نموذج نقص الأكسجين المجاعة لنقص التروية / ضخه في C. ايليجانس

الهدف العام من هذا الإجراء هو تقليد نقص تروية إعادة التروية في أناقة البحر. يتم تحقيق ذلك عن طريق نقل أناقة البحر إلى أنبوب دقيق وغسل البكتيريا. الخطوة الثانية هي خلق بيئة تعاني من نقص الأكسجين.

باستخدام غرفة نقص الأكسجين المصنوعة في المختبر ، تتعرض لنقص الأكسجين لمدة 20 ساعة ثم توضع في ظروف هوائية بعد 24 ساعة. الخطوة الأخيرة هي تسجيل النافقة وتسجيل استجابة اللمس. لوحظت التعديلات العصبية أيضا من خلال الفحص المجهري الفلوري.

في نهاية المطاف ، يتم استخدام تجويع نقص الأكسجين في أناقة البحر لخلق نفس الظروف التي شوهدت في نقص التروية ، والإصابة في حقيقيات النوى المتفوقة في نموذج جيني أسهل وأكثر مرونة ، ومزايا إدارة هذه التقنيات على طرق انقراض الاندماج المتكرر الإقفاري في الخلايا المعزولة للقلوب هي أن أناقة C هي نموذج وراثي قوي للغاية وهي أيضا وسيلة نقل. تسمح لك الكائنات الحية باستخدام العديد من السوائل والتقنيات المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، نوضح لك كيفية استخدام نقص الأكسجة أو غرفة بيئية باهظة الثمن لاستخدام مختبر نقص الأكسجة وغرفة بيئية ، سيكلف ذلك بضعة دولارات فقط.

بشكل عام ، يجب أن تكون الأخبار الفردية لهذه المسألة على دراية ببعض النقاط الرئيسية ، على سبيل المثال ، تطهير المخازن المؤقتة وتوخي الحذر الشديد في تسجيل الديدان وأيضا أن تكون ثابتا مع مقدار درجة الحرارة المستخدمة وكمية الأكسجين. كل هذه النقاط يمكن أن تغير نتيجة التجربة لإعداد غرفة مخصصة لنقص الأكسجين ، يمكن تعديل حاوية محكمة الإغلاق على شكل Tupperware كغرفة نقص الأكسجين. حدد أصغر حاوية ممكنة لأن الحاوية الصغيرة تخلق بيئة ناقصة الأكسجين بشكل أسرع ويسهل وضعها في الحمام المائي.

قم بعمل فتحتين في الغطاء بحجم استيعاب موصل بلاستيكي أو معدني يناسب الأنبوب بشكل آمن في مكانه مع الغراء الذي يمكن وضعه تحت الماء ويصبح صلبا أيضا بعد التجفيف ، وتجنب حركة الموصل وبالتالي تقليل احتمالية التسرب. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام غسالة النيوبرين للمساعدة في إغلاق الموصل بالحاوية. ضع الحاوية في الحمام المائي بحيث يتم غمرها بالكامل.

لغمر الحاوية. استخدم وزن الزجاجة أو وزن الغوص. سيتم استخدام أحد وصلات الأنبوب لإدخال خليط غاز وسيعمل الأنبوب الآخر كتخفيف للضغط.

لذلك ، يجب تركه تحت الماء حتى يتم إغلاق الحاوية عن البيئة الخارجية. لبدء نمو أناقة c كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد M تسعة عازلة وتطهير الأكسجين عن طريق التوازن مع النيتروجين قبل 30 دقيقة من التجربة والبقاء محاطا بالجليد. قم بعمل ثقب صغير في غطاء أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل حيث سيتم وضع الديدان أثناء تجويع نقص الأكسجين.

يسمح الثقب بتبادل الغازات دون إبقاء الغطاء مفتوحا ، مما قد يؤدي إلى تبخر الوسائط المفرط. أضف ملليلترا واحدا من درجة حرارة الغرفة المؤكسجة M تسعة عازلة إلى كل صفيحة مقاس 35 ملم تحتوي على ديدان شابة. احرص على تجنب إزالة البكتيريا من اللوحة.

بعد دقيقة واحدة تقريبا ، يجب أن تسبح الديدان في M تسعة. الطبقة التالية، طرف ماصة سعة مليلتر واحد مع ألبومين مصل الأبقار أو BSA عن طريق سحب العينات وطرد محلول BSA معقم بنسبة 1٪. قم بإمالة اللوحة التي تحتوي على الديدان بعناية في المخزن المؤقت M تسعة وإزالة M تسعة من نفس المكان الذي تمت إضافتها إليه.

ثم ضع التعليق في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعدة. دع العينات ترتاح في الجليد حتى تسقط الديدان في قاع الأنابيب. قم بإزالة الحد الأقصى لكمية M تسعة دون إزعاج الديدان من الأنبوب.

ثم أضف ملليلترا واحدا من الأكسجين المطهر والمثلج M تسعة ، وضع الأنبوب فوق الثلج حتى تستقر الديدان في القاع. مرة أخرى. كرر خطوة الغسيل هذه ثلاث مرات في الغسيل الأخير. قم بإزالة M تسعة حتى يبقى حوالي 100 ميكرولتر في الأنبوب.

بعد ذلك ، ضع الأنابيب مع الديدان في المخزن المؤقت M تسعة منزوعة الأكسجين في الغرفة وأغلق الغرفة باستخدام غاز الغطاء بتدفق نيتروجين ثابت يبلغ 100 مل في الدقيقة. ضع الوعاء داخل حمام مائي على حرارة 26 درجة مئوية. تأكد من أن أنبوب الخروج مغمور جيدا في الماء حتى لا يعود الهواء وعدم وجود تسرب في النظام.

استمر في احتضان الديدان عند 26 درجة مئوية لمدة 20 ساعة بعد حضانة ماصة البحر بأناقة مع طرف مطلي ب BSA على صفيحة وسائط نمو الديدان الخيطية مقاس 35 ملم. احتضان الألواح على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، ستكون الديدان جاهزة للتسجيل.

باستخدام معول بلاتيني ، المس برفق الجزء العلوي من رأس الدودة Live. سوف تتحرك الديدان للخلف بعد لمسها إذا كانت الديدان غير مستجيبة ، وتسجل على أنها ميتة. في بعض الأحيان ، لن تتحرك الدودة للخلف ، ولكنها قد تظهر حركة طفيفة من جانب إلى جانب ، على الرغم من أنها ليست ميتة من الناحية الفنية ، فمن شبه المؤكد أن تنتهي صلاحية هذه الديدان في غضون ساعات ويجب تسجيلها على أنها ميتة.

كرر هذه الخطوة من 10 إلى 15 مرة لكل دودة بفواصل زمنية عشر ثوان. قم بفحص ما لا يقل عن 10 ديدان في كل مجموعة للحصول على بيانات دقيقة لتصور ما بعد الجوع بعد نقص الأكسجين والتعديلات العصبية. استخدم سلالة تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر أو GFP في الخلايا العصبية الميكانيكية المستجيبة للمس.

ضع قطرة من محلول ARO بنسبة 2٪ على شريحة زجاجية تم وضعها بين شريحتين أخريين لهما قطعة واحدة من الشريط على جانبهما السفلي. ضع شريحة زجاجية نهائية عموديا على الشريحة الأولى فوق محلول 2٪ ARO واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة. يجب أن يشكل هذا وسادة بسمك الشريط.

ثم قم بإزالة الشريحة العلوية وأضف 10 ميكرولتر من M تسعة تحتوي على 0.1٪ tetra aloe ، مما يؤدي إلى شل حركة الديدان. انقل حوالي 10 ديدان حية على شريحة 2٪ aro وضع غطاء فوقها. تصور GFP باستخدام مجهر مضان تحت هدف 100 x مع الإضاءة المناسبة.

ستظهر الخلايا العصبية التالفة سلسلة غشاء العصارة الخلوية من نمط اللؤلؤ في العمليات التي تتكون من نقاط متعددة و / أو تشوهات حيث يبدو أن العمليات مكسورة. عد النقاط والتشوهات في كلتا الخليتين العصبيتين لكل دودة باستخدام ما مجموعه 10 ديدان على الأقل. أدى إخضاع أناقة البحر لمدة 20 ساعة من نقص الأكسجين والمجاعة عند 26 درجة مئوية في غرفة حضانة مخصصة في المختبر إلى وفيات كبيرة.

كما استجاب الناجون بشكل سيئ للمس جدار الجسم الخفيف. أكد التصوير الفلوري اللاحق للنقط والفواصل في العمليات العصبية المسماة GFP للناجين وجود تشوهات مورفولوجية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تعزيز نقص التروية.

أدت الملاحظة في المختبر إلى غرف نقص الأكسجين وأيضا يجب أن تكون قادرا على قياس الموت وكذلك التعديلات العصبية في أناقة سياتل. تم استخدام هذا النموذج من قبل مجموعات متعددة لدراسة كيف يمكن أن يؤثر الأيونات الطبيعية من الكثير من التدخلات والتمثيل الغذائي على ظروف نقص الأكسجين التي تكسب الحياة والموت.