التصور من ATP سينسيز Dimers في الميتوكوندريا بواسطة الكترون البرد المقطعي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد بنية وتنظيم البروتينات الميتوكوندرية في C two. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إنشاء شبكة مجهر إلكتروني مائية مجمدة تحتوي على العينة. بعد ذلك، يتم تسجيل سلسلة إمالة محدودة الجرعة للعينة باستخدام مجهر إلكتروني مبرد.

بعد ذلك، تتم معالجة سلسلة الإمالة لإنشاء حجم توموغرافي. وأخيرًا، يتم حساب متوسط كثافات البروتين لتحديد بنية البروتينات، وتجزئة الأغشية للكشف عن بنيتها ثلاثية الأبعاد. ومن خلال إعادة وضع متوسطات البروتينات في صور Tom Grahams، يتضح هيكل وتنظيم البروتينات داخل الغشاء.

لذلك، نقوم بإجراء التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد للميتوكوندريا لأننا نريد فهم كيفية عملها على المستوى الجزيئي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل المجهر الإلكتروني للمقاطع البلاستيكية الرقيقة، في أن دقة التصوير تكون أعلى. كما أن المادة لا يتم تثبيتها كيميائياً بأي شكل من الأشكال، مما يحافظ على التفاصيل الجزيئية للبروتينات.

قد يستغرق إتقان تقنية التصوير المجهري الإلكتروني بالتبريد بعض الوقت، ولكن يمكن للمستخدمين ذوي الخبرة الحصول على خمس إلى ست شبكات TOM عالية الجودة في كل جلسة. ويتمثل الجزء الأكثر صعوبة في هذا الإجراء في إنتاج شبكات مائية مجمدة ذات سمك جليد مثالي. بعد عزل الميتوكوندريا وترسيبها وفقاً للبروتوكول النصي، استخدم 250 millimolar T trioses في 10 millimolar HEPA buffer لإعادة تعليق الراسب بتركيز يقارب 5 mg/mL من البروتين الكلي. قم بإجراء تفريغ توهجي لشبكات EM الكربونية بالكامل، بحيث يكون الجانب الكربوني للأعلى في جهاز تفريغ وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم قم بتسييل بضعة ملليلترات من الإيثان عن طريق توجيه تدفق من غاز الإيثان نحو الجانب الداخلي لحاوية ألومنيوم مبردة بالنيتروجين السائل.

استخدم ملقطاً لالتقاط شبكة DM التي خضعت للتفريغ المتوهج وضعها على طاولة العمل، ثم اخلط بروتينًا، وهو معلق علامة مرجعية ذهبية مقترنة، بنسبة واحد إلى واحد مع معلق الميتوكوندريا، وضع فوراً 3 µL من المحلول على الشبكة. بعد ذلك، ضع الملقط في جهاز تجميد زجاجي مثل المقصلة المصنعة منزلياً مع قطعة إسفينية من ورق الترشيح لتجفيف السائل الزائد من الشبكة، ثم حرر الزناد لغمر الشبكة فوراً في الإيثان الفليدي. ثم انقل الشبكة من الإيثان السائل إلى النيتروجين السائل.

قم بإزالة الإيثان الزائد من الشبكة عن طريق وضع طرف قطعة إسفينية من ورق ترشيح جديد في الإيثان السائل. ومع ارتفاع السائل، اسحب الشبكة برفق إلى أعلى ورق الترشيح، مع إبقائها تحت جبهة السائل، ثم انقلها فوراً إلى النيتروجين السائل لتخزينها لاستخدامها لاحقاً. ضع الشبكة في صندوق شبكات واحفظها في وعاء مملوء بالنيتروجين السائل لتسجيل سلسلة إمالة توموجرافية.

ابدأ بالتأكد من أن أوعية النيتروجين السائل ممتلئة، وتحقق من أن درجة حرارة منصة العينة وجهاز نقل الشبكة أقل من 100 kelvin. تأكد من ضبط محاذاة المجهر الإلكتروني جيداً عن طريق الحصول على صورة لشبكة اختبار والتحقق من جودة حلقات ثورن (thorn rings)؛ حيث يجب أن تكون الحلقات مستديرة وتمتد إلى حافة الصورة. بعد ذلك، أدخل شبكة تحتوي على ميتوكوندريا مجمدة ومرطبة.

بعد ذلك، وفي وضع البحث، ابحث عن مناطق ذات سمك جليدي مناسب وجودة عينات جيدة. التقط صورة بحث لمدة ست ثوانٍ للمناطق الواعدة لتحديد مدى ملاءمتها لجمع البيانات. وبعد تحديد منطقة عينات جيدة، قم بإمالة المنصة بمقدار 60 درجة زائد أو ناقص لتحديد أقصى نطاق إمالة متاح دون حدوث انسداد لمنطقة التعريض أو التركيز بواسطة قضبان الشبكة أو بلورات الجليد في ثقب مجاور مملوء بالجليد وذو مظهر مماثل، ثم انتقل إلى وضع التعريض واضبط شدة الحزمة أو وقت الحصول على الصورة.

وبالتالي، فإن كل صورة مسجلة لها جرعة إلكترونية تتراوح من 30 إلى 50 إلكتروناً لكل بكسل بالنسبة لأجهزة CCD، أو من ستة إلى ثمانية إلكترونات لكل بكسل في الثانية. وبالنسبة لكواشف الإلكترونات المباشرة، يتم حساب نسبة توزيع الجرعة أو I zero على I 60 عن طريق قسمة متوسط عدد الإلكترونات لصورة مدتها ثانية واحدة تم الحصول عليها عند صفر درجة على متوسط عدد الإلكترونات لصورة مدتها ثانية واحدة تم الحصول عليها عند 60 درجة فوق ثقب فارغ. قم بالتقاط صورة لمدة ثانية واحدة في وضع التعريض وسجل عدد الإلكترونات لكل angstrom squared.

مع مراعاة نسبة توزيع الجرعة، احسب العدد الإجمالي للصور وفاصل الإمالة الذي يمكن تسجيله لجرعة إلكترونية إجمالية محددة باستخدام برنامج مناسب لجمع البيانات تلقائياً. قم بإعداد وتسجيل مخطط مقطعي (Tomogram) بالمعايير التي تم تحديدها للعينات المقطعية النموذجية. بالنسبة لهذه العينات، ابدأ عند زائد أو ناقص 20 درجة ومر عبر درجة الصفر قبل الوصول إلى زوايا الإمالة العالية.

لإنشاء المقاطع التصويرية المقطعية (tomos) وتقسيمها، قم بتحويل سلسلة الإمالة إلى تنسيق ملف مناسب لبرنامج إعادة البناء. وباستخدام برنامج لإعادة بناء التوموغرافيا مثل Im mod، قم بمحاذاة الصور عن طريق تحديد موقع علامات الذهب المرجعية (gold fiducial markers). وبمجرد إتمام المحاذاة، قم بإنشاء Tommo Graham.

قم بتحسين تباين التصوير المقطعي (tomogram) باستخدام مرشح صور مثل مرشح الانتشار غير الخطي والمتناحي (non-linear an isotropic diffusion filter) الموزع مع برنامج IM od للتصور. استخدم برامج متاحة تجارياً لتقسيم الـ Tom يدوياً. قم بتعيين الفوكسلات (voxels) المقابلة للغشاء الداخلي والخارجي إلى طبقات منفصلة، وبمجرد تعيينها، أنشئ سطحاً لتصور الأغشية.

باستخدام خيار النقر (clicker) في ملحق حزمة EM لبرنامج emira، حدد موقع جسيمات TP syntase باستخدام الجسيمات المحددة كمدخلات وحزمة برمجية مناسبة مثل برنامج particle estimation. وبالنسبة لبرنامج التصوير المقطعي الإلكتروني (electron tomography)، احسب متوسط agram لتقدير الدقة. ثم احسب ارتباط foyer shell بين متوسطين فرعيين للتصوير المقطعي (sub tommo averages) تم تحديدهما بشكل مستقل باستخدام برنامج التصور المجاني.

تمت ملاءمة هياكل الأشعة السينية المعروفة في Chimera مع متوسط Tom Agram أولاً يدوياً، ثم تلقائياً باستخدام الأمر fit كما هو موضح في هذا الشكل، حيث يكشف التقسيم اليدوي للأغشية في تجميد إلكتروني للميتوكوندريا عن بنية الأعراف (Cristae) في الميتوكوندريا. ومن خلال تصوير الميتوكوندريا من سلالات الخميرة التي تم تعطيل جيناتها وتفتقر إلى بروتينات معينة، يمكن تقييم تأثير هذه البروتينات على مورفولوجيا الأعراف.

يظهر هنا ميتوكوندريا من سلالة خميرة تفتقر إلى الوحدة الفرعية E لإنزيم TP synthesis، وهي ضرورية لتكوين ثنائيات TP synthe. وبخلاف الأعراف (Cristi) الطبيعية الموجودة في الميتوكوندريا من النوع البري، تحتوي هذه العضيات بدلاً من ذلك على عدد من تراكيب الغشاء الداخلي التي إما أن تكون خالية من الأعراف أو تحتوي على انغمادات غشائية صغيرة تشبه البالون. وفي الصور ذات التباين الجيد، تظهر ثنائيات TP Synthes بوضوح كما تشير رؤوس السهام الصفراء هنا.

من خلال تقسيم الأغشية، يمكن الآن تصور موقع تخليق A TP، المتمثل في الكرة الصفراء، فيما يتعلق بمورفولوجيا Christi. في هذه الحالة، يشكل تخليق A TP صفوفاً من الثنائيات على طول الحواف شديدة الانحناء لـ Lo Meer Christi Sub tommo averaging، مما يسمح بتحديد تراكيب البروتينات بدقة تصل إلى أربعة نانومتر أو أفضل. ومن خلال ملاءمة تراكيب الأشعة السينية المعروفة في sub tomo Graham، يمكن تجميع نماذج ذرية متوسطة للمجمعات البروتينية في بيئتها الأصلية كما هو موضح.

في هذا المثال، يمكن إعادة وضع الأحجام المتوسطة في برنامج Tomo Graham للمساعدة في تنظيم المجمعات الفردية بالنسبة لبعضها البعض وبالنسبة لمجمعات بروتينية أخرى في الغشاء. يوضح البروتوكول الخاص بنا كيفية استخدام التصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد (electron cryo tomography) لتحديد بنية وتنظيم المجمعات البروتينية داخل الغشاء الميتوكوندري الداخلي. كما يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد بنية وتنظيم البروتينات الأخرى المرتبطة بالغشاء داخل المقصورات الخلوية المختلفة.

يعد تحضير العينة أمراً أساسياً للحصول على مخططات حرارية جيدة. يجب أن تحتوي الشبكة المائية المجمدة على ثقوب زجاجية تماماً يتراوح سمكها من 70 إلى 150 nanometer. عادةً ما نقوم بفحص خمس إلى ست شبكات حتى نجد منطقة ذات سمك جليدي وجودة عينة مثاليتين.

لجمع البيانات، يفضل استخدام مجهر إلكتروني نافذ بقدرة 300 kilovolt مزود بمنصة تبريد مخصصة ومرشح طاقة وكاميرا ذات كاشف إلكتروني مباشر، ولكن يمكن أيضاً استخدام جهاز بقدرة 200 kilovolt مزود بمنصة تبريد ذات إدخال جانبي وكاميرا CCD. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير شبكة cryo. قم بجمع سلسلة ميل، وإعادة بناء المخطط الحراري (thermogram)، وحساب متوسط sub tommo.

هذه هي المهارات الأساسية المطلوبة لاستقصاء كيفية تأثير تنظيم البروتينات في الخلية على قدرة تلك الخلية على أداء الوظائف البيولوجية، مثل التخليق الفعال لـ ATP. لا تنسَ أن العمل مع النيتروجين السائل والإيثان السائل يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب ارتداء نظارات السلامة والقفازات في جميع الأوقات.