية الجليد مباشرة في الأنابيب والآبار لإيقاف التفاعلات داخل الخلايا على الفور في كل نقطة زمنية وبالتالي الحصول على لقطة دقيقة للمسار الكيميائي الحيوي في نهاية فترة الحث البالغة 30 دقيقة. انقل 25 مل من المزرعة إلى قارورة إرلينماير سعة 125 ملليلتر يمكن التخلص منها مسبقا. ضع القارورة في حمام مائي مهتز 37 درجة مئوية.

يجب تنفيذ خطوات وضع العلامات على مطاردة النبض والإشعاع بالأشعة فوق البنفسجية في الوقت المناسب وتتطلب تنظيما كبيرا وإعدادا متقدما أضف 30 ميكرو كوري لكل مليلتر من S 35 المسمى الميثيونين والسيستين إلى المزرعة وقم بتحريكها بسرعة لخلطها في الوقت المناسب. دقيقة واحدة صفر ثانية.

أضف 250 ميكرولتر من محلول ميثيونين سيستين غير مشع 100 مللي مولار وقم بتحريكه بسرعة. لخلط الماصة على الفور أربعة ملليلتر من المزرعة في أحد آبار الصفيحة المبردة متعددة الآبار التي تحتوي على ماصة ثلجية ، هناك أربعة ملليلتر ثانية في أنبوب سعة 15 مليلتر يسمى صفر دقيقة مطروحا منه الأشعة فوق البنفسجية في كل مرة. دقيقتان وصفر ثانية.

ماصة أربعة ملليلتر من الثقافة في بئر ثان من الصفيحة المبردة متعددة الآبار التي تحتوي على الثلج. ثم قم بعمل أربعة ملليلتر أخرى في أنبوب سعة 15 مليلتر يسمى دقيقة واحدة ناقص الأشعة فوق البنفسجية مباشرة قبل النقطة الزمنية الخمس دقائق عند حوالي ملليلترين من الجليد إلى بئر ثالث في الصفيحة متعددة الآبار في بعض الأحيان ست دقائق وصفر ثانية. ماصة أربعة ملليلتر من الثقافة في البئر الثالث من الصفيحة المبردة متعددة الآبار التي تحتوي على أنبوب ثلج.

كان أربعة ملليلتر أخرى في أنبوب 15 مليلتر يسمى خمس دقائق ناقص الأشعة فوق البنفسجية. ضع دلو الثلج مع اللوحة متعددة الآبار أسفل مصباح الأشعة فوق البنفسجية المسخن مسبقا وقم بإشعاع كل عينة على حدة لمدة أربع دقائق. انقل الخلايا إلى أنابيب مبردة سعة 15 مليلتر تحمل علامة صفر دقيقة بالإضافة إلى الأشعة فوق البنفسجية ، ودقيقة واحدة بالإضافة إلى الأشعة فوق البنفسجية وما إلى ذلك.

ثم خلايا الطرد المركزي عند 2 ، 500 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. أعد تعليق كل عينة في 300 ميكرولتر من M تسعة وسط أو PBS و 33 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك البارد بنسبة 100٪ أو TCA لترسيب البروتينات التي يترسب بها TCA في fuge دقيق بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق. قبل إزالة السات، أضف 50 ميكرولترا من محلول الذوبان إلى كل عينة وقم بتسخينه مع التحريك عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإذابة البروتين المترسب.

بعد إضافة مليلتر واحد من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الراديوي ، يقوم بإجراء ترسبات مناعية قياسية باستخدام خمس إلى نصف كل عينة. قم بحل البروتينات المترسبة المناعية عن طريق كبريتات ESAL الصوديوم أو الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد أو صفحة SDS. أخيرا ، قم بتعريض المواد الهلامية الملطخة والمجففة لشاشة فوسفو طوال الليل وللكشف عن البروتينات المشعة بما في ذلك منتجات الربط المتقاطع مع جهاز تصوير الفوسفو تم استخدام الربط المتقاطع للصور الخاصة بالموقع لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع ESPP أثناء رحلتها إلى الغشاء الخارجي.

في هذه التجربة ، تم استبدال أكواد ألانين الأس الهيدروجيني في المخلفات 1113 و 1214 من مجال بيتا ESPP بكدونات العنبر. يظهر التركيب البلوري لمجال ESPP beta أن البقايا كلاهما على الجانب المحيط بالبلازمي من برميل بيتا ، مفصولين بحوالي 120 درجة. تم ترسيب اثنين من عديد الببتيدات المختلفة من كل من الخلايا المشعة والخلايا الضابطة بواسطة الطرف C المضاد ل ESPP والمصل.

في البداية ، ساد شكل سلائف يبلغ حوالي 135 كيلودالتون من البروتين الذي يحتوي على مجالات الركاب وبيتا المرتبطة تساهميا في نقاط زمنية لاحقة. انخفض مستوى PRO ESPP وبدأ مجال بيتا المجاني في الهيمنة حيث كان مجال الركاب موجودا عبر الغشاء الخارجي وفصله عن مجال بيتا بواسطة انقسام محلل للبروتين. ومع ذلك ، من الواضح أن العينات المشعة للأشعة فوق البنفسجية الأولى تحتوي على نطاقات وزن جزيئي أعلى لم تكن موجودة في عينات التحكم.

تنتج هذه النطاقات عن الارتباط المتبادل ل PRO ESPP بالبروتينات المتفاعلة بناء على حركة هذه الببتيدات ، وتم تقدير أحجام البروتينات المتفاعلة لاختبار ما إذا كانت قد تتوافق مع عوامل تجميع بروتين الغشاء الخارجي المعروفة. تم إجراء ترسبات مناعية إضافية باستخدام مضاد سيرا تم إنشاؤه ضد الشركاء المتفاعلين المفترضين. يمكن أن يكون عديد ببتيد 150 كيلودالتون تقريبا الذي لوحظ عند دمج BPA في كل من المخلفات 1113 و 1214 مترسبا مناعيا باستخدام مصل مضاد ضد تخطي مرافق البلازما 17 كيلودالتون.

علاوة على ذلك ، وجدنا أن عديد الببتيدات الأكبر حجما التي لوحظت عند دمج BPA في واحد فقط من الموضعين يمكن أن تكون مترسبة مناعية مع anticera ضد الوحدات الفرعية المعقدة BAM ، BAM B و BAM D على التوالي. بعد تنفيذ هذا الإجراء ، يمكن تنقية منتجات الربط المتقاطع ويمكن إجراء طرق أخرى بما في ذلك قياس الطيف الكتلي للمساعدة في تحديد العوامل التي تتفاعل مع البروتين ذي الأهمية. بعد المشاهدة بالفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الجمع بنجاح بين وضع العلامات على مطاردة النبض والربط المتقاطع للصور الخاصة بالموقع لدراسة ديناميكيات تفاعل البروتين الخاص بك ، والتي تهم الجزيئات الأخرى داخل الخلية الحية.