التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية وتنظيم بروتينات الميتوكوندريا في C two. يتم تحقيق ذلك عن طريق إنشاء شبكة مجهر إلكتروني رطب مجمدة تحتوي على العينة. بعد ذلك ، يتم تسجيل سلسلة إمالة محدودة الجرعة من العينة في مجهر التبريد الإلكتروني.

ثم تتم معالجة سلسلة الإمالة لإنشاء حجم مقطعي. أخيرا ، يتم حساب متوسط كثافة البروتين لتحديد بنية البروتينات ويتم تقسيم الأغشية للكشف عن هيكلها ثلاثي الأبعاد. من خلال إعادة وضع متوسطات البروتينات مرة أخرى في توم جراهامز ، يتم الكشف عن بنية وتنظيم البروتينات في الغشاء.

لذلك نقوم بالتصوير المقطعي بالبكاء الإلكتروني للميتوكوندريا لأننا نريد أن نفهم كيفية عملها على المستوى الجزيئي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الأخرى ، مثل المجهر الإلكتروني للمقاطع البلاستيكية الرقيقة هي أن الدقة أعلى. لا يتم تثبيت المادة كيميائيا بأي شكل من الأشكال ، ويتم الحفاظ على التفاصيل الجزيئية للبروتينات.

يمكن أن تستغرق تقنية التصوير بالتبريد الإلكتروني بعض الوقت لإتقانها ، ولكن يمكن للمستخدمين ذوي الخبرة الحصول على خمسة إلى ستة أسباب TOM عالية الجودة لكل جلسة. أصعب جزء من الإجراء هو إنتاج شبكات رطبة مجمدة بسماكة جليدية مثالية بعد عزل الميتوكوندريا وتكويرها ، وفقا لبروتوكول النص ، استخدم 250 مليمولار T trioses في 10 ملليمولار HEPA عازلة لإعادة تعليق الحبيبات إلى تركيز حوالي خمسة ملليغرام لكل مليلتر من إجمالي تفريغ توهج البروتين. يقوم الكربون EM بالكامل بشبكات الكربون لأعلى في جهاز تفريغ وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، وتسييل بضعة ملليلترات من الإيثان عن طريق توجيه تيار من غاز الإيثان إلى الجانب الداخلي لحاوية الألمنيوم المبردة بالنيتروجين السائل.

استخدم زوجا من الملقط لالتقاط شبكة DM لتفريغ التوهج ووضعها على بروتين مزيج مقاعد البدلاء ، وهو تعليق إيماني ذهبي مترافق ، واحد لواحد مع تعليق الميتوكوندريا ، وقم بتطبيق ثلاثة ميكرولترات من المحلول على الفور على الشبكة. بعد ذلك ، ضع الملقط في جهاز تزجيج مثل المقصلة محلية الصنع مع إسفين من ورق الترشيح لمسح السائل الزائد من الشبكة وحرر الزناد لإغراق الشبكة على الفور في الإيثان السائل. ثم لنقل الشبكة من الإيثان السائل إلى النيتروجين السائل.

قم بإزالة الإيثان الزائد من الشبكة عن طريق وضع طرف إسفين ورق ترشيح جديد في الإيثان السائل. عندما يرتفع السائل ، اسحب الشبكة برفق لأعلى ورق الترشيح ، مع الاحتفاظ بها أسفل مقدمة السائل ، ثم انقلها على الفور إلى النيتروجين السائل لتخزينها لاستخدامها لاحقا. ضع الشبكة في صندوق شبكي وقم بتخزينها في مفاعل مملوء بالنيتروجين السائل لتسجيل سلسلة إمالة مقطعية.

ابدأ بالتأكد من أن فاعلي النيتروجين السائل ممتلئون ، وتأكد من أن درجة حرارة مرحلة العينة وجهاز نقل الشبكة أقل من 100 كلفن. تأكد من محاذاة المجهر الإلكتروني بشكل جيد من خلال الحصول على صورة لشبكة اختبار والتحقق من جودة حلقات الشوكة ، يجب أن تكون الحلقات المستديرة وتمتد إلى حافة الصورة. بعد ذلك ، أدخل شبكة مع الميتوكوندريا الرطبة المجمدة.

ثم في وضع البحث ، ابحث عن مناطق ذات سمك جليد مناسب وجودة العينة. التقط صورة بحث مدتها ست ثوان للمناطق الواعدة لتحديد مدى ملاءمة جمع البيانات. بعد تحديد موقع منطقة عينة جيدة ، قم بإمالة المرحلة زائد أو ناقص 60 درجة لتحديد الحد الأقصى لنطاق الميل المتاح دون إعاقة منطقة التعريض الضوئي أو التركيز بواسطة قضبان الشبكة أو بلورات الجليد على ثقب مملوء بالجليد قريب من نفس المظهر ، وقم بالتغيير إلى وضع التعريض وضبط شدة الشعاع أو وقت الحصول على الصورة.

لذلك تحتوي كل صورة مسجلة على جرعة إلكترونية من 30 إلى 50 إلكترونا لكل بكسل ل CCDs أو ستة إلى ثمانية إلكترونات لكل بكسل في الثانية. بالنسبة لكاشفات الإلكترون المباشرة ، احسب نسبة توزيع الجرعة أو I صفر على I 60 بقسمة متوسط عدد الإلكترونات لصورة ثانية واحدة تم الحصول عليها عند صفر درجة على صورة 60 درجة فوق ثقب فارغ. احصل على صورة ثانية واحدة في وضع التعريض ولاحظ عدد الإلكترونات لكل أنجستروم مربع.

مع الأخذ في الاعتبار نسبة توزيع الجرعة ، احسب العدد الإجمالي للصور وفاصل الإمالة الذي يمكن تسجيله لجرعة إلكترون إجمالية محددة باستخدام برنامج جمع البيانات التلقائي المناسب. قم بإعداد وتسجيل Tom Agram باستخدام المعلمات المحددة للتو النموذجية. بالنسبة لهذه العينات ، ابدأ من 20 درجة زائد أو ناقص وانتقل إلى الصفر قبل الوصول إلى الإمالة العالية.

لإنشاء تومو وتقسيم، قم بتحويل سلسلة الإمالة إلى تنسيق ملف مناسب لبرنامج إعادة البناء. باستخدام برنامج إعادة بناء Tom Graham مثل Im mod ، قم بمحاذاة الصور عن طريق تحديد موضع العلامات الإيمانية الذهبية. بمجرد المحاذاة ، قم بإنشاء Tommo Graham.

قم بتحسين تباين tommo Graham باستخدام مرشح صورة مثل مرشح الانتشار غير الخطي الموزع مع IM o للتصور. استخدم البرامج المتوفرة تجاريا لتقسيم Tom يدويا. قم بتعيين voxels المقابلة للغشاء الداخلي والخارجي لفصل الطبقات بمجرد تعيينها ، وإنشاء سطح لتصور الأغشية.

باستخدام خيار النقر في المكون الإضافي لحزمة EM ل emira ، حدد موقع جزيئات تخليق TP باستخدام الجسيمات المحددة كمدخلات وحزمة برامج مناسبة مثل تقدير الجسيمات. بالنسبة لبرنامج التصوير المقطعي الإلكتروني ، احسب متوسط agram لتقدير الدقة. احسب ارتباط غلاف البهو بين متوسطين فرعيين محددين بشكل مستقل باستخدام برنامج التصور المجاني.

يتناسب الوهم مع هياكل الأشعة السينية المعروفة في متوسط توم أغرام الفرعي يدويا أولا ، ثم تلقائيا مع ملاءمة الأمر كما هو موضح في هذا الشكل ، يكشف التجزئة اليدوية للأغشية في صرخة الإلكترون في الميتوكوندريا عن بنية كريستي في الميتوكوندريا. عن طريق تصوير الميتوكوندريا من سلالات الخميرة بالضربة القاضية التي تفتقر إلى بروتينات معينة. يمكن تقييم تأثير هذه البروتينات على مورفولوجيا كريستي.

يظهر هنا ميتوكوندريا من سلالة خميرة تفتقر إلى وحدة فرعية لتخليق TP E ، وهي مطلوبة لتشكيل ثنائيات توليف TP. على عكس لالا كريستي العادي من الميتوكوندريا البرية ، تحتوي هذه العضيات بدلا من ذلك على عدد من هياكل الغشاء الداخلية التي إما خالية من كريستي أو تحتوي على غزوات غشائية صغيرة على شكل بالون. في Ingrams ذات التباين الجيد ، يمكن رؤية ثنائيات TP Synthes بسهولة كما هو موضح هنا بواسطة رؤوس الأسهم الصفراء.

من خلال تقسيم الأغشية ، يمكن تصور موقع تخليق A TP الذي يمثله الآن الكرة الصفراء فيما يتعلق بمورفولوجيا كريستي. في هذه الحالة ، يشكل تخليق A TP صفوفا من الثنائيات على طول الحواف المنحنية للغاية لمتوسط Lo Meer Christi Sub tommo يسمح بتحديد هياكل البروتينات بدقة أربعة نانومتر أو أفضل. من خلال تركيب هياكل الأشعة السينية المعروفة في النماذج الذرية الفرعية لجراهام ، يمكن تجميع متوسط النماذج الذرية لمجمعات البروتين في بيئتها الأصلية كما هو موضح.

في هذا المثال ، يمكن إعادة متوسط الأحجام إلى Tomo Graham من أجل المساعدة في تنظيم المجمعات الفردية بالنسبة لبعضها البعض ومجمعات البروتين الأخرى في الغشاء. يوضح بروتوكولنا كيف يمكنك استخدام التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني لتحديد بنية وتنظيم مجمعات البروتين داخل غشاء الميتوكوندريا الداخلي. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لتحديد بنية وتنظيم البروتينات الأخرى المرتبطة بالغشاء داخل مقصورات خلوية مختلفة.

تحضير العينة هو المفتاح للحصول على مخططات حرارة جيدة. يجب أن تحتوي الشبكة الرطبة المجمدة على عيون زجاجية تماما بسمك 70 إلى 150 نانومتر. عادة ما نقوم بفحص خمس إلى ست شبكات حتى تجد مساحة ذات سمك جليدي مثالي وجودة العينة.

بالنسبة لجمع الجرام ، من الأفضل استخدام مجهر إلكتروني ناقل حركة 300 كيلو فولت مع مرحلة تبريد مخصصة وفلتر طاقة وكاميرا مع كاشف إلكتروني مباشر ، ولكن يمكن أيضا استخدام أداة 200 كيلو فولت مع مرحلة التبريد ذات الدخول الجانبي وكاميرا CCD. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شبكة البكاء. اجمع سلسلة إمالة ، وأعد بناء مخطط الحرارة ، واحسب متوسط تومو فرعي.

هذه هي المهارات الأساسية المطلوبة للتحقيق في كيفية تأثير تنظيم البروتينات في الخلية على قدرة تلك الخلية على أداء الوظائف البيولوجية مثل تخليق A TP بكفاءة. لا تنس أن العمل مع النيتروجين السائل والسائل إيثان يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب ارتداء نظارات وقفازات السلامة في جميع الأوقات.