وهناك طريقة توسيع المركب-ينطبق على مجاميع من العصبية الجذعية البشرية والخلايا المشتقة من الخلايا السلف الجذعية المحفزة أو الجنين أنسجة المخ

الهدف العام من التجربة التالية هو تمرير المجالات العصبية بكفاءة بحيث يتم الحفاظ على الاتصال بين الخلايا والخلية طوال عمر الخلايا المستنبتة. تخلق هذه التقنية ظروف التمدد المطلوبة للخلايا السلفية العصبية البشرية. يتم تحقيق ذلك من خلال الجمع بين ما يصل إلى قارورتين T 1 75 من نفس الخلايا ، ونقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل ، مما يسمح بنقل الكرات إلى طبق بتري كخطوة ثانية مكثفة إلى المجالات العصبية المعلقة في كتلة يمكن التحكم فيها على طبق بتري ، مما يسمح للشفرة بتقطيع H NPCs إلى مجموعات صغيرة.

بعد ذلك ، يتم إعادة تعليق المجالات العصبية التي تم تمريرها أو تقطيعها من أجل إزالة الخلايا من طبق بتري ووضعها في القوارير الجديدة. تم الحصول على النتائج التي تظهر أن تقنية التقطيع توفر استراتيجية نمو طويلة الأجل تعتمد على منحنيات التمدد التي توضح معدلات نمو لوغاريتمية طويلة الأجل مقارنة بالخلايا التي تمر عبر النهج الأنزيمي القياسي. يعد العرض المرئي لهذه التقنية أمرا بالغ الأهمية كمجال.

يصعب وصف خطوات التكثيف كتابة. هناك أيضا العديد من الحيل للمساعدة في هذه العملية. إذا لم تتم إزالة الوسائط الزائدة بالكامل من طبق بتري ، دفع الكرات ببساطة في الوسائط بدلا من تقسيمها إلى مجموعات أصغر.

ابدأ هذا الإجراء بمعالجة لون الوسائط لقارورة H NPCs. امسح ضوئيا من خلال القارورة تحت المجهر لمراقبة الخلايا. إذا أمكن ، استخدم جذرا لفحص حجم عدة مجالات.

إذا كان قطر العديد من الكرات 300 ميكرومتر أو أكثر ، فتابع عملية التقطيع وقم بتقطيع الخلايا كل سبعة إلى 10 أيام. ثم ضع القارورة مرة أخرى في الحاضنة وقم بإعداد المروحية. قم بتشغيل مفتاح الطاقة في المروحية.

في BSC ، اضبط سمك التقطيع على 200 ميكرومتر وقوة الشفرة على 180 درجة أو موضع الساعة التاسعة. بعد ذلك ، تأكد من تدوير مقبض السرعة التلقائي في اتجاه عقارب الساعة قدر الإمكان. ثم حرك مقبض تحرير الطاولة إلى أقصى اليمين قدر الإمكان ، وتأكد من استقرار حامل اللوحة.

قم بتدوير مناور الذراع اليدوي في اتجاه عقارب الساعة لرفع الذراع إلى أقصى مستوى له. بعد ذلك ، انقل شفرة تقطيع معقمة ذات حدين على مسمار ذراع المروحية. باستخدام زوج من الملقط ، ضع المشبك فوق الشفرة باستخدام الملقط.

يجب أن يكون الجزء المنحني من المشبك فوق الحافة العلوية للذراع. بعد ذلك ، أمسك المشبك على الذراع وقم بتثبيت الجوز على الترباس. مع ترك سائق الجوز المعقم الجوز ربع يتحول إلى فضفاضة.

في هذا الإجراء، قم بنقل الكمية المقترحة من وسائط الصيانة إلى القارورة الجديدة. بعد ذلك ، انقل الخلايا من الحاضنة إلى BSC. اتكئ القارورة على رف أنبوبي واترك الكرات تستقر في القارورة.

استقر أحدهم. يطمح إلى 12 مل من المادة الطافية. باستخدام ماصة مصلية سعة 10 ملليلتر، اشطف جميع الكرات الملتصقة بشكل فضفاض من سطح القارورة.

كرر حسب الضرورة واترك الكرات تستقر بين رينس. بعد ذلك ، انقل الحجم المقترح من الوسائط المكيفة إلى القارورة الجديدة. ثم انقل جميع الوسائط والكرات المكيفة المتبقية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلترا.

اسمح للكرات بالاستقرار والتخلص من القارورة المستخدمة. بعد ذلك ، انقل الخلايا ببطء من الأنبوب المخروطي سعة 15 مليلتر إلى طبق بتري 60 ملم أو قرص الرقائق بأقل حجم ممكن. احتفظ بالوسائط المكيفة المتبقية حيث سيتم استخدامها لشطف الخلايا من فرم الطبق.

حاول تقليل مساحة السطح التي تغطيها الوسائط والكرات الموجودة على الطبق. بعد ذلك ، ابدأ في تكثيف حوض الكرة عن طريق نقل السوبر ناتين مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 ملليلترا. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط من الجزء العلوي من تجمع خلايا الوسائط باستخدام ماصة دقيقة مائلة بحاجز الهباء

حتى يتعذر إزالة الوسائط بدون كرات ، ثم انشر المسبح. باستخدام جانب طرف الماصة لزيادة مساحة السطح، اقلب طبق بتري قليلا واستخدم جانب طرف الماصة لتحريك جميع الكرات برفق إلى جانب واحد من البركة. بعد نقل جميع الخلايا ، قم بقلب طبق بتري ببطء إلى الاتجاه المعاكس للسماح للوسائط بالانفصال عن المجالات.

بعد ذلك ، انقل الوسائط التي تم تطهيرها مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. استخدم جانب طرف الماصة لتحريك جميع الكرات برفق إلى منتصف طبق بتري. لذلك يبلغ قطر المسبح من 0.5 إلى 2.4 سم.

من المهم الحفاظ على عمق حوض الكرة ضحلا. إذا كان المسبح عميقا جدا ، دفع الكرات جانبا أثناء التقطيع. الآن ، انقل طبق بتري إلى حامل اللوحة وثبته أسفل خطافات حامل اللوحة.

استخدم مقبض تحرير الطاولة لتحريك حامل اللوحة إلى اليسار بحيث تكون الشفرة خالية من الكرات ومثبتة في الترس. بعد ذلك ، قم بخفض ذراع المروحية عن طريق تدوير مقبض المناور اليدوي في اتجاه عقارب الساعة حتى تستقر الشفرة بشكل مسطح على طبق بتري. اضغط لأسفل على حامل الذراع أثناء شد الجوز.

ثم اضغط على زر إعادة الضبط. بمجرد تثبيت طبق بتري بيد واحدة أثناء تدوير مقبض مناور الذراع الأوتوماتيكي في اتجاه عقارب الساعة إلى موضع الساعة 90 أو 12 وابدأ في التقطيع عند تقطيع جميع المجالات. قم بتدوير حامل اللوحة 90 درجة.

ثم قم بفك البرغي ، وخفض الذراع وإعادة شد الجوز. كرر إجراء التقطيع. بعد ذلك ، انقل طبق بتري من حامل اللوحة إلى مساحة عمل في BSC.

انقل ملليلترا واحدا من الوسائط المكيفة على الكرات المفرومة. ثم قم بتعليق الكرات المفرومة برفق ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. حاول تجنب تكوين الفقاعات وكرر عدة مرات حسب الضرورة لجمع الكرات المفرومة.

قم بقياس حجم الوسائط المكيفة والكرات المفرومة. أضف الكمية المناسبة من وسائط الصيانة لتحقيق الحجم المقترح في العمود الثاني في الجدول الثاني E.بعد ذلك ، يقوم Eloqua بتعليق الكرة في كل قارورة جديدة فقط بنقل تعليق المجال إلى قارورة واحدة في كل مرة وإعادة تعليق المجالات بين عمليات النقل. يجب أن يساوي الحجم النهائي في كل قارورة الحجم المقترح في الجدول الثاني العمود F.ضع h-NPCs المفرومة في الحاضنة.

يوضح هذا الشكل أرقام الخلايا المتوقعة لغير قابلة للعب H المجمدة عند المقطع 19 ، ثم إذابتها وتوسيعها كطبقة أحادية ملتصقة باستخدام التفكك الأنزيمي مقارنة بالمجالات العصبية التي تمر عبر طريقة التقطيع. فيما يلي الصور التمثيلية للكرات المقطعة مسبقا واللاحقة عند تكبير 10 ×. تظهر هذه الصورة ممر ذوبان الجليد 29 H NPCs التي تم طلاؤها ليوم واحد وتلطيخها للعش والتعبير ، بينما تظهر هذه الصورة ممر ذوبان الجليد 29 H NPCs التي تم طلاؤها لمدة سبعة أيام في غياب عوامل النمو وملطخة ل GFAP و beta three tubulin.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام تقنية التقطيع الآلي لتمرير HBCs ، والتي تحافظ على اتصال الخلايا بالخلايا طوال حياة الخلايا والثقافة. يمكن تكييف هذا الإجراء مع العديد من أنواع الخلايا ، مثل الخلايا الجذعية العصبية المشتقة من الخلايا متعددة القدرات أو مجالات القلب.